Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet och Schüchtermann-kliniken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB öglan och D-helix i bindningsställe III av mänskliga Oncostatin M (OSM) krävs för OSM receptor aktiveringen. J. Biol. Chem. 2018. 18:7017-7029. © författarna.

1. chimära Protein Design
<ol><li>Välj en lämplig protein (givare) att utbyta regioner med proteinet av intresse (mottagaren) proteinet givare bör vara strukturellt liknande, helst tillhörande proteinfamiljen samma, men saknar den biologiska aktiviteten för att användas som avläsning. Om inga strukturellt relaterade proteiner är kända, kan potentiella kandidater identifieras med hjälp av ett automatiserat verktyg som den vektor Alignment Search Tool (VAST)14,<sup class="xre...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

Generering av chimära proteiner utgör en mångsidig teknik, vilket kan gå bortom gränserna för trunkerade proteiner att hantera frågor såsom Modulariteten av cytokin-receptor bindande domäner13. Utformningen av chimärer är ett viktigt steg i denna typ av studier och kräver noggrant övervägande. Preliminära studier för att fastställa funktionella domäner kräver generellt substitution av breda regioner i en första fas, medan mindre ersättare av variabla längder är mer lämpade ...

Flera typer av proteiner, inklusive cytokiner och tillväxtfaktorer, grupperas i familjer vars medlemmar delar liknande tredimensionella strukturer men ofta utöva olika biologiska funktioner1,2. Denna funktionella mångfald är oftast en följd av små skillnader i aminosyra sammansättning inom molekylens aktiva platser3. Identifiering av sådana platser och funktionella bestämningsfaktorer inte bara erbjuder evolutionära insikter utan också att utforma mer specifika agonister och hämmare4. Det stora antalet skillnader i rester sammansättning ofta hittas mellan strukturellt relaterade proteiner komplicerar dock denna uppgift. Även om att konstruera stora bibliotek som innehåller hundratals mutanter är numera möjligt, bedöma varje enskild rester variation och kombinationer av dem fortfarande är en utmanande och tidskrävande insats5.
Tekniker att bedöma funktionella betydelsen av stora protein regioner är således av värde för att minska antalet möjliga rester till en hanterbar nummer6. Trunkerade proteiner har varit den mest använda metoden att tackla denna fråga. Följaktligen är regioner anses vara funktionellt relevanta om funktionen protein under studien påverkas av strykningen av en viss region7,8,9. En stor begränsning med denna metod är dock att strykningar kan påverka proteinets sekundärt strukturera, leder till Skellefteåsjukan, aggregering och oförmågan att studera avsedda regionen. Ett bra exempel är en stympad version av cytokin oncostatin M (OSM), som studerat en inre radering som är större än 7 rester resulterade i en felveckning mutant som inte kunde ytterligare10.
Generering av chimära proteiner utgör ett alternativ och innovativa förhållningssätt som tillåter analys av större protein regioner. Målet med denna metod är att utbyta regioner av intresse i ett protein av strukturellt relaterade sekvenser i ett annat protein, för att kunna bedöma bidraget från de utbytta delarna till specifika biologiska funktioner. Ofta används i fältet för signalering receptorer att identifiera funktionella domäner11,12, är chimär proteiner särskilt användbart för att studera protein familjer med lite aminosyra identitet men bevarade sekundärt strukturera. Lämpliga exempel kan hittas i klassen av interleukin-6 (IL-6) typ cytokiner, såsom interleukin-6 och ciliär neurotrofisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hämmande faktor (LIF) och OSM (20% identitet)6, där den följande protokoll är baserad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Målet med detta protokoll omfattar utformningen av chimära proteiner där distinkta regioner av ett protein ersättas med deras motsvarande sekvenser i ett strukturellt likartade protein, för att fastställa funktionella betydelsen av dessa regioner. Sådan chimärer genereras genom ett nästlade PCR-protokoll med hjälp av överlappande DNA-fragment och adekvat primers, följt av deras uttryck inom ett däggdjur system för att säkerställa infödda sekundärt strukturera och post-translationella modifieringar.
Den funktionella rollen för en distinkt region framgår sedan av en förlust av aktivitet av chimera i ett lämpligt avläsning test. Följaktligen identifieras regioner härbärgerat en uppsättning kritiska aminosyror, vilket ytterligare kan kontrolleras med kompletterande tekniker (t.ex. webbplats riktad mutagenes) för att öka molekylär upplösning. Begränsad till fall där ett strukturellt relaterade protein med olika funktioner kan hittas, men chimära proteiner har lyckat använts att identifiera kritiska bindande regioner i proteiner såsom cytokiner och cytokin receptorer. Denna metod är särskilt lämplig i fall där proteinets funktionella regioner inte är väldefinierade och utgör ett värdefullt första steg i riktad evolution metoder att begränsa Regionkommittén sevärdheter och minska den screening ansträngningen inblandade.

