Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck y la clínica Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemania). Parte de esta investigación fue publicado originalmente en el Journal of Biological Chemistry. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. El lazo del AB y D-hélice en sitio obligatorio III de humano Oncostatina M (OSM) se requieren para la activación del receptor OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © los autores.

1. diseño de proteínas quimérico
<ol><li>Seleccione una proteína adecuada (donante) para el intercambio de regiones con la proteína de interés (destinatario) la proteína del donante debe ser estructuralmente similar, idealmente pertenecientes a la misma familia de proteínas, pero falta la actividad biológica para ser utilizado como lectura. Si no se conocen proteínas estructuralmente relacionadas, candidatos potenciales pueden ser identificados mediante una herramienta automatizada como la herramienta de bús...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. 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Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. 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La generación de proteínas quiméricas constituye una técnica versátil, que puede ir más allá de los límites de proteínas truncadas a abordar cuestiones tales como la modularidad del receptor del cytokine enlace dominios13. El diseño de quimeras es un paso clave en este tipo de estudios y requiere una cuidadosa consideración. Estudios preliminares para establecer dominios funcionales generalmente requiere sustitución de amplias regiones en una primera fase, mientras que los reemplazos m...

Varios tipos de proteínas, incluyendo citoquinas y factores de crecimiento, se agrupan en familias cuyos miembros comparten estructuras tridimensionales similares pero a menudo ejercen distintas funciones biológicas1,2. Esta diversidad funcional suele ser la consecuencia de pequeñas diferencias en la composición de aminoácidos dentro de sitios activos3 de la molécula. Identificación de dichos sitios y determinantes funcionales no sólo ofrece valiosa información evolutiva sino también para el diseño de los agonistas e inhibidores más específicos4. Sin embargo, el gran número de diferencias en la composición del residuo encontrado con frecuencia entre proteínas estructuralmente relacionadas complica esta tarea. A pesar de construir grandes bibliotecas que contienen cientos de mutantes hoy en día es factibles, evaluar cada variación de solo residuos y combinaciones de ellos sigue siendo un esfuerzo difícil y desperdiciador de tiempo5.
Técnicas de evaluación de la importancia funcional de las regiones de la proteína grande son así de valor para reducir el número de posibles residuos a un número manejable6. Proteínas truncadas han sido el enfoque más utilizado para abordar este asunto. En consecuencia, las regiones se consideran funcionalmente relevante si la función de la proteína bajo estudio es afectada por la eliminación de una región particular7,8,9. Sin embargo, una limitación importante de este método es que deleciones pueden afectar a la estructura secundaria de la proteína, llevando a mal plegamiento, la agregación y la imposibilidad de estudiar la región prevista. Un buen ejemplo es una versión truncada de la citoquina Oncostatina M (OSM), en el que una canceladura interna más grande de 7 residuos dio lugar a un mutante mal plegado que no podía ser más había estudiado10.
La generación de proteínas quiméricas constituye un enfoque alternativo e innovador que permite el análisis de regiones más grandes de proteína. El objetivo de este método es para el intercambio de regiones de interés en una proteína por secuencias estructuralmente relacionadas de otra proteína, con el fin de evaluar la contribución de las secciones sustituyó a funciones biológicas específicas. Ampliamente utilizado en el campo de la señalización de receptores para identificar dominios funcionales11,12, proteínas quiméricas son particularmente útiles para el estudio de familias de proteínas con poca identidad del aminoácido pero conservada estructura secundaria. Apropiado pueden encontrarse ejemplos en la clase de interleucina 6 (IL-6) tipo citoquinas, tales como interleukin-6 y ciliary neurotrophic factor (identidad de secuencia de 6%)13 o leucemia factor inhibitorio (LIF) y OSM (20% identidad)6, en la que el siguiendo el protocolo se basa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
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identification of functional protein regions through chimeric protein construction

El objetivo de este protocolo comprende el diseño de proteínas quiméricas en la que distintas regiones de una proteína son sustituidas por sus correspondientes secuencias de una proteína estructural similar, con el fin de determinar la importancia funcional de estas regiones. Tales quimeras se generan mediante un protocolo PCR anidado utilizando fragmentos de DNA traslapados y adecuadamente diseñado cartillas, seguidos de su expresión dentro de un sistema mamífero nativo estructura secundaria y modificaciones post-traduccionales.
El papel funcional de una región distinta entonces indica una pérdida de actividad de la quimera en un ensayo de lectura apropiado. En consecuencia, se identifican las regiones albergando un conjunto de aminoácidos esenciales, que pueden ser defendidos por técnicas complementarias (por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida) para aumentar la resolución molecular. Aunque limitada a los casos en que se encuentra una proteína estructuralmente relacionada con diferentes funciones, las proteínas quiméricas han sido empleadas con éxito para identificar las regiones de Unión críticos en proteínas como receptores de citoquinas y citoquinas. Este método está especialmente indicado en casos en que las regiones funcionales de la proteína no están bien definidas y constituye un valioso primer paso en enfoques de evolución dirigida a reducir las regiones de interés y reducir el esfuerzo de investigación involucrado.

Construcción y la generación de una proteína quimérica (figura 1) se ejemplifica con dos miembros de la familia del cytokine interleukin-6, OSM y LIF, que fueron objeto de un estudio publicado recientemente6. La figura 2 muestra la estructura tridimensional de estas proteínas. Ambas moléculas adoptan la estructura secundaria característica de clase que citoquinas, con cuatro hélices (llamados A D) ...

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Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Proteínas estructuralmente relacionadas con frecuencia ejercen distintas funciones biológicas. El intercambio de equivalentes regiones de estas proteínas para crear proteínas quiméricas constituye un enfoque innovador para identificar las regiones de la proteína crítica que son responsables de su divergencia funcional.

Identificación de regiones de la proteína funcional a través de la construcción de la proteína quimérica

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

El intercambio de regiones de proteínas estructuralmente similares para crear kimeras nos permite investigar la importancia de las regiones responsables de las funciones biológicas de la molécula a estudiar. La región intercambia la estructura secundaria general de la proteína para que la región sea importante para su estructura general se pueda distinguir de las que median directamente las funciones biológicas. Se puede convertir en seleccionar qué regiones exactas se reemplazarán.Comenzar con intercambios más grandes suele ser útil para identificar la funcionalidad clave de la proteína. Para comenzar el procedimiento, seleccione una proteína adecuada como donante para intercambiar regiones con la proteína de interés como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, obtenga las secuencias de aminoácidos proteicos del receptor y de las proteínas del donante de la base de datos de secuencias de referencia accediendo primero a la sección de genes en la página web ref seq.Escriba el nombre de la proteína de interés en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar. Haga clic en el nombre del gen de la especie deseada en la lista resultante. Desplácese hacia abajo hasta la sección ref seq para ver todas las isoformas documentadas.Haga clic en el identificador de secuencia para la isoforma de interés. Desplácese hacia abajo y haga clic en cds para resaltar la región de codificación de proteínas del gen. En la parte inferior derecha de la pantalla, haga clic en FAFSDA y copie la secuencia genética.Guarde la secuencia de ADN utilizando un software de edición de ADN adecuado. Cuando utilice el APE libremente disponible, abra el programa, pegue la secuencia copiada en el cuadro en blanco, seleccione el nombre de la secuencia y haga clic en Guardar. Ahora, elija las regiones proteicas que se sustituirán en las diferentes construcciones kimericas dividiendo primero la secuencia proteica de interés en distintas regiones estructurales.Para ello, descargue los datos estructurales de la proteína de interés desde el sitio web de PDBe. Acceda a la página PDBe de la proteína y descargue el archivo PDBe haciendo clic en descargar en el lado derecho de la pantalla. Abra el archivo PDBe en un sistema de visualización molecular, como Pymol.En Pymol, muestre la secuencia de nucleótidos, oculte los datos estructurales predeterminados y seleccione la vista de dibujos animados para visualizar claramente las características estructurales de la proteína. Haga clic en la secuencia de nucleótidos en la parte superior de la pantalla para resaltar diferentes partes de la molécula, observando los aminoácidos correspondientes a cada característica estructural distintiva. Ahora, anote las distintas regiones estructurales en la secuencia de ADN en APE abriendo la secuencia de ADN, seleccionándola y haciendo clic en ORF translate, luego haga clic en el último aminoácido de la primera región para resaltar su posición en la secuencia de ADN y seleccionar la codificación del nucleótido para esa región.Haga clic con el botón derecho en la selección y seleccione una nueva función para darle un nombre y un color. Repita el proceso para cada región estructural identificada en el paso anterior. Para alinear las secuencias de residuos de las dos proteínas, primero, obtener las secuencias completas de aminoácidos de las proteínas donantes y receptoras en APE.Como antes, abra la secuencia de ADN del donante, selecciónela y haga clic en ORF translate. Luego, acceda a la página web de Clustal Omega y luego coloque las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas. Cada secuencia debe proceder por una línea de texto con el nombre de la proteína para ser identificada correctamente.Desplázate hacia abajo y haz clic en Enviar. Recupere el archivo de alineación haciendo clic en la pestaña del archivo de alineación de descarga y guárdelo. Este archivo puede ser abierto por cualquier programa de edición de texto.Utilizando el archivo de alineación como referencia, anote las regiones estructurales correspondientes de la proteína donante en su secuencia de ADN. Cree una copia de la secuencia de ADN anotada de la proteína receptora y cámbiele el nombre a una proteína kimerica. Abra la secuencia de ADN renombrada en APE.Seleccione la región que se va a intercambiar en la proteína del donante y, a continuación, seleccione la región correspondiente en la proteína receptora renombrada. Pegue la secuencia de ADN de la proteína del donante y luego guarde los cambios. Diseñe las imprimaciones de terminal utilizando un editor de ADN como APE.Cree un nuevo archivo de ADN, inicie la imprimación de terminal final con una secuencia de directriz. Seguido por el primer sitio de restricción seleccionado en los vectores MCS y el espaciador opcional en los 18 a 27 pares base iniciales del gen de interés. En el nuevo archivo dna, diseñe la secuencia de imprimación de terminal C para comenzar con los 18 a 27 pares base finales del gen de interés seguido de un espaciador opcional, el segundo sitio de restricción elegido y la secuencia de directriz.Resalte toda la secuencia, haga clic con el botón derecho y seleccione el cumplido inverso para obtener la imprimación inversa. Ahora, diseñe imprimaciones para cada una de las regiones fronterizas en las construcciones kimericas. En la secuencia de ADN de la kimera, resalte una región de 30 pares base en la zona donde las secuencias originales e insertadas están en contacto.Se compone de 15 pares base en cada secuencia. Copie la región y péguela en un nuevo archivo de ADN. Esta secuencia será la imprimación delantera.Haga una copia de la imprimación de avance generada en el paso anterior y cámbiele el nombre como imprimación inversa. Resalte la secuencia de imprimación, haga clic con el botón derecho y seleccione complementar al revés para generar la secuencia de imprimación inversa. Repita estos pasos para cada zona de contacto en la secuencia de ADN kimerico.Generalmente, se requieren dos conjuntos de imprimaciones inversas hacia adelante para generar una kimera, a menos que el reemplazo se produzca en las regiones del terminal N o C. Preparar una mezcla de reacción PCR individual para cada uno de los fragmentos que componen la proteína kimerica. En primer lugar, establezca un tubo de microfusión de un punto cinco mililitros sobre hielo y pipetee los diferentes reactivos de las mezclas de PCR en el orden indicado en el protocolo de texto.Asegúrese de que se emplean las imprimaciones y plantillas correctas para cada reacción de PCR. Etiquete dos tubos PCR de punto cero de pared delgada dos mililitros para cada reacción y transfiera 20 microlitros de la mezcla de PCR correspondiente en cada tubo. Transfiera los tubos PCR a un termociclador PCR e inicie el protocolo como se detalla en el protocolo de texto.Una vez completada la reacción pcR, añada cuatro microlitros de seis x tampón de carga de ADN en cada tubo. Inserte el gel de agaross del uno por ciento en una unidad de electroforesis y cúbralo con tampón TAE. Cargue cuidadosamente las muestras en el gel junto con un peso molecular.Después de ejecutar el gel a 80 a 120 voltios durante 20 a 45 minutos, apague la unidad de electroforesis y retire el gel de agoross. Visualice las bandas de ADN amplificadas bajo la luz UV. Usando una cuchilla de afeitar, corte los fragmentos de ADN individuales del gel y transfieralos a dos tubos de microfusión mililitros etiquetados.Después de utilizar un kit de limpieza de PCR para purificar los fragmentos de ADN, cuantifique la cantidad de ADN recuperado midiendo la absorbancia de las muestras a 260 nanómetros y 340 nanómetros en un espectrofetómetro. Ahora, realice la amplificación de PCR para generar la secuencia de ADN kimerico. En primer lugar, configure 50 microlitros de una reacción PCR para fusionar los componentes separados de la kimera como antes.Emplear las imprimaciones terminales N y C junto con 10 nanogramos de cada uno de los fragmentos de ADN amplificados. Recuperar y cuantificar el fragmento de ADN purificado como antes, en 30 microlitros de agua libre de núcleo. Este fragmento contiene la secuencia de ADN kimerico flanqueada por los sitios de restricción incluidos en las imprimaciones terminales.La generación de una proteína kimerica se ejemplifica con dos miembros de la familia inter luke y seis de sitokina. Oncostaten M en factor inhibidor de la leucemia. La kimera de elevación OSM resulta del intercambio de la región de bucle BC de OSM con una secuencia de elevación correspondiente.El primer paso de amplificación de PCR consistió en tres reacciones separadas. El fragmento de OSM de terminal N, que requería imprimaciones inversas de inicio N-terminal OSM hacia adelante y BC utilizaban OSM como plantilla. El bucle LIF BC se obtuvo a través de BC start forward y BC N reverse primers usando LIF como plantilla.El fragmento C-terminal OSM utilizó las imprimaciones inversas OSM del terminal BC y del terminal C así como del OSM como la plantilla. Estos fragmentos purificados se utilizaron entonces como plantilla en la segunda reacción PCR junto con los imprimadores inversos OSM de terminal N hacia adelante y OSM terminales C para amplificar la secuencia de genes de bucle BC OSM LIF correspondiente. Después de la purificación y transformación en e-coli, los plásmidos individuales fueron aislados y examinados por la digestión enzimática de restricción para la inserción adecuada del fragmento de ADN.La electroforesis de gel reveló impactos positivos que luego fueron enviados para la verificación de la secuencia. Las proteínas kimericas tienen que ser producidas y la actividad medida en un sistema de faccionalidad perfecto. Con el fin de determinar la importancia de las regiones reemplazadas para esa facción en particular.Esta técnica ha sido muy útil y aplicada con frecuencia, interferido de los receptores de señal con el fin de identificar los dominios de función clave y los sitios de reconocimiento de receptores. El número que utilizo para la electroforesis de ADN debe manejarse mediante el uso de guantes desechables, un abrigo de laboratorio y gafas protectoras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Investigación

Bioquímica

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio