Name: two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Nous remercions les cellules et tissus Imaging Facility de l’Institut du Fer à Moulin, où toutes les image acquisition et l’analyse ont été effectuées. Ce travail a été soutenu en partie par le Centre National de la Recherche Scientifique, l’Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sciences de l’Université de la Sorbonne et par des subventions de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie université () Programme Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale « Equipe FRM DEQ2014039529 », le Ministère Français de la recherche (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 et l’avenir des Investissements du programme « Bio-Psy Labex » ANR-11-IDEX-0004-02) et une recherche Collaborative dans le programme de neurosciences computationnelles, National Science Foundation/Français Agence nationale pour la recherche (numéro : 1515686). Tous les auteurs sont affiliés à la recherche des groupes qui sont membres de l’école des neurosciences de Paris (PEV) et de la Bio-Psy Labex. F.E. est étudiant au doctorat affilié à la Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Paris, France et est financé par le Labex Bio-Psy. V.M. est stagiaire postdoctorale financé par la recherche Collaborative dans le programme de neurosciences computationnelles, National Science Foundation/Français Agence nationale pour la recherche (numéro : 1515686). Les auteurs remercient Marta Kolodziejczak qui ont participé à l’initiation du projet.

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité local d’éthique (Comité de Darwin, accords 1170 # et #10921).
1. préparation des Micropipettes de verre pour l’Application locale de composés
<ol><li>Préparer les pipettes de borosilicate capillaires en verre à paroi mince avec un extracteur de l’électrode. Ajustez les paramètres pour obtenir des pipettes avec un 4-5 µm de diamètre à leur extrémité. Figure 2D montre une pipette en fo...

<ol>
	<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth.">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect.">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).</li><li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus.">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).</li><li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Ramification,+Surveillance,+and+Interleukin-1&#946;+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K+Channel+THIK-1.">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1&#946; Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi/o-coupled+P2Y+receptors.">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents.">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li><li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors:+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections.">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner.">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Pfeiffer, T., Avignone, E., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines.">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor.">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP.">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li><li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation,+motility,+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis.">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li><li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microglial+activation:+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices.">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li><li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices:+SNAPSHOT+Method.">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProMoIJ:+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility.">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li><li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice.">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).</li><li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+in+living+brain+slices.">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), 231-239 (1999).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo.">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li><li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke.">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).</li><li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures.">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li></ol>

Par le maintien, à la différence en dissocié ou organotypique trancher une intégrité structurelle avec les réglages de réseau limité, de la culture, des tranches de cerveau aiguë aux chercheurs d’étudier des microglies dans leur environnement physiologique. Cependant, une des principales limites est le fait que la procédure de tranchage crée des blessures qui peuvent rapidement compromettre la viabilité des neurones, particulièrement dans le cerveau adulte. Comme les microglies sont particulièrement réa...

