Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela sociedade Max Planck e a clínica-Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemanha). Parte desta pesquisa foi publicado originalmente na revista de química biológica. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, s., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. O laço do AB e D-hélice no sítio de ligação III de humano Oncostatin M (OSM) são necessários para a ativação do receptor OSM. J. Biol Chem. 2018; 18:7017-7029. © os autores.

1. proteína quimérico Design
<ol><li>Selecione uma proteína adequada (doador) a troca de regiões com a proteína de interesse (destinatário), que a proteína do doador deve ser estruturalmente semelhante, idealmente pertencentes à mesma família da proteína, mas falta a atividade biológica a ser usada como leitura. Se sem proteínas estruturalmente relacionadas são conhecidas, os potenciais candidatos podem ser identificados usando uma ferramenta automatizada como o Vector alinhamento ferramenta de pesquisa (v...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. 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Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. 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H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

A geração de proteínas quiméricas constitui uma técnica versátil, que é capaz de ir além dos limites das proteínas truncadas para abordar questões como a modularidade do receptor de citocina-ligação domínios13. O projeto de quimeras é um passo fundamental neste tipo de estudos e requer cuidadosa consideração. Estudos preliminares para estabelecer domínios funcionais geralmente exigirá a substituição das grandes regiões, numa primeira fase, enquanto menores substituições de c...

Vários tipos de proteínas, incluindo citocinas e fatores de crescimento, são agrupados em famílias cujos membros compartilham semelhantes estruturas tridimensionais, mas muitas vezes exercem funções biológicas distintas1,2. Esta diversidade funcional costuma ser a consequência de pequenas diferenças na composição de aminoácidos dentro sites ativos3 da molécula. Identificação de tais sites e determinantes funcionais não só oferecem insights valiosos evolutivos mas também projetar mais específico agonistas e inibidores da4. No entanto, o grande número de diferenças na composição do resíduo frequentemente encontrado entre proteínas estruturalmente relacionadas complica essa tarefa. Mesmo que a construção de grandes bibliotecas contendo centenas de mutantes hoje em dia é viáveis, avaliando cada variação único resíduo e combinações deles continua a ser um esforço desafiante e demorado5.
Técnicas para avaliar a importância funcional das regiões grandes proteínas são, portanto, de valor para reduzir o número de resíduos possíveis para um número gerenciável6. Proteínas truncadas tem sido a abordagem mais utilizada para resolver este problema. Nesse sentido, as regiões são consideradas funcionalmente relevantes se a função da proteína em estudo é afectada pela exclusão de uma determinada região7,8,9. No entanto, uma grande limitação deste método é que as exclusões podem afetar a estrutura secundária da proteína, levando a enrolamento, agregação e a incapacidade para estudar a região pretendida. Um bom exemplo é uma versão truncada da citocina oncostatin M (OSM), no qual uma exclusão interna maior do que 7 resíduos resultaram em um mutante misfolded que não poderia ser mais estudou10.
A geração de proteínas quiméricas constitui uma abordagem alternativa e inovadora que permite a análise de regiões maiores da proteína. O objetivo desse método é a troca de regiões de interesse em uma proteína por sequências estruturalmente relacionadas em uma outra proteína, a fim de avaliar a contribuição das seções substituiu a funções biológicas específicas. Amplamente utilizado no campo da sinalização de receptores para identificar domínios funcionais11,12, proteínas quiméricas são particularmente úteis para estudar famílias da proteína com pouco aminoácido identidade mas conservada estrutura secundária. Adequadas exemplos podem ser encontrados na classe de interleucina-6 (IL-6) tipo citocinas, como interleucina-6 e ciliar neurotrophic factor (6% identidade de sequência)13 ou leucemia inibitório fator (LIF) e (20% de identidade) OSM6, em que o seguindo o protocolo é baseado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
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identification of functional protein regions through chimeric protein construction

O objetivo do presente protocolo abrange o design das proteínas quiméricas em que regiões distintas de uma proteína são substituídas por suas sequências correspondentes em uma proteína estruturalmente semelhante, a fim de determinar a importância funcional destas regiões. Tais quimeras são geradas através de um protocolo PCR aninhado usando a sobreposição de fragmentos de DNA e adequadamente projetado cartilhas, seguidas por sua expressão dentro de um sistema de mamíferos para garantir estrutura secundária nativa e modificações borne-translational.
O papel funcional de uma região distinta é então indicado por uma perda de atividade da Quimera, em um ensaio de leitura apropriado. Em consequência, são identificadas regiões abrigando um conjunto de aminoácidos essenciais, que pode ser ainda mais selecionados por técnicas complementares (por exemplo, mutagenesis local-dirigido) para aumentar a resolução molecular. Embora limitada a casos em que uma proteína estruturalmente relacionada com funções diferentes pode ser encontrada, proteínas quiméricas têm sido empregadas com sucesso para identificar as regiões críticas de ligação em proteínas tais como receptores de citocinas e citocinas. Este método é particularmente apropriado em casos em que as regiões funcionais da proteína não estão bem definidas e constitui um valioso primeiro passo na evolução dirigida abordagens para diminuir as regiões de interesse e reduzir o esforço de rastreio envolvido.

