Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Эта работа была поддержана Общество Макса Планка и Schüchtermann-клиника (Бад-Ротенфельде, Германия). Часть этого исследования была опубликована в журнал биологической химии. Адриан Сегарра, ж. м., Шиндлер, н., Gajawada, P., Lörchner, ч., Браун, т. & Pöling, Дж. Цикл AB и D-спирали в привязки сайта III М человеческого Oncostatin (OSM) для активации рецептора OSM. J. Chem. биол. 2018; 18:7017-7029. © Авторы.

1. химерных белка дизайн
<ol><li>Выберите подходящий белка (донор) для обмена регионов с протеина интереса (получателя) доноров белка должно быть структурно похожи, идеально принадлежащих к той же семье белков, но не хватает биологической активности использоваться как индикация. Если не с?...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

Поколение химерных белков представляет универсальный метод, который может выйти за пределы усеченным белков на вопросы как модульность cytokine рецептор связывания доменов13. Дизайн химерами является ключевым шагом в такого рода исследований и требует тщательного рассмотре?...

Несколько видов белков, в том числе цитокинов и факторы роста, группируются в семьях, члены которых разделяют подобные трехмерной структуры, но часто оказывают различные биологические функции1,2. Это функциональное разнообразие обычно является следствием небольшие различия в аминокислотный состав внутри молекулы активных сайтов3. Выявление таких участков и функциональных детерминанты не только предлагают ценную эволюционной но также для разработки более конкретных агонисты и ингибиторы4. Однако большое количество различий в составе остатков, часто встречаются между структурно похожие белки усложняет эту задачу. Даже несмотря на то, что строительство большой библиотеки, содержащие сотни мутантов в настоящее время это возможно, оценки каждый один остаток вариации и комбинации из них по-прежнему остается сложным и отнимает много времени усилий5.
Методы оценки функциональной значимости регионов больших белка, таким образом, значение для уменьшения числа возможных остатков к управляемым число6. Усеченные белки были наиболее часто используемых подход к решению этой проблемы. Соответственно регионы считаются функционально актуальны, если функцию белка под исследования зависит от удаления конкретного региона7,8,9. Однако главным недостатком этого метода является, что удаления может повлиять на вторичную структуру белка, приводит к сворачиванию, агрегации и невозможность для изучения предполагаемого региона. Хорошим примером является усеченная версия цитокина oncostatin M (OSM), в котором внутреннего исключения, больше, чем 7 остатков привело к смятых мутантов, которые не могут быть в дальнейшем учился10.
Поколение химерных белков является альтернативной и новаторский подход, который позволяет анализ крупных областей белка. Цель данного метода является обмен регионы интереса в протеине, структурно связанных последовательностей в другой белок, чтобы оценить вклад замененных разделов для конкретных биологических функций. Широко используется в области сигнализации приемные устройства для определения функциональных областях11,12, химерных белки являются особенно полезными для изучения белков семей с мало аминокислоты личность, но сохраняется вторичной структуры. Соответствующие примеры можно найти в классе, интерлейкина-6 (IL-6) типа цитокинов, таких как интерлейкина-6 и цилиарной нейротрофических факторов (6% последовательности идентификаторов)13 или лейкемия ингибирующего фактор (LIF) и OSM (20% удостоверение)6, на котором основан после протокола.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Цель настоящего протокола включает в себя дизайн химерных белков, в которых отдельных регионах белка заменяются их соответствующих последовательностей в структурно аналогичных белка, с целью определения функциональной значимости этих регионов. Такие химер генерируются с помощью вложенных протокол постановки ПЦР с использованием перекрывающихся фрагментов ДНК и адекватно разработан грунтовки, а затем их выражение в рамках млекопитающих системы для обеспечения родной вторичной структуры и столб-поступательные изменения.
Функциональная роль различных региона обозначается затем потеря активности Химера в assay соответствующей индикации. В следствие определены регионы, укрывательство набор важнейших аминокислот, который может далее экранируется дополнительных методов (например , сайт Направленный мутагенез) для увеличения молекулярного разрешения. Хотя ограничиваться случаями, в которых можно найти структурно связанные белком с различными функциями, химерных белки с успехом используются для выявления критических привязки регионов в белках, таких как цитокинов и цитокина рецепторов. Этот метод особенно подходит в тех случаях, в которых белка функциональных регионов не будут четко определены и представляет собой ценный первый шаг в направленной эволюции подходов к сузить области интереса и уменьшить затраты скрининга.