Les cellules microgliales sont les macrophages résidents du cerveau et jouent un rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques1,2. Ils ont une morphologie très ramifiée et sont constamment étendre et rétracter leur processus3,4. Ce comportement de « balayage » est censé être liées et nécessaires à l’enquête de leur environnement. La plasticité morphologique des microglies est exprimée en trois modes. Tout d’abord, certains composés modulent rapidement microgliales morphologie : l’addition d’ATP5,6 ou NMDA5,7 , dans le milieu de baignade tranches cérébrale aiguë accroît la complexité des microglies ramifications, Alors que la noradrénaline diminue il6. Ces effets sont directement médiées par les récepteurs microgliales (par l’ATP et de la noradrénaline) ou nécessitent une libération d’ATP des neurones (pour NMDA). En second lieu, la vitesse de croissance et rétraction des processus microgliales, appelé la motilité ou « surveillance », peut être affectée par des facteurs extracellulaires8, perturbations de l’homéostasie du9,10ou mutations9, 10,11. En troisième lieu, en plus de ces changements isotropes de morphologie et de la motilité, microglie ont la capacité d’étendre leurs processus déviés vers une pipette livrant ATP3,5,12, 13 , 14, la culture, en tranches cérébrale aiguë ou in vivo, ou livraison de 5-HT dans cérébrale aiguë tranches15. Une telle croissance axée sur des processus microgliales, également appelé motilité directionnelle, a été décrite comme une réponse à un laser local lésion3,4. Ainsi, physiologiquement, il peut être lié à la réponse à une lésion ou requis pour le ciblage des microglies processus vers les synapses ou régions cérébrales nécessitant l’élagage pendant développement15,16, ou enphysiologiques 17 ,18,19 ou situations pathologiques9,18,19,20 , à l’âge adulte. Les trois types de changements morphologiques s’appuient sur différents mécanismes intracellulaires de13,11,20, et une substance donnée ne pas nécessairement modulé chacun d’eux (p. ex., NMDA, qui agit indirectement sur la microglie, a un effet sur la morphologie, mais n’induit pas de motilité directionnelle5,,7). Par conséquent, lorsque le but de caractériser les effets d’un composé, une mutation ou une pathologie sur la microglie, il est important de caractériser les trois composantes de leur plasticité morphologique. Nous décrivons ici une méthode pour étudier la croissance directionnelle des microglies processus vers une source locale de composé, qui est, ici, ATP ou 5-HT.
Il existe plusieurs modèles pour étudier l’attraction des microglies processus : cultures primaires en environnement 3D6,18,19, cérébrale aiguë tranches6,13,15et in vivo imagerie des3,13. L’approche in vivo est le meilleur pour préserver l’état physiologique des cellules microgliales. Cependant, imagerie intravitale des régions profondes nécessite des interventions chirurgicales complexes et, par conséquent, il est souvent limité à des couches corticales superficielles. L’utilisation de culture primaire de cellules microgliales est la technique la plus simple pour tester un grand nombre de conditions avec un nombre limité d’animaux. Néanmoins, il est impossible d’obtenir la même morphologie cellulaire comme en vivo, et les cellules perdent leurs interactions physiologiques avec les neurones et les astrocytes. Tranches de cerveau aiguë représentent un compromis entre ces deux approches. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les structures cérébrales qui sont par ailleurs difficiles d’atteindre d’images à haute résolution in vivo et d’enquêter sur des tranches de stades néonatales, attendu que transcrânienne microscopie est principalement effectuée à l’âge adulte. Enfin, il rend possible d’observer en temps réel les effets de la demande de drogue local et de répéter les expériences tout en utilisant un nombre limité d’animaux. Néanmoins, un problème avec des tranches de cerveau aigu est le peu de temps (quelques heures) au cours de laquelle les cellules demeurent vivantes, notamment pour les tranches de souris plus de deux semaines et la variation du potentiel de la morphologie des cellules microgliales au fil du temps21,22 .
Nous décrivons ici un protocole visant à préparer des tranches de cerveau aiguë de jeunes et d’adultes Cx3cr1GFP / + souris jusqu'à deux mois, avec la préservation de la morphologie de la microglie et motilité pendant plusieurs heures. Nous, ensuite, décrivent comment utiliser ces tranches pour étudier l’attraction des microglies processus vers composés comme ATP ou 5-HT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>for pipettes preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0065</td>
			<td>Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td>Zeitz Instrumente</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride SigmaUltra &#62;99,0% (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>for all the solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 200 mL crystalizing dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mL Pyrex beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Dolethal 50 mg/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers (Whatman)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food box 10 cm diameter, 8 cm Height</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue (ethyl cyanoacrylate)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>super glue 3 power flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampal Tool (spatula)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10099-15</td>
			<td>The largest extremity has to be angled at 90 &#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps (curved)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>For the slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice interface holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating slicer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>720-2709</td>
			<td>Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 32&#176;C (first recovery step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#215; 25 0.95 NA water-immersion objective</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td>HCX Irapo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For 2-photon chamber perfusion with aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td>I1501L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser</td>
			<td>Coherent (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable transfer pipettes , wide mouth</td>
			<td>ThermoFischer scientific</td>
			<td>for example : 232-11</td>
			<td>5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emission filter SP680</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating system</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>Automatic Heater Controller TC-324B</td>
			<td>to maintain perfusion solution at 32&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice holder (&#34;harp&#34;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice stimulation </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-26209</td>
			<td>to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4&#176;C (a few hours) and diluted just before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (optional)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-6377</td>
			<td>use at 1 &#181;M final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>connected to the micropipette holde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>same as for eletrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-9523</td>
			<td>aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20&#176;C. 500&#181;M solution prepared the day of the experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5mL (without needle)</td>
			<td>Terumo medical products</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tubing</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11750105</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482; Tygon&#8482; E-3603 Non-DEHP Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icy</td>
			<td>Institut Pasteur</td>
			<td>http://icy.bioimageanalysis.org</td>
			<td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1-GFP mice</td>
			<td>Jung et al, 2000</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1creER-YFP mice</td>
			<td>Parkhurst et al 2013</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices

Les cellules microgliales sont des cellules immunitaires innées résidents du cerveau qui constamment analyser leur environnement avec leurs longs prolongements et, à la perturbation de l’homéostasie, subissent des changements morphologiques rapides. Par exemple, une lésion laser induit en quelques minutes une croissance axée sur des processus microgliales, également appelé « motilité directionnelle », vers l’endroit de la blessure. Un effet similaire peut être obtenu en fournissant localement ATP ou la sérotonine (5-hydroxytryptamine [5-HT]). Dans cet article, nous décrivons un protocole pour induire une croissance directionnelle des microglies processus vers une application locale d’ATP ou 5-HT dans des tranches de cerveau aiguë des souris jeunes et adultes et à l’image de cette attraction au fil du temps par la microscopie multiphoton. On propose une méthode simple de quantification avec analyse d’images gratuit et open source. Un défi qui caractérise encore les tranches cérébrale aiguë est le temps limité, diminuant avec l’âge, au cours de laquelle les cellules demeurent dans un état physiologique. Ce protocole, par conséquent, souligne certaines améliorations techniques (imagerie chambre avec une perfusion double chambre interface medium, air liquide) visant à optimiser la viabilité des cellules microgliales pendant plusieurs heures, surtout dans les tranches de souris adultes.

Ce protocole décrit une méthode pour induire, observer et quantifier la croissance orientée des microglies processus vers un composé appliqué localement, par exemple, l’ATP ou 5-HT, dans cérébrale aiguë tranches de jeune ou adulte (au moins jusqu'à deux mois) souris. Parmi les facteurs qui contribuent au maintien des tranches de cerveau d’animaux adultes en bon état pendant plusieurs heures est l’utilisation de deux outils conçus pour optimiser la survie des cellules à d...

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Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

La microglie, les résidents cellules immunitaires du cerveau, répondre rapidement avec des changements morphologiques aux modifications de leur environnement. Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie biphotonique à étudier l’attraction des microglies processus vers la sérotonine ou l’ATP en tranches cérébrale aiguë des souris.

Two-photon Imaging d’Attraction des microglies processus vers l’ATP ou la sérotonine cérébrale aiguë tranches

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Pour caractériser pleinement un phénotype microglial, il est important de s’attaquer à la motilité basale et directionnelle. Ce protocole peut être utilisé pour tester la motilité directionnelle des microglies par imagerie à deux photons chez les souris tranches de cerveau, en utilisant l’interface d’impression 3D personnalisée et les chambres de perfusion. Fanny Etienne, doctorante, et Vincenzo Mastriolia, chercheur postdoctoral, tous deux de nos laboratoires, feront la démonstration de la procédure.Au moins 30 minutes avant la dissection, commencer à bouillonner 70 millilitres de choline liquide céphalo-rachidien artificiel, ou aCSF choline, sur la glace. Ajouter 150 millilitres de choline aCSF à 32 degrés Celsius, avec carbogen. Placer un plat cristallisant de 200 millilitres à l’aide d’un aimant à barres dans une boîte d’aliments scellée et ajouter 200 millilitres d’aCSF au plat.Placez un support de tranche d’interface imprimé 3D sur le dessus du plat et retirez l’excès de liquide du plat cristallisant, jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un mince film de solution couvrant le maillage du support de diapositives de l’interface. Ajouter quelques millimètres d’aCSF au fond de la boîte de nourriture et commencer à bouillonner le liquide avec du carbogen. Ensuite, fermez la boîte scellée tout en maintenant la carbogénation constante pour créer une chambre d’interface humidifiée, 95%oxygène, 5% riche en dioxyde de carbone.Après la récolte, placez le cerveau sur un morceau de papier filtre imbibé d’aCSF et disséquez la région d’intérêt, selon l’angle préféré de tranchage. Pour les tranches coronales, placez et collez la face caudale du cerveau sur une boîte de Pétri de 10 centimètres fixée au bloc de coupe d’une trancheuse vibrante, et placez le bloc dans la chambre du réservoir de la trancheuse vibrante dans une grande chambre remplie de glace. Remplissez le plat d’aCSF de choline glacée et utilisez la trancheuse pour obtenir des tranches de cerveau de 300 micromètres d’épaisseur, à l’aide d’une pipette de transfert jetable de quatre millimètres de diamètre après chaque passage de la lame pour recueillir chaque tranche.Laissez chaque tranche récupérer dans l’aCSF choline de 32 degrés Celsius pendant environ 10 minutes après son obtenir, avant de transférer les tranches sur des morceaux de papier nettoyant pour lentilles, surmonté d’une goutte d’aCSF choline. Ensuite, aspirez l’excès de choline aCSF et utilisez une spatule pour transférer les tranches sur le maillage de la chambre d’interface, permettant aux tranches de récupérer dans cet environnement pendant au moins 30 minutes. 30 minutes avant de commencer l’enregistrement, connectez la pompe périssaltique à une chambre d’enregistrement personnalisée avec perfusion supérieure et inférieure pour optimiser l’oxygénation et la viabilité des tranches de tissu, et nettoyez l’ensemble du système de perfusion avec 50 millilitres d’eau ultrapure.À la fin du cycle de nettoyage, commencer la perfusion de la chambre d’enregistrement avec 50 millilitres d’aCSF dans un bécher en verre sous carbogénation constante, et utiliser un jetable, pipette de transfert à grande bouche pour transférer la première tranche à être photographié au bécher pour enlever le papier objectif. Lorsque la section est descendue au fond du bécher, transférez la section dans la chambre d’enregistrement et placez le support de la tranche sur la tranche afin de minimiser le mouvement induit par le flux de perfusion. Utilisez l’éclairage à champ lumineux pour cibler la région cérébrale d’intérêt sous un grossissement de cinq à 10 x.Ensuite, utilisez un objectif 25x avec une lentille d’immersion d’eau de 0,35 x pour ajuster la position du champ d’observation. Utilisez l’éclairage de fluorescence pour localiser les cellules microgliales fluorescentes et remblayer la pipette avec 10 microlitres d’aCSF contenant le composé d’intérêt à sa concentration finale. Dirigez la pointe vers le bas avec des secousses douces pour enlever les bulles d’air emprisonnées dans la pointe et monter la pipette remplie dans un support de pipette relié à une seringue de cinq millilitres avec le piston placé à la position de cinq millilitres et monté sur un micromanipulateur à trois axes.Abaissez doucement la pipette vers la tranche, en contrôlant et en ajustant l’objectif en même temps, jusqu’à ce que la pointe de la pipette touche légèrement la surface de la tranche. Maintenant, régler le laser et passer le microscope au mode multiphoton. Assurez-vous que cette chambre est filtrée à partir de n’importe quelle source de lumière et allumez les détecteurs non descanned.Définissez le gain et utilisez une table de recherchez avec une limite supérieure codée en couleur pour éviter de saturer les pixels de l’image. Ensuite, commencez à enregistrer pour une durée totale d’au moins 30 minutes, en déprimant lentement le piston de seringue de la position de cinq à un millilitre, après cinq minutes, sur une période de cinq secondes, pour appliquer le composé sur la section. Pour l’analyse d’image, effectuez d’abord la correction z-projection et drift avec ImageJ dans le fichier d’intérêt.Ensuite, ouvrez le fichier modifié dans Icy et dessinez une zone circulaire d’intérêt de 35 micromètres de diamètre, centrée sur le site d’injection. Exécutez le film à nouveau avec le roi, pour s’assurer qu’il est bien positionné. Ensuite, utilisez le plugin d’évolution de la région d’intensité d’intérêt pour mesurer l’intensité moyenne au fil du temps dans la région d’intérêt, et enregistrer les résultats comme un fichier xls.Ce protocole permet de mesurer les réponses induites par différents composés, comme l’ATP ou la sérotonine. Bien que l’injection d’ATP provoque une augmentation de la fluorescence, après la plupart des injections d’ATP, il ya une diminution immédiate et légère de la fluorescence due à la distorsion des tissus qui revient après quelques minutes. La taille de la région d’intérêt a également une incidence sur la quantification, car l’augmentation du diamètre réduit la variabilité entre les expériences, mais diminue l’exactitude et l’ampleur de la réponse détectée.L’évaluation de la réponse microgliale à un moment précis peut être utile pour la comparaison statistique de différents composés, ou pour tester les effets d’antagonistes spécifiques ajoutés à la solution de perfusion. Pour quantifier la motilité en trois dimensions, sachez que vous devrez peut-être modifier l’intervalle z-step et le taux d’échantillonnage de l’acquisition pour vous adapter aux exigences d’analyse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Recherche

Neurosciences

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Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

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In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

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In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

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In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imagerie de l'ATP intracellulaire dans les tranches de tissu organotypiques du cerveau de la souris à l'aide du capteur ATeam1.03YEMK à base de FRET

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

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Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

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