Construção e geração de uma proteína Quimérico (Figura 1) pode ser exemplificados com dois membros da família de citocinas interleucina-6, OSM e LIF, que foram objecto de um estudo recentemente publicado6. A Figura 2 mostra a estrutura tridimensional destas proteínas. Ambas as moléculas adotam a estrutura secundária característica de classe I, citocinas, com quatro hélices (denominados de À D)...

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Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Proteínas estruturalmente relacionadas frequentemente exercem funções biológicas distintas. A troca das regiões equivalentes destas proteínas a fim de criar proteínas quiméricas constitui uma abordagem inovadora para identificar regiões críticas da proteína que são responsáveis pela sua divergência funcional.

Identificação de regiões de proteína funcional através de construção de proteínas quiméricas

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

A troca de regiões de proteínas estruturalmente semelhantes para criar kimeras nos permite investigar a importância das regiões responsáveis pelas funções biológicas da molécula a serem estudadas. As trocas de região antecedem a estrutura secundária geral da proteína para que a estrutura geral dessa região possa ser distinguida daquelas funções biológicas mediadas diretamente. Pode estar se transformando em selecionar quais regiões exatas devem ser substituídas.Começar com trocas maiores geralmente é útil para identificar a funcionalidade-chave da proteína. Para iniciar o procedimento, selecione uma proteína adequada como doador para trocar regiões com a proteína de interesse conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, obtenha as sequências de aminoácidos proteicos do receptor e proteínas doadoras do banco de dados de sequência de referência acessando primeiro a seção genética na página web do ref seq.Digite o nome da proteína de interesse na caixa de pesquisa e clique em pesquisar. Clique no nome do gene para as espécies desejadas na lista resultante. Desça até a seção seq do ref para ver todas as isoformas documentadas.Clique no identificador de sequência para a isoforme de interesse. Role para baixo e clique em cds para destacar a região de codificação de proteínas do gene. Na parte inferior direita da tela, clique no FAFSDA e copie a sequência genética.Salve a sequência de DNA usando um software de edição de DNA adequado. Ao usar o APE disponível livremente, abra o programa, cole a sequência copiada na caixa em branco, selecione o nome da sequência e clique em salvar. Agora, escolha as regiões proteicas a serem substituídas nos diferentes construtos kiméricos, dividindo primeiro a sequência proteica de interesse em regiões estruturais distintas.Para isso, baixe os dados estruturais da proteína de interesse do site da PDBe. Acesse a página PDBe para a proteína e baixe o arquivo PDBe clicando em baixar no lado direito da tela. Abra o arquivo PDBe em um sistema de visualização molecular, como Pymol.Em Pymol, exiba a sequência de nucleotídeos, esconda os dados estruturais padrão e selecione a visão do desenho animado para visualizar claramente as características estruturais da proteína. Clique na sequência de nucleotídeos na parte superior da tela para destacar diferentes partes da molécula, observando os aminoácidos correspondentes a cada característica estrutural distinta. Agora, anote as distintas regiões estruturais na sequência de DNA em APE abrindo a sequência de DNA, selecionando-a e clicando em ORFs, em seguida, clique no último aminoácido da primeira região para destacar sua posição na sequência de DNA e selecionar a codificação do nucleotídeo para aquela região.Clique com o botão direito do mouse na seleção e selecione novo recurso para dar-lhe um nome e uma cor. Repita o processo para cada região estrutural identificada na etapa anterior. Para alinhar as sequências de resíduos das duas proteínas, primeiro, obtenha as sequências completas de aminoácidos de proteínas doadoras e receptoras em APE.Como antes, abra a sequência de DNA do doador, selecione-a e clique em ORFs traduzir. Em seguida, acesse a página da Ômega Clustal e, em seguida, coloque as sequências de aminoácidos das duas proteínas. Cada sequência deve ser procedida por uma linha de texto com nome de proteína a ser devidamente identificada.Role para baixo e clique em enviar. Recupere o arquivo de alinhamento clicando na guia de arquivo de alinhamento de download e salve-o. Este arquivo pode ser aberto por qualquer programa de edição de texto.Usando o arquivo de alinhamento como referência, anotar as regiões estruturais correspondentes da proteína doadora em sua sequência de DNA. Crie uma cópia da sequência de DNA anotada da proteína receptora e renomeie-a como uma proteína kimerica. Abra a sequência de DNA renomeada em APE.Selecione a região a ser trocada na proteína doadora e selecione a região correspondente na proteína receptora renomeada. Cole a sequência de DNA de proteína doadora, e depois salve as mudanças. Projete os primers terminais usando um editor de DNA como a APE.Crie um novo arquivo de DNA, inicie a