Name: two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Мы благодарим клеток и тканей Imaging Institut du Fer à Мулен, где были выполнены все изображения сбора и анализа данных. Эта работа частично поддержали центр Национальной де ла Recherche Scientifique, Институт национального de la Santé et de la Recherche сообщала, наук университета Сорбонна и грантов университеты-Пьер Sorbonne et Мари Кюри университета ( Emergence-UPMC программа 2011-2014), Фонд pour la исследований sur le мозг, Фонд-де-Франс, Фонд pour la Recherche сообщала «Реактор FRM DEQ2014039529», Министерство научных исследований (Agence Nationale pour la исследований Франции Программа «Био-ПСИ Labex» АНР-11-IDEX-0004-02 ANR-17-CE16-0008 и будущее Investissements) и совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Все авторы связаны в исследовательских групп, которые являются членами Парижской школы нейронаук (ENP) и био-ПСИ Labex. Отвязка является аспирантом, аффилированным с Sorbonne Université Collège докторские, F-75005 Париж, Франция и финансируется био-ПСИ-Labex. В.м. является членом после защиты докторской диссертации, финансируемых совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Авторы благодарят Marta Kolodziejczak, которые участвовали в начало проекта.

Все эксперименты были утверждены местным этическим Комитетом (Darwin Комитет, соглашений #1170 и #10921).
1. Подготовка стекла Micropipettes для местного применения соединений
<ol><li>Подготовьте пипетки из боросиликатного стекла тонкостенных капилляров с съемника электродный. Отрегули...

<ol>
	<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth.">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect.">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).</li><li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus.">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).</li><li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Ramification,+Surveillance,+and+Interleukin-1&#946;+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K+Channel+THIK-1.">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1&#946; Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi/o-coupled+P2Y+receptors.">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents.">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li><li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors:+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections.">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner.">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Pfeiffer, T., Avignone, E., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines.">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor.">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP.">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li><li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation,+motility,+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis.">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li><li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microglial+activation:+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices.">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li><li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices:+SNAPSHOT+Method.">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProMoIJ:+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility.">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li><li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice.">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).</li><li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+in+living+brain+slices.">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), 231-239 (1999).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo.">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li><li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke.">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).</li><li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures.">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li></ol>

Поддерживая, в отличие от в отрыве или organotypic срез культуры, структурной целостности с ограниченной сети корректировок, острый мозга фрагменты позволяют исследователям изучить микроглии в их физиологической среде. Однако один из основных недостатков является тот факт, что нарезки про?...

Микроглии клетки мозга-резидентов макрофаги и играть определенную роль в обоих физиологических и патологических условиях1,2. Они имеют весьма разветвленная Словотолкование и постоянно расширяя и втягивания их процессы3,4. Это «сканирования» поведение считается соответствующие и необходимые для обследования их окружение. Морфологическая пластичность микроглии выражается в трех режимах. Во-первых, некоторые соединения быстро модулировать микроглии Морфология: ATP5,6 или NMDA5,7 в средне-купание кусочки острый мозга увеличивает сложность микроглии последствия, в то время как норадреналина уменьшает его6. Эти эффекты являются непосредственно при посредничестве микроглии рецепторов (для СПС и норадреналина) или требуют АТФ-релиз от нейронов (NMDA). Во-вторых скорость роста и втягивание микроглии процессов, называемый подвижности или «надзор», могут быть затронуты внеклеточных факторов8,9,нарушения гомеостаза10или мутации9, 10,11. В-третьих помимо эти изотропной изменения морфологии и моторики, микроглии имеют потенциал для расширения их процессы направленно к пипетки доставки СПС3,5,12, 13 , 14, в культуре, в острой мозга ломтиками или в естественных условиях, или доставки 5-HT в острой мозга ломтики15. Такой ориентированный рост микроглии процессов, также называемый направленного моторики, впервые был описан как ответ на местные лазерной поражения3,4. Таким образом, физиологически, он может быть связанных с ответ на травмы или необходимых для ориентации микроглии процессов к синапсов или регионах мозга, требующие обрезки во время развития15,16, или в физиологических17 ,18,19 или патологических ситуаций9,18,19,20 в зрелом возрасте. Три типа морфологических изменений полагаются на различных внутриклеточных механизмов11,13,20, и один из данного соединения не обязательно модулировать все из них (например, NMDA, который действует косвенно на Микроглии, имеет влияние на морфологию, но не побудить направленного моторики5,7). Поэтому когда целью охарактеризовать воздействие соединение, мутации или патологии на микроглии, важно характеризуют три составляющих их морфологическая пластичность. Здесь мы описываем метод для изучения направления роста микроглии процессов к локальный источник соединения, который находится, здесь, АТФ или 5-HT.
Существует несколько моделей для изучения процессов микроглии притяжения: основных культур в 3D среде6,18,19, острый мозга ломтиками6,13,15и в естественных условиях изображение3,13. В естественных условиях подход является лучшим для сохранения физиологического государств микроглии. Однако прижизненной визуализации глубоких регионов требует сложных хирургических процедур, и, таким образом, это часто ограничивается поверхностных корковых слоев. Использование основной культуры микроглии является простой способ проверить большое количество условий с ограниченным количество животных. Тем не менее это невозможно для получения же морфологии клеток как в естественных условиях, и клетки теряют их физиологические взаимодействия нейронов и астроциты. Острый мозга фрагменты представляют собой компромисс между этими двумя подходами. Эта модель позволяет исследователям для изучения структуры мозга, которые иначе трудно достичь и изображений с высоким разрешением в естественных условиях и расследовать кусочки от новорожденных этапах, тогда как транскраниальной микроскопии осуществляется главным образом в зрелом возрасте. Наконец он делает его возможным для наблюдения в режиме реального времени эффекты применения местных наркотиков и повторить эксперименты, используя ограниченное количество животных. Тем не менее проблема с ломтиками острой мозга является ограниченное время (несколько часов), во время которой клетки остаются живы, особенно для фрагментов от мышей, старше, чем две недели и потенциальные изменения морфологии микроглии течение времени21,22 .
Здесь мы описываем протокол подготовить острый мозга ломтики молодых и взрослых Cx3cr1GFP / + мышей до двух месяцев, с сохранением микроглии морфологии и подвижность на несколько часов. Затем, мы, описывают, как использовать эти фрагменты для изучения притяжения микроглии процессов к соединений, как АТФ или 5-HT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>for pipettes preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0065</td>
			<td>Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td>Zeitz Instrumente</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride SigmaUltra &#62;99,0% (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>for all the solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 200 mL crystalizing dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mL Pyrex beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Dolethal 50 mg/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers (Whatman)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food box 10 cm diameter, 8 cm Height</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue (ethyl cyanoacrylate)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>super glue 3 power flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampal Tool (spatula)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10099-15</td>
			<td>The largest extremity has to be angled at 90 &#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps (curved)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>For the slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice interface holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating slicer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>720-2709</td>
			<td>Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 32&#176;C (first recovery step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#215; 25 0.95 NA water-immersion objective</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td>HCX Irapo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For 2-photon chamber perfusion with aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td>I1501L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser</td>
			<td>Coherent (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable transfer pipettes , wide mouth</td>
			<td>ThermoFischer scientific</td>
			<td>for example : 232-11</td>
			<td>5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emission filter SP680</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating system</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>Automatic Heater Controller TC-324B</td>
			<td>to maintain perfusion solution at 32&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice holder (&#34;harp&#34;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice stimulation </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-26209</td>
			<td>to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4&#176;C (a few hours) and diluted just before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (optional)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-6377</td>
			<td>use at 1 &#181;M final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>connected to the micropipette holde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>same as for eletrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-9523</td>
			<td>aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20&#176;C. 500&#181;M solution prepared the day of the experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5mL (without needle)</td>
			<td>Terumo medical products</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tubing</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11750105</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482; Tygon&#8482; E-3603 Non-DEHP Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icy</td>
			<td>Institut Pasteur</td>
			<td>http://icy.bioimageanalysis.org</td>
			<td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1-GFP mice</td>
			<td>Jung et al, 2000</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1creER-YFP mice</td>
			<td>Parkhurst et al 2013</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices

Клетки микроглии являются резидентов врожденные иммунные клетки головного мозга, которые постоянно сканировать их окружающей среды с их длинные процессы и, после нарушения гомеостаза, претерпевают быстрое морфологические изменения. Например лазер поражением индуцирует в течение нескольких минут ориентированный рост микроглии процессов, также называется «направленного подвижности», к месту травмы. Подобный эффект можно получить путем предоставления локально АТФ или серотонина (5-гидрокситриптамин [5-HT]). В этой статье мы опишем протокол побудить направленный рост микроглии процессов к местного применения СПС или 5-HT в острой мозга ломтики молодых и взрослых мышей и образ этот аттракцион с течением времени путем multiphoton микроскопии. Предложен простой метод количественной оценки с бесплатным и открытым исходным кодом изображения анализа программного обеспечения. Задача, которая по-прежнему характеризует кусочки острый мозга является ограниченное время, уменьшается с возрастом, в ходе которой клетки остаются в состоянии физиологического. Этот протокол, таким образом, освещаются некоторые технические усовершенствования (средний, воздух жидкий интерфейс камеры, изображение камеры с двойной перфузии), направленные на оптимизацию жизнеспособность Микроглии клеток в течение нескольких часов, особенно в ломтики от взрослых мышей.

Этот протокол описывает метод для того чтобы побудить, наблюдать и количественного определения ориентированных на рост микроглии процессов к локально прикладной соединения, например, АТФ или 5-HT, в острой мозга кусочки от молодых или взрослых (по крайней мере до двух м...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Микроглии, резидентов иммунных клеток головного мозга, быстро реагировать с морфологические изменения изменения окружающей их среды. Этот протокол описывает, как использовать двух Фотон микроскопии для изучения притяжения микроглии процессов к серотонина или АТФ в кусочки острый мозга мышей.

Двух Фотон изображений микроглии процессов притяжения к СПС или серотонина в острой мозга фрагментов

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Чтобы в полной мере охарактеризовать микроглиальный фенотип, важно рассмотреть как базальные, так и направленные подвижности. Этот протокол может быть использован для проверки направленной подвижности микроглии с помощью двух фотонной визуализации в срезах мозга мышей, используя индивидуальный интерфейс 3D-печати и перфузионные камеры. Демонстрация процедуры будет Фанни Этьен, аспирант, и Винченцо Mastriolia, пост-докторской исследователь, как из наших лабораторий.По крайней мере за 30 минут до вскрытия, начать восходящей 70 миллилитров холина искусственной спинномозговой жидкости, или холина aCSF, на льду. Добавьте 150 миллилитров холина aCSF при 32 градусах по Цельсию, с карбогеном. Поместите 200 миллилитров кристаллизации блюдо с барным магнитом в запечатанную коробку пищи и добавить 200 миллилитров aCSF к блюду.Поместите 3D печатный интерфейс ломтик держателя на верхней части блюда и удалить избыток жидкости из кристаллизации блюдо, пока только тонкая пленка раствора, охватывающих сетку интерфейса слайд держатель остается. Добавьте несколько миллиметров aCSF в нижней части пищевой коробки и начать восходящей жидкости с карбогеном. Затем закройте запечатанную коробку, сохраняя при этом постоянную карбогенацию, чтобы создать увлажняемую, 95%кислородную, 5%-углеродную камеру интерфейса, богатую углекислым газом.После сбора урожая поместите мозг на кусок пропитанной aCSF фильтровальной бумаги и вскрыть область интереса, в соответствии с предпочтительным углом нарезки. Для корональных ломтиков, положение и клей хвостовой части мозга на 10 сантиметров Петри блюдо прилагается к режущей блок вибрирующий срез, и положение блока в камере резервуара вибрирующий срез в большой камере заполнены льдом. Заполните блюдо ледяным холином aCSF и используйте срез для получения 300-микрометров толщиной ломтиками мозга, используя четырехмиллиметровый диаметр одноразовой трубы передачи после каждого прохода лезвия, чтобы собрать каждый кусочек.Пусть каждый ломтик восстановить в 32 градусов по Цельсию холина aCSF в течение примерно 10 минут после его получения, прежде чем передать ломтики на куски линзы очистки бумаги, увенчанный каплей холина aCSF. Затем аспирировать избыток холина aCSF и использовать шпатель для передачи ломтиков на сетку интерфейсной камеры, что позволяет ломтики восстановить в этой среде, по крайней мере 30 минут. За 30 минут до начала записи подключите перистальтический насос к индивидуальной камере записи с верхней и нижней перфузией для оптимизации оксигенации и жизнеспособности ломтиков тканей и очистите всю систему перфузии 50 миллилитров ультрапурной воды.В конце цикла очистки, начать перфузии камеры записи с 50 миллилитров aCSF в стакане под постоянной карбогенации, и использовать одноразовые, широко ртом передачи пипетки для передачи первого ломтика, чтобы быть изображены в стакан, чтобы удалить бумагу объектива. Когда секция опустилась на дно стакана, перенесите секцию в камеру записи и распорежьте держатель среза на срез, чтобы свести к минимуму движение, вызванное потоком перфузии. Используйте ярко-полевое освещение, чтобы нацеть область мозга, интересную под увеличением от 5 до 10 раз.Затем используйте цель 25x с объективом погружения в воду 0,35x, чтобы отрегулировать положение поля просмотра. Используйте флуоресцентное освещение, чтобы найти флуоресцентные микроглиальные клетки и заполнить пипеткой 10 микролитров aCSF, содержащих соединение интереса при его окончательной концентрации. Наймите наконечник вниз с нежной тряской, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, захваченных в кончике и смонтировать заполненный пипетку в держатель пипетки, подключенный к пятими миллилитровому шприцу с поршенем, расположенным в положении пяти миллилитров и установленным на трехосном микроманипуляторе.Опустите пипетку осторожно к ломтику, контролируя и регулируя цель в то же время, пока наконечник пипетки слегка касается поверхности ломтика. Теперь настройте лазер и переключитесь микроскоп в мультифотонный режим. Убедитесь, что камера экранирована с любого источника света и включите неоканированные детекторы.Установите выигрыш и используйте таблицу осмотра с цветным верхним пределом, чтобы избежать насыщения пикселей на изображении. Затем начните запись на общую продолжительность не менее 30 минут, медленно угнетая поршень шприца из пяти до одного миллилитрового положения, через пять минут, в течение пяти секунд, чтобы применить соединение к разделу. Для анализа изображений сначала выполните z-проекцию и коррекцию дрейфа с ImageJ в файле, представляющих интерес.Затем откройте модифицированный файл в Icy и нарисуйте круглую область диаметром 35 микрометров, которая будет сосредоточена над местом инъекции. Запустите фильм снова с рентабельностью инвестиций, чтобы убедиться, что он хорошо расположен. Затем используйте плагин эволюции интенсивности интереса для измерения среднего интенсивности с течением времени в области интереса, и сохранить результаты в виде файла xls.Этот протокол позволяет измерять реакции, индуцированные различными соединениями, такими как АТФ или серотонин. Хотя инъекция АТФ вызывает увеличение флуоресценции, после большинства инъекций АТФ, есть немедленное, небольшое снижение флуоресценции из-за искажения тканей, который возвращается через несколько минут. Размер области, представляющий интерес, также влияет на количественную оценку, поскольку увеличение диаметра снижает изменчивость экспериментов, но снижает точность и масштабы обнаруженной реакции.Оценка микроглиальной реакции в определенный момент времени может быть полезна для статистического сравнения различных соединений или для проверки воздействия конкретных антагонистов, добавленных в раствор перфузии. Чтобы количественно оценить подвижность в трех измерениях, знайте, что, возможно, придется изменить интервал z-шага и скорость выборки приобретения, чтобы соответствовать требованиям анализа.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Изображение внутриклеточного АТФ в органотипических фрагментах мышечного мозга с помощью датчика ATeam1.03YEMK на основе FRET

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...