С двумя членами семьи интерлейкина-6 цитокина, OSM и LIF, которые были предметом недавно опубликованное исследование6будет примером строительства и создания химерных белка (рис. 1). Рисунок 2 показывает трехмерную структуру эти...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Структурно похожие белки часто оказывают различные биологические функции. Обмена эквивалентной регионов этих белков с целью создания химерных белки представляет собой новаторский подход для выявления критических белков регионов, которые отвечают за их функциональных различий.

Определение функциональных белков регионов путем строительства химерных белка

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Обмен регионами структурно похожих белков для создания кимер позволяет исследовать важность регионов, ответственных за биологические функции молекулы, которые будут изучены. Регион обменов predoff общей вторичной структуры белка, так что регион важно для его общей структуры можно отличить от тех, непосредственно посредничество биологических функций. Он может превратиться в выбранный, какие именно регионы должны быть заменены.Начиная с больших обменов, как правило, полезно определить ключевую функциональность белка. Чтобы начать процедуру, выберите подходящий белок в качестве донора для обмена регионами с интересом белка, как описано в текстовом протоколе. Затем получите белковые аминокислотные последовательности реципиента и донорских белков из базы данных эталонной последовательности, сначала получить доступ к разделу генов на веб-странице ref seq.Ввените название белка, представляющих интерес в поле поиска и нажмите поиска. Нажмите на название гена для желаемого вида в результирующем списке. Прокрутите вниз к разделу ref seq, чтобы увидеть все документированные изоформы.Нажмите на идентификатор последовательности для изоформы интереса. Прокрутите вниз и нажмите на компакт-диски, чтобы выделить область кодирования белка гена. В правом нижнем углу экрана нажмите на FAFSDA и скопировать генную последовательность.Сохраните последовательность ДНК с помощью подходящего программного обеспечения для редактирования ДНК. При использовании свободно доступного APE откройте программу, вставьте скопированную последовательность в пустой ящик, выберите имя последовательности и нажмите сохранить. Теперь выберите белковые области, которые будут заменены в различных кимерических конструкциях, сначала разделив белковую последовательность интересов в различных структурных регионах.Для этого загрузите структурные данные о заинтересованности белка с веб-сайта PDBe. Доступ к странице PDBe для белка и скачать файл PDBe, нажав скачать на правой стороне экрана. Откройте файл PDBe в молекулярной системе визуализации, как Pymol.В Pymol отобразить нуклеотидную последовательность, скрыть структурные данные по умолчанию и выбрать вид мультфильма, чтобы четко визуализировать структурные особенности белка. Нажмите на нуклеотидную последовательность в верхней части экрана, чтобы выделить различные части молекулы, упомяая аминокислоты, соответствующие каждой отличительной структурной особенности. Теперь аннотировать различные структурные области на последовательности ДНК в APE, открыв последовательность ДНК, выбрав его, и нажав ORFs перевести, а затем нажмите на последнюю аминокислоту первой области, чтобы подчеркнуть свое положение в последовательности ДНК и выбрать нуклеотид кодирования для этой области.Нажмите правой кнопкой мыши на выбор и выберите новую функцию, чтобы придать ему имя и цвет. Повторите процесс для каждого структурного региона, выявленный на предыдущем этапе. Чтобы выровнять последовательности остатков двух белков, во-первых, получить полную аминокислоту последовательности доноров и рецепторов белков в APE.Как и прежде, откройте последовательность ДНК донора, выберите ее и нажмите ORFs перевод. Затем, доступ к веб-странице Clustal Omega, а затем положить аминокислоты последовательности двух белков. Каждая последовательность должна быть продолжена текстовой строкой с именем белка, которое должно быть правильно идентифицировано.Прокрутите вниз и нажмите отправить. Извлеките файл выравнивания, нажав на вкладку файла выравнивания загрузки и сохраните его. Этот файл может быть открыт любой программой редактирования текста.Используя файл выравнивания в качестве эталона, аннотировать соответствующие структурные области донорского белка в их последовательности ДНК. Создайте копию аннотированной последовательности ДНК рецепторного белка и переименуйте его в кимерический белок. Откройте переименованную последовательность ДНК в APE.Выберите область для обмена в донорском белке, а затем выберите соответствующую область в переименованном рецепторном белке. Вставьте донорский белок последовательности ДНК, а затем сохранить изменения. Дизайн терминальных праймеров с использованием редактора ДНК, таких как APE.