Konstruktion och generering av en chimär protein (figur 1) kommer att vara exemplifieras med två medlemmar av familjen interleukin-6 cytokin, OSM och LIF, som var föremål för en nyligen publicerad studie6. Figur 2 visar den tredimensionella strukturen av dessa proteiner. Båda molekyler anta klass jag cytokiner, med fyra spiraler (kallas A-D) förpackade i en bunt och sällskap av loopar<sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Strukturellt relaterade proteiner utöva ofta olika biologiska funktioner. Utbyte av motsvarande regioner i dessa proteiner för att skapa chimära proteiner utgör en innovativ metod för att identifiera kritiska protein regioner som ansvarar för deras funktionella skillnader.

Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Utbyte av regioner av strukturellt liknande proteiner för att skapa kimeras gör att vi kan undersöka betydelsen av regioner som ansvarar för biologiska funktioner av molekylen som skall studeras. Regionutbyten föreliggande den allmänna sekundära strukturen hos proteinet så att regionens betydelse för den övergripande strukturen kan skiljas från de direkt medla biologiska funktioner. Det kan vara att förvandlas till välja vilka exakta regioner som ska ersättas.Att börja med större utbyten är oftast till hjälp för att identifiera proteinens nyckelfunktionalitet. För att påbörja proceduren, välj ett lämpligt protein som givare för att utbyta regioner med det protein av intresse som beskrivs i textprotokollet. Sedan, få proteinet aminosyra sekvenser av mottagaren och givaren proteiner från referenssekvensen databasen genom att först få tillgång till genen avsnitt i ref seq webbsida.Skriv in namnet på proteinet av intresse i sökrutan och klicka på sök. Klicka på gennamnet för den önskade arten i den resulterande listan. Bläddra ner till ref seq-sektionen för att se alla dokumenterade isoformer.Klicka på sekvensidentifieraren för den isoform av intresse. Bläddra ner och klicka på CDS för att markera proteinkodning regionen av genen. Längst ner till höger på skärmen, klicka på FAFSDA och kopiera gensekvensen.Spara DNA-sekvensen med hjälp av ett lämpligt DNA-redigeringsprogram. När du använder den fritt tillgängliga APE, öppna programmet, klistra in den kopierade sekvensen i den tomma rutan, välj sekvensnamnet och klicka på spara. Nu väljer du de proteinregioner som ska ersättas i de olika kimeriska konstruktionerna genom att först dela proteinsekvensen av intresse i olika strukturella regioner.För att göra det, ladda ner strukturella data av proteinet av intresse från PDBe webbplats. Få tillgång till PDBe-sidan för proteinet och ladda ner PDBe-filen genom att klicka på hämtning vid höger sida av skärmen. Öppna PDBe-filen i ett molekylärt visualiseringssystem, som Pymol.I Pymol, visa nukleotidsekvensen, dölja standardstrukturaldata och välj den tecknade vyn för att tydligt visualisera proteinets strukturella egenskaper. Klicka på nukleotidsekvensen högst upp på skärmen för att markera olika delar av molekylen, och att man kan lägga till med aminosyrorna som motsvarar varje särskiljande strukturellt drag. Nu, kommentera de distinkta strukturella regionerna på DNA-sekvensen i APE genom att öppna DNA-sekvensen, välja den och klicka på ORFs översätta, klicka sedan på den sista aminosyran i den första regionen för att markera sin position i DNA-sekvensen och välj nukleotidkodning för den regionen.Högerklicka på valet och välj ny funktion för att ge den ett namn och en färg. Upprepa processen för varje strukturell region som identifierats i föregående steg. För att anpassa rester sekvenser av de två proteinerna, först, få full aminosyra sekvenser av givare och receptorproteiner i APE.Som tidigare, öppna givarens DNA-sekvens, markera den och klicka på ORFs översätta. Sedan tillgång till Clustal Omega webbsida och sedan sätta aminosyran sekvenser av de två proteinerna. Varje sekvens bör fortsättas genom en textrad med proteinnamn som ska identifieras på rätt sätt.Bläddra nedåt och klicka på skicka. Hämta justeringsfilen genom att klicka på fliken för justeringsfilen för hämtning och spara den. Den här filen kan öppnas av vilket textredigeringsprogram som helst.Med hjälp av justeringsfilen som referens kommenterar du motsvarande strukturella regioner av givarproteinet i deras DNA-sekvens. Skapa en kopia av den kommenterade DNA-sekvensen av receptorproteinet och döp om det som ett kimeriskt protein. Öppna den omdöpta DNA-sekvensen i APE.Välj den region som ska utväxlas i givarproteinet och välj sedan motsvarande region i det omdöpta receptorproteinet. Klistra in givaren protein DNA-sekvens, och sedan spara ändringarna. Designa terminalens grund- och primrar med hjälp av en DNA-redigerare som APE.Skapa en ny DNA-fil, initiera slutterminalen