Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Bu eser Max Planck toplum ve Schüchtermann klinik (Bad Rothenfelde, Almanya) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırmanın bir parçası ilk biyolojik Kimya Dergisi yayımlandı. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB döngü ve D-helix bağlama site III insan Oncostatin M (OSM) OSM reseptörü harekete geçirmek için gereklidir. J. Biol. kimyasalları 2018; 18:7017-7029. © yazarlar.

1. chimeric Protein tasarımı
<ol><li>Uygun protein (donör protein ideal aynı protein ailesine ait, ama okuma kullanılmak üzere biyolojik aktivitesi eksik yapısal olarak benzer olmalıdır faiz (alıcı) protein bölgeleriyle değişimi için donör) seçin. Yapısal olarak ilgili hiçbir proteinler biliniyorsa, potansiyel adaylar bu uçsuz vektör hizalama arama aracı (bucaksız)14,15 gibi otomatik bir araç kullanarak belirlenebilir<ol>
<li>Protein ver...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

Chimeric proteinlerin üretimi sitokin reseptör bağlayıcı etki alanları13modüler gibi adres sorular için kesilmiş proteinler sınırları ötesine gitmek mümkün olan bir çok yönlü teknik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Chimeras tasarım çalışmaları bu tür önemli bir adımdır ve dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Daha küçük değişiklik, değişken uzunlukta tek bir bölgeye ayrıntılı çalışmalar için daha uygun olmakla birlikte işlevsel etki alanları kurmak i?...

Proteinler, sitokinler ve büyüme faktörleri, dahil olmak üzere çeşitli türleri üyeleri benzer üç boyutlu yapılar paylaşmak ama farklı biyolojik fonksiyonlar1,2kez sarfetmek ailelerde gruplandırılır. Bu işlevsel çeşitlilik genellikle amino asit kompozisyonu molekül'ın etkin sitelere3içinde küçük farklılıklar sonucudur. Tür siteler ve fonksiyonel belirleyicileri tanımlaması sadece sağlamıyorsa değerli evrimsel bakış açısı aynı zamanda daha açık agonistleri ve inhibitörleri4tasarlamak için. Ancak, sık sık ilgili Yapısal proteinler arasında bulunan kalıntı kompozisyon farklılıkları çok sayıda bu görevi zorlaştırmaktadır. İçeren büyük kütüphaneler inşa mutantlar yüzlerce günümüzde her tek kalıntı varyasyon değerlendirilmesi mümkün olsa bile ve bunların birleşimleri hala zor ve zaman alıcı çaba5kalır.
Büyük protein bölgeleri işlevsel önemini değerlendirme teknikleri böylece değerli için yönetilebilir numarası6mümkün artıkları sayısını azaltmak için. Kesilmiş proteinler bu sorunu çözmek için en çok kullanılan yaklaşım olmuştur. Buna göre bölgeler altında eğitim protein işlevi belirli bölge7,8,9silme tarafından etkileniyorsa işlevsel olarak ilgili olarak kabul edilir. Ancak, bir büyük bu yöntem silme protein'ın ikincil yapı, misfolding, toplama ve yetersizlik hedeflenen bölge eğitim için giden etkileyebilir kısıtlamasıdır. Sitokin oncostatin M (OSM) bir iç silme 7 artıkları daha fazla olamazdı bir misfolded mutant sonuçlandı daha büyük10okudu, kesilmiş bir sürümü iyi bir örnektir.
Chimeric proteinlerin üretimi daha büyük protein bölgeleri analizine izin veren bir alternatif ve yenilikçi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem, belirli Biyolojik işlevleri yerine bölümlerine katkısını değerlendirmek için başka bir protein, yapısal olarak Ilgili sıralarının tarafından bir protein ilgi bölgelerinde değişimi için hedeftir. Reseptörleri işlevsel etki alanları11,12tanımlamak için sinyal alanında yaygın olarak kullanılan, chimeric proteinler protein aileler küçük amino asit kimlik ama korunmuş ikincil yapısı ile çalışmak özellikle yararlıdır. Uygun örnekler interlökin-6 ve silier nörotrofik faktör (% 6 sıra kimlik)13 ya da lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve OSM (% 20 kimlik)6, hangi gibi interlökin-6 (IL-6) türü sitokinler, sınıfta bulunabilir protokol sonrası dayanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Bu iletişim kuralının amacı chimeric proteinler içinde ayrı bir protein bölgelerinde yapısal olarak benzer bir protein karşılık gelen onların serilerinde bu bölgeleri işlevsel önemini belirlemek için değiştirilir tasarımını kapsar. Böyle chimeras örtüşen DNA parçalarının kullanan bir iç içe geçmiş PCR protokolü aracılığıyla oluşturulur ve yeterince astar, onların ifade yerli ikincil yapı ve translasyonel modifikasyonlar sağlamak için bir memeli sistemi içinde ardından tasarlanmış.
Farklı bölge işlevsel rolü sonra Chimera uygun okuma tahlil aktivite kaybı simgesiyle gösterilir. Sonuç olarak, hangi daha fazla moleküler çözünürlüğünü artırmak için tamamlayıcı teknikleri tarafından (Örneğin site yönettiği mutagenesis) taranması bölgeleri barındıran kritik amino asitler kümesi tanımlanır. Farklı fonksiyonları ile yapısal olarak ilgili bir protein bulunabilir durumlarda sınırlı olmasına rağmen chimeric proteinler başarıyla proteinler sitokinler ve sitokin reseptörleri gibi bölgelerde kritik bağlama tanımlamak için istihdam edilmiştir. Bu yöntem özellikle protein'ın fonksiyonel bölgeleri iyi tanımlanmış olmayan durumlarda uygundur ve faiz bölgeleri dar ve tarama çaba dahil azaltmak için yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar içinde değerli bir ilk adım teşkil etmektedir.

İnşaat ve üretimi chimeric protein (Şekil 1) örneği iki üyesi interlökin-6 sitokin aile ile OSM ve LIF, kısa bir süre önce çalışma6konuydu. Şekil 2 bu proteinler üç boyutlu yapısını gösterir. Her iki molekül ben sitokinler, dört sarmal (A-D olarak adlandırdığı) ile bir paket içinde paketlenmiş ve döngüler28tarafından katıldı sınıfının karakteris...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Kimeras oluşturmak için yapısal olarak benzer proteinlerin bölgeleri değişimi bize molekülün biyolojik işlevlerinden sorumlu bölgelerin önemini araştırmak için izin verir incelenecek. Bölge değişimleri proteinin genel ikincil yapısını önceden algılar, böylece bölgenin genel yapısı için önemli olan biyolojik fonksiyonlara doğrudan aracılık edenlerden ayırt edilebilir. Değiştirilecek tam bölgelerin seçilebileceği ne olabilir.Daha büyük değişimlerile başlayarak genellikle proteinin temel işlevselliğini belirlemek için yararlıdır. İşleme başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ilgi proteini ile bölgeleri değiştirmek için donör olarak uygun bir protein seçin. Daha sonra, ref seq web sayfasındaki gen bölümüne ilk olarak erişerek alıcı ve donör proteinlerinin protein amino asit dizilerini referans sıra veritabanından elde edin.Arama kutusuna ilgi çeken proteinin adını yazın ve arama'ya tıklayın. Açılan listede istenilen türiçin gen adını tıklayın. Belgelenmiş tüm isoformları görmek için ref seq bölümüne gidin.İlgi nin izoform için sıra tanımlayıcısını tıklatın. Aşağı kaydırın ve genin protein kodlama bölgesini vurgulamak için cd'lere tıklayın. Ekranın sağ alt kısmında FAFSDA'ya tıklayın ve gen dizisini kopyalayın.Uygun bir DNA düzenleme yazılımı kullanarak DNA dizisini kaydedin. Serbestçe kullanılabilir APE kullanırken, programı açın, boş kutuya kopyalanan sırayı yapıştırın, sıra adını seçin ve kaydet'i tıklatın. Şimdi, ilk farklı yapısal bölgelerde ilgi protein dizisi bölerek farklı kimeric yapılaryerine protein bölgeleri seçin.Bunu yapmak için, PDBe web sitesinden ilgi protein yapısal verileri indirin. Protein için PDBe sayfasına erişin ve ekranın sağ tarafındaki karşıdan yükleme'ye tıklayarak PDBe dosyasını indirin. PDBe dosyasını Pymol gibi moleküler bir görselleştirme sisteminde açın.Pymol'da, nükleotit dizisini görüntüleyin, varsayılan yapısal verileri gizleyin ve proteinin yapısal özelliklerini net bir şekilde görselleştirmek için çizgi film görünümünü seçin. Molekülün farklı bölümlerini vurgulamak için ekranın üst kısmındaki nükleotid dizisini tıklatın ve her bir farklı yapısal özelliğe karşılık gelen amino asitleri belirtin. Şimdi, DNA dizisini açarak, seçerek ve ÇEVIRI'ye tıklayarak APE'deki DNA dizisindeki farklı yapısal bölgelere açıklama getirin, sonra ilk bölgenin son amino asitini tıklayarak DNA dizisindeki konumunu vurgulayın ve o bölge için nükleotitin kodlamasını seçin.Seçime sağ tıklayın ve bir ad ve renk vermek için yeni bir özellik seçin. Önceki adımda tanımlanan her yapısal bölge için işlemi yineleyin. İki proteinin kalıntı dizilerini hizalamak için, ilk olarak, APE donör ve reseptör proteinlerinin tam amino asit dizilerini elde edin.Daha önce olduğu gibi, donör DNA sırasını açın, seçin ve ORFs translate'e tıklayın. Sonra, Clustal Omega web sayfasına erişin ve sonra iki proteinin amino asit dizilerini koyun. Her dizi düzgün tanımlanabilecek protein adı içeren bir metin satırı ile devam edilmelidir.Aşağı kaydırın ve gönder'e tıklayın. İndirme hizalama dosyası sekmesini tıklatarak hizalama dosyasını alın ve kaydedin. Bu dosya herhangi bir metin düzenleme programı tarafından açılabilir.Bir referans olarak hizalama dosyasını kullanarak, dna dizisinde donör proteinin ilgili yapısal bölgelerine açıklama. Reseptör proteininin açıklamalı DNA dizisinin bir kopyasını oluşturun ve kimerik protein olarak yeniden adlandırın. APE'de yeniden adlandırılmış DNA dizisini açın.Donör proteinin değiş tokuş edilecek bölgeyi seçin, ardından yeniden adlandırılmış reseptör proteinindeki ilgili bölgeyi seçin. Donör protein DNA dizisini yapıştırın ve değişiklikleri kaydedin. APE gibi bir DNA düzenleyicisi kullanarak terminal astarlarını tasarla.Yeni bir DNA dosyası oluşturun, son terminal astarını lider sırasıyla başlatın. Vektörmcs MCS ve ilgi geninin ilk 18-27 baz çiftleri isteğe bağlı spacer seçilen ilk kısıtlama sitesi izledi. Yeni DNA dosyasında, C terminali astar sırasını, isteğe bağlı bir spacer, seçilen ikinci kısıtlama alanı ve lider dizisi nin ardından ilgi geninin son 18 ila 27 baz çiftiyle başlamak üzere tasarla.Tüm sırayı vurgulayın, sağ tıklatın ve ters astarı elde etmek için ters tümsegi seçin. Şimdi, kimeric yapılarda sınır bölgelerin her biri için tasarım astarları. Kimera'nın DNA dizisinde, orijinal ve eklenen dizilerin temas ettiği bölgede 30 baz çifti bölgesini vurgulayın.Bu, her dizide 15 baz çiftinden oluşur. Bölgeyi kopyalayın ve yeni bir DNA dosyasına yapıştırın. Bu sekans ileri astar olacak.Önceki adımda oluşturulan ileri astarın bir kopyasını yapın ve ters astar olarak yeniden adlandırın. Astar sırasını vurgulayın, sağ tıklatın ve ters astar sırasını oluşturmak için ters tümevarseçeneğini seçin. Kimeric DNA dizisindeki her temas bölgesi için bu adımları tekrarlayın.Genellikle, değiştirme N terminali veya C terminal bölgelerinde gerçekleşmediği sürece, bir kimera oluşturmak için iki ileri geri astar kümesi gereklidir. Kimerik proteini oluşturan parçaların her biri için ayrı bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Önce bir nokta beş mililitrelik mikrofuse tüp buz ve metin protokolü listelenen sırada PCR karışımları farklı reaktifler pipet ayarlayın.Her