Создайте новый файл ДНК, инициировать конец терминала грунтовка с лидером последовательности. Затем первый сайт ограничения, выбранный в векторах MCS, и дополнительный промеец в начальных 18-27 базовых парах гена интереса. В новом файле ДНК, дизайн C терминала грунтовка последовательности, чтобы начать с окончательными 18 до 27 базовых пар гена интереса следуют дополнительный спейсер, второй сайт ограничения выбран, и последовательность лидеров.Выделите всю последовательность, правый щелчок, и выберите обратный комплимент, чтобы получить обратный грунтовка. Теперь, дизайн грунтовки для каждого из пограничных районов в кимерических конструкций. В последовательности ДНК кимеры выделите область 30 базовых пар в зоне контакта исходных и вставленных последовательностей.Это состоит из 15 базовых пар в каждой последовательности. Скопируйте область и вставьте ее в новый файл ДНК. Эта последовательность будет вперед грунтовка.Сделайте копию перемотка вперед, сгенерированную на предыдущем этапе, и переименуйте ее в обратную грунтовку. Выделите последовательность грунтовок, нажмите правой кнопкой мыши и выберите обратный комплимент для создания обратной последовательности грунтовок. Повторите эти шаги для каждой контактной зоны в последовательности кимерической ДНК.Как правило, для генерации одной кимеры требуется два набора форвардных реверсных грунтовок, если только замена не происходит в терминалах N или C. Подготовьте индивидуальную смесь реакции ПЦР для каждого из фрагментов, сочиняющих кимерический белок. Сначала установите одну точку пятимилаторной микрофузной трубки на льду и заведите различные реагенты смесей ПЦР в порядке, перечисленном в текстовом протоколе.Убедитесь, что для каждой реакции ПЦР используются правильные грунтовки и шаблоны. Этикетка две тонкие стеной нулевой точки два миллиметра ПЦР труб для каждой реакции и передачи 20 микролитров соответствующей смеси ПЦР в каждой трубке. Перенесите трубки ПЦР в термоциклер ПЦР и инициатор протокола, как описано в текстовом протоколе.После завершения реакции ПЦР добавьте в каждую трубку четыре микролитров буфера загрузки ДНК по шесть х. Вставьте один процент агаросс гель в блок электрофорез и крышка с буфером TAE. Тщательно загрузите образцы в гель вместе с молекулярным весом последнего.После запуска геля на 80 до 120 вольт в течение 20 до 45 минут, выключите блок электрофорез и удалить агоросс гель. Визуализуя усиленные полосы ДНК под ультрафиолетовым светом. Используя лезвие бритвы, вырежьте отдельные фрагменты ДНК из геля и перенесите их в помеченные две миллилтерные микрофузыки.После использования комплекта очистки ПЦР для очистки фрагментов ДНК, количественно количество ДНК восстановлено путем измерения поглощения образцов на 260 нанометров и 340 нанометров в спектрофетометре. Теперь выполните усиление ПЦР для генерации последовательности кимерической ДНК. Во-первых, настроить 50 микролитров реакции ПЦР, чтобы сплавить отдельные компоненты кимеры, как и раньше.Найди праймеры терминала N и C вместе с 10 нанограммами каждого из усиленных фрагментов ДНК. Восстановление и количественная оценка очищенного фрагмента ДНК, как и прежде, в 30 микролитров ядра свободной воды. Этот фрагмент содержит кимерическую последовательность ДНК, окруженную местами ограничения, включенными в праймеры терминала.Поколение кимерического белка является примером с двумя членами меж лук и шесть семейство ситокин. Онкостейн М при ингибиторном факторе лейкемии. OSM лифт кимера результаты обмена до н.э. цикл области OSM с соответствующей последовательности подъема.Первый этап усиления ПЦР состоял из трех отдельных реакций. N-терминал OSM фрагмент, который требует N-терминал OSM вперед и до н.э. начать обратный грунтовки использовали OSM в качестве шаблона. Цикл LIF BC был получен через BC start forward и BC N обратные грунтовки с использованием LIF в качестве шаблона.Фрагмент C-терминала OSM использовал в качестве шаблона конечные вперед и C-терминал OSM реверсивные грунтовки, а также OSM. Эти очищенные фрагменты затем были использованы в качестве шаблона во второй реакции ПЦР вместе с N-терминальной OSM вперед и C-терминал OSM обратные грунтовки для усиления соответствующей последовательности гена osM LIF BC цикла. После очистки и превращения в электронную палочку, отдельные плазмиды были изолированы и проверены путем ограничения пищеварения фермента для правильной вставки фрагмента ДНК.Гель электрофорез показал положительные хиты, которые затем были отправлены для проверки последовательности. Кимерические белки должны быть произведены и активность измеряется в идеальной системы фракционности. Для определения важности замененных регионов для этой конкретной фракции.Этот метод был очень полезным и часто применяется, вмешался сигнальных рецепторов для того, чтобы определить ключевые области функции и сайты распознавания рецепторов. Номер, который я использую для электрофореза ДНК, должен обрабатываться с помощью одноразовых перчаток, лабораторного пальто и защитных очков.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...