primer med en ledare sekvens. Följt av den första begränsningsplatsen som valts i vektorerna MCS och den valfria distansen i de inledande 18 till 27 basparen av genen av intresse. I den nya DNA-filen, utforma C terminal primer sekvens till att börja med den slutliga 18 till 27 baspar av genen av intresse följt av en valfri spacer, den andra begränsningen webbplats som valts, och ledaren sekvens.Framhäv hela sekvensen, högerklicka och välj omvänd komplimang för att erhålla den omvända primern. Nu design primers för var och en av gränsregionerna i kimeric konstruktioner. I KIMERA:s DNA-sekvens markerar du en 30-basparregion i den zon där de ursprungliga och insatta sekvenserna är i kontakt.Detta består av 15 baspar i varje sekvens. Kopiera regionen, och klistra in den i en ny DNA-fil. Denna sekvens kommer att vara den främre primern.Gör en kopia av den framåt primer som genereras i föregående steg, och byt namn på den som den omvända primern. Framhäv primersekvensen, högerklicka och välj omvänd komplimang för att generera omvänd primersekvens. Upprepa dessa steg för varje kontaktzon i den kimeriska DNA-sekvensen.Generellt krävs två uppsättningar av framåt omvänd primers för att generera en kimera, om inte ersättningen sker vid N terminal eller C terminal regioner. Förbered en individuell PCR-reaktionsblandning för vart och ett av de fragment som komponerar det kimeriska proteinet. Först ställa en en punkt fem mililiter mikrofuse rör på is och pipet de olika reagenserna av PCR blandningarna i den ordning som anges i textprotokollet.Se till att korrekta grund- och mallar är anställda för varje PCR-reaktion. Etikett två tunna väggad nollpunkt två mililiter PCR-rör för varje reaktion och överför 20 mikroliter av motsvarande PCR-blandning i varje rör. Överför PCR-rören till en PCR-termocyklare och initiera protokollet som detaljerat i textprotokollet.När PCR-reaktionen är avslutad, tillsätt fyra mikroliter av sex x DNA-lastningsbuffert i varje rör. Sätt i agarossgeln med en procent i en elektroforesenhet och täck med TAE-buffert. Ladda noggrant proverna i gelen tillsammans med en molekylvikt senare.När du har kört gelen på 80 till 120 volt i 20 till 45 minuter, stäng av elektroforesenheten och ta bort agoross-gelen. Visualisera de förstärkta DNA-banden i UV-belysning. Med hjälp av ett rakblad, skär ut de enskilda DNA-fragmenten från gelen och överför dem till märkta två mililiter mikrofuserör.Efter att ha använt en PCR clean up kit för att rena DNA-fragmenten, kvantifiera mängden DNA som återvinns genom att mäta absorbansen av proverna vid 260 nanometer och 340 nanometer i en spektrofetometer. Nu, utför PCR förstärkning för att generera den kimeriska DNA-sekvensen. Först, ställ in 50 mikroliter av en PCR-reaktion för att smälta kimerans separata beståndsdelar som tidigare.Använd N-terminalen och C-terminalens primrar tillsammans med 10 nanogram av var och en av de förstärkta DNA-fragmenten. Återhämta och kvantifiera den renat DNA-fragmentet som tidigare, i 30 mikroliter av kärnan fritt vatten. Detta fragment innehåller den kimeriska DNA-sekvensen flankerad av de begränsningsplatser som ingår i terminalens primers.Generering av ett kimeriskt protein exemplifieras med två medlemmar av inter luke och sex sytokine familjen. Oncostaten M i leukemi hämmande faktor. OSM-lyft kimera resulterar från utbyte av BC-loopregionen av OSM med en motsvarande lyftsekvens.Det första PCR-amplifieringssteget bestod av tre separata reaktioner. N-terminal OSM-fragmentet, som krävde N-terminal OSM framåt och BC starta omvänd primers används OSM som mall. LIF BC-slingan erhölls genom BC start forward och BC N omvänd primers med LIF som mall.C-terminal OSM-fragmentet använde BC end forward och C-terminal OSM omvända grund- och primrar samt OSM som mall. Dessa renade fragment användes sedan som mall i den andra PCR-reaktionen tillsammans med N-terminal OSM framåt och C-terminal OSM omvänd primers att förstärka motsvarande OSM LIF BC loop gensekvens. Efter rening och omvandling till e-coli, isolerades enskilda plasmider och screenas av begränsning enzym matsmältning för korrekt insättning av DNA-fragmentet.Gel elektrofores visade positiva träffar som sedan skickades för sekvens verifiering. Kimeriska proteiner måste produceras och aktiviteten mätas i en perfekt factionality system. För att fastställa betydelsen av de ersatta regionerna för just den fraktionen.Denna teknik har varit mycket användbar och ofta tillämpas, störde signally receptorer i syfte att identifiera viktiga funktion domäner och receptor webbplatser erkännande. Antalet jag använder för DNA-elektrofores bör hanteras genom att använda engångshandskar, en laboratorierock och skyddsglasögon.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...