cartilha final do terminal com uma sequência de líderes. Seguido pelo primeiro site de restrição selecionado nos vetores MCS e no espaçador opcional nos 18 a 27 pares base iniciais do gene de interesse. No novo arquivo de DNA, projete a sequência de primer do terminal C para começar com os pares finais de 18 a 27 pares base do gene de interesse seguido por um espaçador opcional, o segundo local de restrição escolhido e a sequência de líder.Destaque toda a sequência, clique com o botão direito do mouse e selecione o elogio reverso para obter a cartilha reversa. Agora, projete primers para cada uma das regiões fronteiriças nas construções kimeric. Na sequência de DNA da kimera, destaque uma região de 30 pares de bases na zona onde as sequências originais e inseridas estão em contato.Este é composto por 15 pares de base em cada sequência. Copie a região e cole-a em um novo arquivo de DNA. Esta sequência será a cartilha dianteira.Faça uma cópia do primer dianteiro gerado na etapa anterior e renomeie-o como o primer reverso. Destaque a sequência de primer, clique com o botão direito do mouse e selecione o elogio reverso para gerar a sequência de primer reversa. Repita estas etapas para cada zona de contato na sequência de DNA kimérico.Geralmente, dois conjuntos de primers invertidos dianteiros são necessários para gerar um kimera, a menos que a substituição ocorra nas regiões do terminal N ou terminal C. Prepare uma mistura individual de reação PCR para cada um dos fragmentos que compõem a proteína kimerica. Primeiro defina um tubo de microfuse de um ponto cinco mililiter no gelo e encorrea os diferentes reagentes das misturas PCR na ordem listada no protocolo de texto.Certifique-se de que os primers e modelos corretos são empregados para cada reação pcr. Rotule dois finos dois tubos DE PCR de paredes finas para cada reação e transfira 20 microliters da mistura PCR correspondente em cada tubo. Transfira os tubos PCR para um termociclador PCR e inicie o protocolo conforme detalhado no protocolo de texto.Depois que a reação do PCR for concluída, adicione quatro microliters de seis x tampão de carregamento de DNA em cada tubo. Insira o gel de 1% de agaross em uma unidade de eletroforese e cubra com tampão TAE. Carregue cuidadosamente as amostras no gel junto com um peso molecular.Depois de executar o gel a 80 a 120 volts por 20 a 45 minutos, desligue a unidade de eletroforese e remova o gel agoross. Visualize as bandas de DNA amplificadas sob luz UV. Usando uma lâmina de barbear, corte os fragmentos de DNA individuais do gel e transfira-os para dois tubos de microfuse mililiter.Depois de usar um kit de limpeza pcr para purificar os fragmentos de DNA, quantifique a quantidade de DNA recuperada medindo a absorção das amostras em 260 nanômetros e 340 nanômetros em um espectrômetro. Agora, realize a amplificação do PCR para gerar a sequência de DNA kimérico. Primeiro, configure 50 microliters de uma reação pcr para fundir os constituintes separados da kimera como antes.Empregue os primers do terminal N e C, juntamente com 10 nanogramas de cada um dos fragmentos de DNA amplificados. Recuperar e quantificar o fragmento de DNA purificado como antes, em 30 microliters de água livre do núcleo. Este fragmento contém a sequência de DNA kimérico ladeada pelos locais de restrição incluídos nos primers do terminal.A geração de uma proteína kimeric é exemplificada com dois membros da família Inter Luke e seis sytokine. Oncostaten M no fator inibidor da leucemia. O levantamento do OSM kimera resulta da troca da região do loop BC do OSM por uma sequência de elevação correspondente.A primeira etapa de amplificação do PCR consistiu em três reações separadas. O fragmento OSM do terminal N, que exigia os osm de terminal N e primers invertidos bc usou OSM como modelo. O loop LIF BC foi obtido através do bc start forward e bc n primers reversos usando LIF como modelo.O fragmento osm do terminal C utilizou primers reversos DOM final e C do terminal C, bem como os OSM como modelo. Esses fragmentos purificados foram então usados como modelo na segunda reação pcr, juntamente com os primers inversos OSM do terminal N e C-terminal para amplificar a sequência de genes de loop OSM LIF BC correspondente. Após a purificação e transformação em e-coli, os plasmídeos individuais foram isolados e rastreados pela digestão enzimápica de restrição para a inserção adequada do fragmento de DNA.A eletroforese gel revelou acertos positivos que foram enviados para verificação de sequência. Proteínas kimericas devem ser produzidas e a atividade medida em um perfeito sistema de facção. A fim de determinar a importância das regiões substituídas para essa facção em particular.Esta técnica tem sido muito útil e frequentemente aplicada, interferiu de receptores sinalizados a fim de identificar domínios de funções-chave e locais de reconhecimento de receptores. O número que uso para eletroforese de DNA deve ser manipulado usando luvas descartáveis, um casaco de laboratório e óculos de proteção.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bioquímica

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial