Name: two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Ringraziamo la cellula e tessuto Imaging Facility del Institut du Fer à Moulin, dove sono state eseguite tutte le analisi e acquisizione delle immagini. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le scienze di Université Sorbonne e dalle sovvenzioni dalla Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Università ( Programma Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", il Ministero francese della ricerca (Agence Nationale pour la Recherche Programma di ANR-17-CE16-0008 e l'Avenir Investissements "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) e una ricerca collaborativa nel programma di neuroscienze computazionali, National Science Foundation/francese Agenzia nazionale per la ricerca (numero: 1515686). Tutti gli autori sono affiliati per ricercare gruppi che sono membri del Paris School of Neuroscience (PEV) e del Labex Bio-Psy. F.E. è uno studente di dottorato di ricerca affiliato Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Parigi, Francia ed è finanziato dal Labex Bio-Psy. V.M. è un post-dottorato finanziato la ricerca collaborativa nel programma di neuroscienze computazionali, National Science Foundation/francese Agenzia nazionale per la ricerca (numero: 1515686). Gli autori ringraziano Marta Kolodziejczak che hanno partecipato all'inizio del progetto.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico locale (Comitato di Darwin, accordi 1170 # e #10921).
1. preparazione del vetro Micropipette per l'applicazione locale di composti
<ol><li>Preparare pipette da borosilicato tubi capillari in vetro a parete sottile con un estrattore di elettrodo. Regolare i parametri per ottenere pipette con un diametro di 4-5 µm alle loro estremità. Figura 2D Mostra una pipetta in campo chiaro a basso ingrandimento....

<ol>
	<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth.">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect.">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).</li><li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus.">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).</li><li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Ramification,+Surveillance,+and+Interleukin-1&#946;+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K+Channel+THIK-1.">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1&#946; Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi/o-coupled+P2Y+receptors.">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents.">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li><li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors:+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections.">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner.">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Pfeiffer, T., Avignone, E., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines.">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor.">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP.">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li><li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation,+motility,+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis.">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li><li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microglial+activation:+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices.">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li><li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices:+SNAPSHOT+Method.">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProMoIJ:+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility.">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li><li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice.">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).</li><li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+in+living+brain+slices.">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), 231-239 (1999).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo.">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li><li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke.">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).</li><li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures.">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li></ol>

Mantenendo, a differenza di in dissociato o organotipiche affettare cultura, un'integrità strutturale con regolazioni di rete limitata, fettine di cervello acuto permettono ai ricercatori di studiare microglia nel loro ambiente fisiologico. Tuttavia, uno dei principali limiti è il fatto che la procedura per affettare crea le lesioni che possono rapidamente compromettere la vitalità dei neuroni, specialmente nel cervello adulto. Come la microglia è particolarmente reattivo al danno cellulare, è importante limitare il...

Cellule della microglia sono macrofagi residenti del cervello e svolgono un ruolo in entrambe le condizioni fisiologiche e patologiche1,2. Hanno una morfologia altamente ramificata e sono costantemente estendere e ritrarre i loro processi3,4. Questo comportamento "scansione" si crede di essere connessi e necessari per l'indagine del loro ambiente. La plasticità morfologica di microglia si esprime in tre modalità. In primo luogo, alcuni composti modulano rapidamente microglial morfologia: l'aggiunta di ATP5,6 o NMDA5,7 nel mezzo di balneazione fette del cervello acuto aumenta la complessità delle ramificazioni microglial, considerando che la noradrenalina diminuisce6. Questi effetti sono direttamente mediati dai recettori microglial (per ATP e noradrenalina) o richiedano un rilascio di ATP dai neuroni (per NMDA). In secondo luogo, la velocità di crescita e la ritrazione dei processi microglial, chiamato motilità o "sorveglianza", può essere influenzata da fattori extracellulari8, omeostasi interruzioni9,10o mutazioni9, 10,11. In terzo luogo, oltre a queste modifiche isotropiche di morfologia e la motilità, microglia hanno la capacità di estendere i loro processi direzionalmente verso una pipetta fornire ATP3,5,12, 13 , 14, nella cultura, in fettine di cervello acuto o in vivo, o consegna 5-HT nel cervello acuto fette15. Tale crescita orientata dei processi microglial, chiamato anche motilità direzionale, in primo luogo è stato descritto come una risposta a un locale laser lesione3,4. Pertanto, fisiologicamente, può essere relazionato con la risposta alla lesione o necessaria per il targeting microglial processi verso sinapsi o regioni del cervello che richiedono potatura durante sviluppo15,16, o nel fisiologico17 ,18,19 o situazioni patologiche9,18,19,20 in età adulta. I tre tipi di cambiamenti morfologici si basano su diversi meccanismi intracellulari11,13,20, e un composto dato non necessariamente modula tutti loro (ad es., NMDA, che agisce indirettamente sul microglia, ha un effetto sulla morfologia ma non induce la motilità direzionale5,7). Pertanto, al fine di caratterizzare l'effetto di un composto, una mutazione o una patologia sulla microglia, è importante caratterizzare i tre componenti della loro plasticità morfologica. Qui, descriviamo un metodo per studiare la crescita direzionale dei processi microglial verso una fonte locale di composto, che è, qui, ATP o 5-HT.
Ci sono diversi modelli per lo studio di attrazione dei processi microglia: colture primarie in ambiente 3D6,18,19, cerebrale acuto fette6,13,15e in vivo 3,13di imaging. Approccio in vivo è il migliore per mantenere lo stato fisiologico di microglia. Tuttavia, videomicroscopia imaging di regioni profonde richiede interventi chirurgici complessi e, pertanto, è spesso limitato a strati corticali superficiali. L'uso di colture primarie di microglia è la tecnica più semplice per testare un gran numero di condizioni con un numero limitato di animali. Tuttavia, è Impossibile ottenere la stessa morfologia delle cellule come in vivo, e le cellule perdono la loro interazioni fisiologiche con neuroni e astrociti. Fette del cervello acuto rappresentano un compromesso tra questi due approcci. Questo modello permette ai ricercatori di studiare le strutture cerebrali che altrimenti sono difficili di raggiungere e di immagine ad alta risoluzione in vivo, per indagare fette dalle fasi neonatale, mentre transcranial microscopia è effettuata principalmente nell'età adulta. Infine, rende possibile osservare in tempo reale gli effetti dell'applicazione della droga locale e di ripetere gli esperimenti durante l'utilizzo di un numero limitato di animali. Tuttavia, un problema con le fette di cervello acuto è il tempo limitato (poche ore) durante il quale le cellule rimangono vive, in particolare per le sezioni da topi più vecchi di due settimane e il potenziale di cambiamento della morfologia di microglia sopra tempo21,22 .
Qui, descriviamo un protocollo per preparare fette di cervello acuto di giovani e adulti Cx3cr1GFP / + topi fino a due mesi, con la conservazione della motilità e morfologia di microglia per diverse ore. Abbiamo, quindi, descrivere come utilizzare queste fette per studiare l'attrazione dei processi microglial verso composti come ATP o 5-HT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>for pipettes preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0065</td>
			<td>Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td>Zeitz Instrumente</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride SigmaUltra &#62;99,0% (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>for all the solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 200 mL crystalizing dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mL Pyrex beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Dolethal 50 mg/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers (Whatman)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food box 10 cm diameter, 8 cm Height</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue (ethyl cyanoacrylate)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>super glue 3 power flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampal Tool (spatula)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10099-15</td>
			<td>The largest extremity has to be angled at 90 &#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps (curved)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>For the slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice interface holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating slicer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>720-2709</td>
			<td>Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 32&#176;C (first recovery step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#215; 25 0.95 NA water-immersion objective</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td>HCX Irapo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For 2-photon chamber perfusion with aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td>I1501L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser</td>
			<td>Coherent (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable transfer pipettes , wide mouth</td>
			<td>ThermoFischer scientific</td>
			<td>for example : 232-11</td>
			<td>5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emission filter SP680</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating system</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>Automatic Heater Controller TC-324B</td>
			<td>to maintain perfusion solution at 32&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice holder (&#34;harp&#34;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice stimulation </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-26209</td>
			<td>to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4&#176;C (a few hours) and diluted just before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (optional)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-6377</td>
			<td>use at 1 &#181;M final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>connected to the micropipette holde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>same as for eletrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-9523</td>
			<td>aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20&#176;C. 500&#181;M solution prepared the day of the experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5mL (without needle)</td>
			<td>Terumo medical products</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tubing</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11750105</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482; Tygon&#8482; E-3603 Non-DEHP Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icy</td>
			<td>Institut Pasteur</td>
			<td>http://icy.bioimageanalysis.org</td>
			<td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1-GFP mice</td>
			<td>Jung et al, 2000</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1creER-YFP mice</td>
			<td>Parkhurst et al 2013</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices

Cellule della microglia sono cellule immuni innate residente del cervello che costantemente la scansione loro ambiente con i loro processi lunghi e, al momento di rottura dell'omeostasi, subiscono rapidi cambiamenti morfologici. Ad esempio, una lesione laser induce in pochi minuti una crescita orientata dei processi microglial, chiamato anche "motilità direzionale", verso il luogo della ferita. Un effetto simile può essere ottenuto fornendo localmente ATP o serotonina (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In questo articolo, descriviamo un protocollo per indurre una crescita direzionale dei processi microglial verso un'applicazione locale di ATP o 5-HT in fettine di cervello acuto di topi giovani e adulti e per questa attrazione nel tempo della battuta da microscopia multifotonica. Viene proposto un semplice metodo di quantificazione con software di analisi di immagini gratuito e open-source. Una sfida che ancora caratterizza fette del cervello acuto è il periodo di tempo limitato, diminuisce con l'età, durante il quale le cellule rimangono in uno stato fisiologico. Questo protocollo, quindi, evidenzia alcuni miglioramenti tecnici (sezione imaging camera con un'aspersione doppia interfaccia medio, aria-liquido) volti ad ottimizzare la vitalità delle cellule microgliali sopra parecchie ore, soprattutto in fette da topi adulti.

Questo protocollo descrive un metodo per indurre, osservare e quantificare la crescita orientata dei processi microglial verso un composto applicato localmente, ad esempio, ATP o 5-HT, nel cervello acuto fette da giovane o adulto (almeno fino a due mesi) topi. Tra i fattori che contribuiscono al mantenimento di fette del cervello da animali adulti in uno stato integro per diverse ore è l'uso di due strumenti progettati per ottimizzare la sopravvivenza delle cellule a due passi del protoc...

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Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l'attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Per caratterizzare completamente un fenotipo microgliale, è importante affrontare la motilità sia basale che direzionale. Questo protocollo può essere utilizzato per testare la motilità direzionale delle microglia mediante imaging a due fotoni nelle fette cerebrali dei topi, utilizzando un'interfaccia di stampa 3D personalizzata e camere di perfusione. A dimostrare la procedura saranno Fanny Etienne, dottorando, e Vincenzo Mastriolia, ricercatore post-dottorato, entrambi dei nostri laboratori.Almeno 30 minuti prima della dissezione, iniziare a gorgogliare 70 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale colina, o colina aCSF, sul ghiaccio. Aggiungere 150 millilitri di colina aCSF a 32 gradi Celsius, con carbogeno. Mettere un piatto cristallizzante da 200 millilitri con un magnete a barre in una scatola alimentare sigillata e aggiungere 200 millilitri di aCSF al piatto.Posizionare un supporto per fette di interfaccia stampato in 3D sopra il piatto e rimuovere il liquido in eccesso dalla piastra cristallizzante, fino a quando rimane solo una sottile pellicola di soluzione che copre la rete del supporto della diapositiva dell'interfaccia. Aggiungere alcuni millimetri di aCSF nella parte inferiore della scatola alimentare e iniziare a gorgogliare il fluido con carbogeno. Quindi, chiudere la scatola sigillata mantenendo una carburazione costante per creare una camera di interfaccia umidificata, 95% ossigeno e 5% ricca di anidride carbonica.Dopo la raccolta, posizionare il cervello su un pezzo di carta filtrante imbevuta di ACSF e sezionare la regione di interesse, in base all'angolo di affettamento preferito. Per le fette coronali, posizionare e incollare la faccia caudale del cervello su una piastra di Petri di 10 centimetri attaccata al blocco di taglio di un filtro affettatrice vibrante e posizionare il blocco nella camera del serbatoio dell'affettatrice vibrante all'interno di una grande camera piena di ghiaccio. Riempire il piatto con colina ghiacciata aCSF e utilizzare l'affettatrice per ottenere fette cerebrali spesse 300 micrometri, utilizzando una pipetta di trasferimento monouso di quattro millimetri di diametro dopo ogni passaggio della lama per raccogliere ogni fetta.Lasciare che ogni fetta si riprenda nella colina aCSF aCSF di 32 gradi Celsius per circa 10 minuti dopo che è stata ottenuta, prima di trasferire le fette su pezzi di carta per la pulizia delle lenti, condita con una goccia di colina aCSF. Quindi aspirare l'eccesso di colina aCSF e utilizzare una spatola per trasferire le fette sulla mesh della camera di interfaccia, consentendo alle fette di recuperare in questo ambiente per almeno 30 minuti. 30 minuti prima di iniziare la registrazione, collegare la pompa peristaltica a una camera di registrazione personalizzata con perfusione superiore e inferiore per ottimizzare l'ossigenazione e la vitalità delle fette di tessuto e pulire l'intero sistema di perfusione con 50 millilitri di acqua ultrapura.Al termine del ciclo di pulizia, avviare la perfusione della camera di registrazione con 50 millilitri di aCSF in un bicchiere di vetro sotto costante carbogenazione e utilizzare una pipetta monouso a trasferimento a bocca larga per trasferire la prima fetta da imageizzare sul becher per rimuovere la carta dell'obiettivo. Quando la sezione è affondata nella parte inferiore del becher, trasferire la sezione nella camera di registrazione e posizionare il supporto della fetta sulla fetta per ridurre al minimo il movimento indotto dal flusso di perfusione. Usa l'illuminazione a campo luminoso per indirizzare la regione cerebrale di interesse con un ingrandimento da cinque a 10x.Quindi, utilizzare un obiettivo 25x con un obiettivo ad immersione in acqua 0,35x per regolare la posizione del campo visivo. Utilizzare l'illuminazione a fluorescenza per localizzare le celle microgliali fluorescenti e riempire la pipetta con 10 microlitri di aCSF contenenti il composto di interesse alla sua concentrazione finale. Puntare la punta verso il basso con delicati scuotimenti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella punta e montare la pipetta riempita in un supporto per pipette collegato a una siringa da cinque millilitri con lo stantuffo posizionato in posizione di cinque millilitri e montato su un micromanipolatore a tre assi.Abbassare delicatamente la pipetta verso la fetta, controllando e regolando l'obiettivo contemporaneamente, fino a quando la punta della pipetta tocca leggermente la superficie della fetta. Ora sintonizza il laser e passa il microscopio alla modalità multifotono. Assicurarsi che la camera sia schermata da qualsiasi sorgente luminosa e accendere i rilevatori non descanned.Imposta il guadagno e usa una tabella di ricerca con un limite superiore codificato a colori per evitare di saturare i pixel nell'immagine. Quindi, iniziare a registrare per una durata totale di almeno 30 minuti, deprimendo lentamente lo stantuffo della siringa dalla posizione da cinque a un millilitro, dopo cinque minuti, per un periodo di cinque secondi, per applicare il composto alla sezione. Per l'analisi delle immagini, eseguire prima la proiezione z e la correzione della deriva con ImageJ sul file di interesse.Quindi, aprire il file modificato in Icy e disegnare una regione circolare di diametro di 35 micrometri di interesse, centrata sul sito di iniezione. Esegui di nuovo il film con il ROI, per assicurarti che sia ben posizionato. Quindi, utilizzare il plug-in di evoluzione dell'intensità dell'intensità dell'area di interesse per misurare l'intensità media nel tempo nell'area di interesse e salvare i risultati come file xls.Questo protocollo consente di misurare le risposte indotte da diversi composti, come l'ATP o la serotonina. Sebbene l'iniezione di ATP suscite un aumento della fluorescenza, dopo la maggior parte delle iniezioni di ATP, c'è una diminuzione immediata e leggera della fluorescenza a causa della distorsione tissutale che torna dopo pochi minuti. La dimensione della regione di interesse influisce anche sulla quantificazione, poiché l'aumento del diametro riduce la variabilità tra gli esperimenti, ma diminuisce l'accuratezza e l'entità della risposta rilevata.La valutazione della risposta microgliale in un determinato momento può essere utile per il confronto statistico di diversi composti o per testare gli effetti di specifici antagonisti aggiunti alla soluzione di perfusione. Per quantificare la motilità in tre dimensioni, sappiate che potrebbe essere necessario modificare l'intervallo z-step e la frequenza di campionamento dell'acquisizione per adattarla ai requisiti di analisi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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