PCR reaksiyonu için doğru astarların ve şablonların kullanıldığından emin olun. Her reaksiyon için iki ince duvarlı sıfır noktası iki mililitre PCR tüp etiketlayın ve her tüpte ilgili PCR karışımının 20 mikrolitresini aktarın. PCR tüplerini bir PCR termocycler'a aktarın ve metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokolü başlatın.PCR reaksiyonu tamamlandıktan sonra, her tüpe altı x DNA yükleme tamponunun dört mikrolitresini ekleyin. Bir elektroforez ünitesine yüzde bir agaross jeli yerleştirin ve TAE tampon ile kaplayın. Dikkatle bir molekül ağırlığı ikinci ile birlikte jel içine örnekleri yükleyin.20 ila 45 dakika boyunca 80-120 volt jel çalıştırdıktan sonra, elektroforez ünitesikapatın ve agoross jel çıkarın. UV ışığı altında güçlendirilmiş DNA bantlarını görselleştirin. Jilet kullanarak, jelden tek tek DNA parçalarını kesip iki mililitrelik mikrofit tüpüne aktarın.DNA parçalarını arındırmak için pcr temizleme kiti ni kullandıktan sonra, numunelerin emiciliğini 260 nanometre ve 340 nanometrede bir spektrofetometrede ölçerek elde edilen DNA miktarını ölçün. Şimdi, kimeric DNA dizisi oluşturmak için PCR amplifikasyon gerçekleştirin. İlk olarak, kimeranın ayrı bileşenlerini daha önce olduğu gibi kaynaştırmak için 50 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın.N terminali ve C terminal astarlarını, güçlendirilmiş DNA parçalarının her birinin 10 nanogramı ile birlikte çalıştırın. 30 mikrolitre çekirdeğin serbest suyunda saflaştırılmış DNA parçasını kurtarın ve ölçün. Bu parça, terminal astarlarında bulunan kısıtlama bölgeleri yle çevrili kimerik DNA dizisini içerir.Kimerik protein üretimi inter luke ve altı sytokine ailesinin iki üyesi ile örneklenir. Oncostaten M lösemi inhibitör faktörü. OSM asansör ütyük, OSM'nin BC döngü bölgesini ilgili asansör sırası ile değiş tokuş etmekle sonuçlanır.İlk PCR amplifikasyon adımı üç ayrı reaksiyondan oluşuyordu. N-terminal OSM ileri ve BC başlatmak ters astarlar gerekli N-terminal OSM parçası şablon olarak OSM kullanılır. LIF BC döngüsü, ŞABLON olarak LIF kullanılarak BC start forward ve BC N ters astarları ile elde edilmiştir.C-terminal OSM parçası bc end forward ve C terminal OSM ters astarlar yanı sıra OSM şablon olarak kullanılır. Bu saflaştırılmış parçalar daha sonra ilgili OSM LIF BC döngü gen dizisini yükseltmek için N-terminal OSM ileri ve C-terminal OSM ters astarları ile birlikte ikinci PCR reaksiyonunda şablon olarak kullanılmıştır. Saflaştırma ve e-coli'ye dönüşmesinin ardından, bireysel plazmidler izole edildi ve DNA parçasının düzgün takılması için restriksiyon enzimsi sindirimi ile tarandı.Jel elektroforezi daha sonra sıra doğrulama için gönderilen pozitif isabet ler ortaya çıkardı. Kimerik proteinler üretilmelidir ve aktivite mükemmel bir hizipçilik sistemlerinde ölçüldü. Değiştirilen bölgelerin o grup için önemini belirlemek için.Bu teknik çok yararlı ve sık uygulanan, sinyal reseptörlerinin müdahale amacıyla anahtar fonksiyon etki alanları ve reseptör tanıma siteleri belirlemek için. DNA elektroforezi için kullandığım numara tek kullanımlık eldivenler, laboratuvar paltosu ve koruyucu gözlükler kullanılarak ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma