Name: two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Agradecemos a la célula y tejido de imágenes de la Institut du Fer à Moulin, donde se han realizado todos los análisis y adquisición de la imagen. Este trabajo ha sido apoyado en parte por el Centre National de la Recherche Scientifique, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, las Ciencias de la Universidad de Sorbonne y por donaciones de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Universidad ( Programa Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", el Ministerio francés de la investigación (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 y el Avenir Investissements programa "Bio-Psy empresa Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) y una investigación en colaboración en el programa de neurociencia computacional, Agencia Nacional de la ciencia francés Fundación Nacional para la investigación (número: 1515686). Todos los autores están afiliados a la investigación de los grupos que son miembros de la escuela de París de Neurociencia (PEV) y de la empresa Labex Bio-Psy. F.E. es estudiante de doctorado asociado a Sorbonne Université, Colegio Doctoral, F-75005 París, Francia y está financiado por la empresa Labex Bio-Psy. V.M. es becario posdoctoral financiado por la investigación colaborativa en el programa de neurociencia computacional, Agencia Nacional de la ciencia francés Fundación Nacional para la investigación (número: 1515686). Los autores agradecen a Marta Kolodziejczak que participaron en la iniciación del proyecto.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética local (Comité de Darwin, acuerdos #1170 y #10921).
1. preparación de Micropipetas de vidrio para la aplicación Local de compuestos
<ol><li>Preparar pipetas de borosilicato Capillares de vidrio de pared delgada con un tirador de electrodo. Ajustar los parámetros para obtener pipetas con un 4-5 μm de diámetro en su extremo. Figura 2D muestra una pipeta en trasmitida en la ampliación baja.</li>...

<ol>
	<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth.">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect.">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).</li><li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus.">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).</li><li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Ramification,+Surveillance,+and+Interleukin-1&#946;+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K+Channel+THIK-1.">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1&#946; Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi/o-coupled+P2Y+receptors.">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents.">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li><li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors:+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections.">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner.">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Pfeiffer, T., Avignone, E., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines.">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor.">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP.">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li><li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation,+motility,+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis.">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li><li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microglial+activation:+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices.">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li><li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices:+SNAPSHOT+Method.">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProMoIJ:+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility.">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li><li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice.">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).</li><li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+in+living+brain+slices.">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), 231-239 (1999).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo.">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li><li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke.">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).</li><li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures.">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li></ol>

Al mantener, a diferencia de en disociado o organotypic de la rebanada cultura, una integridad estructural con los ajustes de red limitada, rebanadas de cerebro agudo permiten a los investigadores para el estudio de microglia en su entorno fisiológico. Sin embargo, una de las limitaciones más importantes es el hecho de que el procedimiento de corte crea lesiones que rápidamente pueden poner en peligro la viabilidad de las neuronas, especialmente en el cerebro adulto. Como microglia son particularmente reactivas a dañ...

Las células microgliales son macrófagos residentes del cerebro y desempeñan un papel en ambas condiciones fisiológicas y patológicas1,2. Tienen una morfología muy ramificada y son constantemente ampliando y contrayendo sus procesos3,4. Este comportamiento de "análisis" se cree para ser relacionados y necesarios para el estudio de su entorno. La plasticidad morfológica de microglía se expresa de tres modos. En primer lugar, algunos compuestos rápidamente modulan la morfología microglial: la adición de ATP5,6 o NMDA5,7 en el medio que baña las rebanadas de cerebro agudo incrementa la complejidad de las ramificaciones de la microglía, mientras que la noradrenalina disminuye6. Estos efectos son directamente mediados por receptores de la microglía (para ATP y de la noradrenalina) o requieren una liberación de ATP de las neuronas (para NMDA). En segundo lugar, la velocidad de crecimiento y retracción de procesos microglial, llamado "vigilancia", o la motilidad puede ser afectada por factores extracelulares8homeostasis interrupciones9,10y mutaciones9, 10,11. En tercer lugar, además de estos cambios isotrópicos de la morfología y motilidad, microglia tienen la capacidad de extender sus procesos direccionalmente hacia una pipeta entrega ATP3,5,12, 13 , 14, en la cultura, en rebanadas de cerebro agudo o en vivo, o entrega 5-HT en rebanadas de cerebro agudo15. Tal crecimiento orientado de los procesos de microglial, también llamado motilidad direccional, primero fue descrito como una respuesta a una lesión local laser3,4. Por lo tanto, fisiológico, puede ser relacionado con la respuesta a la lesión o necesaria para dirigir procesos de microglial hacia las sinapsis o las regiones del cerebro que requieren poda durante desarrollo15,16, o enfisiológicas 17 ,18,19 o situaciones patológicas9,18,19,20 en la edad adulta. Los tres tipos de cambios morfológicos se basan en diferentes mecanismos intracelulares11,13,20y un compuesto determinado no necesariamente modular todas ellas (por ejemplo, NMDA, que actúa indirectamente sobre microglia, tiene un efecto en la morfología pero no induce motilidad direccional5,7). Por lo tanto, cuando con el objetivo de caracterizar el efecto de un compuesto, una mutación o una patología en la microglia, es importante caracterizar los tres componentes de su plasticidad morfológica. Aquí, describimos un método para estudiar el crecimiento direccional de microglial procesos hacia una fuente local del compuesto, que es, aquí, ATP o 5-HT.
Hay varios modelos para estudiar la atracción de los procesos microglia: cultivos primarios en entorno 3D6,18,19, cerebral aguda rebanadas6,13,15y en vivo proyección de imagen3,13. El enfoque en vivo es lo mejor para preservar el estado fisiológico de la microglia. Sin embargo, la proyección de imagen intravital de regiones profundas requiere procedimientos quirúrgicos complejos y, por lo tanto, a menudo se limita a las capas corticales superficiales. El uso de cultivo primario de la microglia es la técnica más sencilla para probar un gran número de condiciones con un número limitado de animales. Sin embargo, es imposible obtener la misma morfología de la célula como en vivo, y las células pierden sus interacciones fisiológicas con neuronas y astrocitos. Rebanadas de cerebro agudo representan un compromiso entre estos dos enfoques. Este modelo permite a los investigadores a estudiar las estructuras del cerebro que de lo contrario son difíciles de llegar y a la imagen con alta resolución en vivo e investigar rebanadas de etapas neonatales, mientras que la microscopía transcraneal se realiza sobre todo en la edad adulta. Por último, permite observar en tiempo real los efectos de la aplicación local de la droga y a repetir experimentos utilizando un número limitado de animales. Sin embargo, un problema con las rebanadas de cerebro agudo es el poco tiempo (unas horas) durante el cual las células siguen vivas, en particular para rebanadas de ratones más de dos semanas y el potencial cambio de morfología de la microglia por vez21,22 .
Aquí, describimos un protocolo para preparar rebanadas de cerebro agudo de jóvenes y adultos Cx3cr1GFP / + ratones hasta dos meses de edad, con la preservación de la morfología de la microglia y motilidad durante varias horas. A continuación, describimos cómo usar estas láminas para estudiar la atracción de los procesos de microglial hacia compuestos como ATP o 5-HT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>for pipettes preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0065</td>
			<td>Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td>Zeitz Instrumente</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride SigmaUltra &#62;99,0% (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>for all the solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 200 mL crystalizing dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mL Pyrex beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Dolethal 50 mg/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers (Whatman)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food box 10 cm diameter, 8 cm Height</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue (ethyl cyanoacrylate)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>super glue 3 power flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampal Tool (spatula)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10099-15</td>
			<td>The largest extremity has to be angled at 90 &#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps (curved)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>For the slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice interface holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating slicer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>720-2709</td>
			<td>Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 32&#176;C (first recovery step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#215; 25 0.95 NA water-immersion objective</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td>HCX Irapo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For 2-photon chamber perfusion with aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td>I1501L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser</td>
			<td>Coherent (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable transfer pipettes , wide mouth</td>
			<td>ThermoFischer scientific</td>
			<td>for example : 232-11</td>
			<td>5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emission filter SP680</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating system</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>Automatic Heater Controller TC-324B</td>
			<td>to maintain perfusion solution at 32&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice holder (&#34;harp&#34;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice stimulation </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-26209</td>
			<td>to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4&#176;C (a few hours) and diluted just before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (optional)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-6377</td>
			<td>use at 1 &#181;M final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>connected to the micropipette holde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>same as for eletrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-9523</td>
			<td>aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20&#176;C. 500&#181;M solution prepared the day of the experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5mL (without needle)</td>
			<td>Terumo medical products</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tubing</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11750105</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482; Tygon&#8482; E-3603 Non-DEHP Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icy</td>
			<td>Institut Pasteur</td>
			<td>http://icy.bioimageanalysis.org</td>
			<td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1-GFP mice</td>
			<td>Jung et al, 2000</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1creER-YFP mice</td>
			<td>Parkhurst et al 2013</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices

Las células microgliales son residente células inmunes innatas del cerebro que exploración su entorno con sus largos procesos y constantemente, con disrupción de la homeostasis, experimentan rápidos cambios morfológicos. Por ejemplo, una lesión de láser induce en pocos minutos un crecimiento orientado de los procesos de microglial, también llamado "motilidad direccional", hacia el sitio de la lesión. Un efecto similar puede obtenerse mediante la entrega localmente ATP o serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]). En este artículo se describe un protocolo para inducir un crecimiento direccional de microglial procesos hacia una aplicación local de ATP o 5-HT en rebanadas de cerebro agudo de ratones jóvenes y adultos y a esta atracción con el tiempo la imagen por microscopía multifotón. Se propone un método simple de cuantificación con software de análisis de imágenes gratis y de código abierto. El tiempo limitado, disminuyendo con la edad, durante el cual las células permanecen en un estado fisiológico es un reto que todavía caracteriza a rebanadas de cerebro agudo. Este protocolo, por lo tanto, destacan algunas mejoras técnicas (cámara de medio interfaz aire-líquido, cámara con una doble la perfusión de la proyección de imagen) para optimizar la viabilidad de las células microgliales durante varias horas, especialmente en sectores de ratones adultos.

Este protocolo describe un método para inducir, observar y cuantificar el crecimiento orientado de microglial procesos hacia un compuesto localmente aplicado, por ejemplo, ATP o 5-HT, en cerebral aguda tajadas de joven o adulto (al menos hasta dos meses) ratones. Entre los factores que contribuyen al mantenimiento de rodajas de cerebro de animales adultos en un estado saludable durante varias horas es el uso de dos herramientas diseñadas para optimizar la supervivencia de la célula a d...

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Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, las células inmunes residentes del cerebro, responde rápidamente con cambios morfológicos a modificaciones de su entorno. Este protocolo describe cómo usar microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de procesos de microglial hacia serotonina o ATP en rebanadas de cerebro agudo de ratones.

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Para caracterizar completamente un fenotipo microglial, es importante abordar la motilidad basal y direccional. Este protocolo se puede utilizar para probar la motilidad direccional de la microglia mediante imágenes de dos fotones en rodajas cerebrales de ratones, utilizando cámaras de impresión 3D personalizadas y cámaras de perfusión. Demostrando el procedimiento estarán Fanny Etienne, estudiante de doctorado, y Vincenzo Mastriolia, investigador postdoctoral, ambos de nuestros laboratorios.Al menos 30 minutos antes de la disección, empezar a burbujear 70 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial colina, o colina aCSF, en hielo. Añadir 150 mililitros de colina aCSF a 32 grados Celsius, con carbógeno. Coloque un plato cristalizante de 200 mililitros con un imán de barra en una caja de alimentos sellada y agregue 200 mililitros de aCSF al plato.Coloque un soporte de rebanada de interfaz impreso en 3D en la parte superior del plato y retire el exceso de líquido de la placa cristalizante, hasta que sólo quede una fina película de solución que cubra la malla del portaobjetos de interfaz. Agregue unos milímetros de aCSF en la parte inferior de la caja de alimentos y comience a burbujear el líquido con carbógeno. A continuación, cierre la caja sellada mientras mantiene la carbogenación constante para crear una cámara de interfaz humidificada, 95%oxígeno y 5%rica en dióxido de carbono.Después de la cosecha, coloque el cerebro en un pedazo de papel de filtro empapado en aCSF y diseccione la región de interés, de acuerdo con el ángulo preferido de corte. Para las rodajas coronales, coloque y pegue la cara caudal del cerebro en un plato de Petri de 10 centímetros unido al bloque de corte de una cortadora vibratoria, y coloque el bloque en la cámara del depósito de la cortadora vibratoria dentro de una cámara grande llena de hielo. Llene el plato con aCSF de colina helada y use la cortadora para obtener rodajas cerebrales de 300 micrómetros de espesor, usando una pipeta de transferencia desechable de cuatro milímetros de diámetro después de cada pasada de la hoja para recoger cada rebanada.Deje que cada rebanada se recupere en el 32 grados Celsius colina aCSF durante unos 10 minutos después de que se obtiene, antes de transferir las rodajas en trozos de papel de limpieza de la lente, cubierto con una gota de colina aCSF. A continuación, aspirar el exceso de colina aCSF y utilizar una espátula para transferir las rebanadas en la malla de la cámara de interfaz, permitiendo que las rebanadas se recuperen en este entorno durante al menos 30 minutos. 30 minutos antes de iniciar la grabación, conecte la bomba peristáltica a una cámara de grabación personalizada con perfusión superior e inferior para optimizar la oxigenación y viabilidad de las rodajas de tejido, y limpie todo el sistema de perfusión con 50 mililitros de agua ultrapura.Al final del ciclo de limpieza, inicie la perfusión de la cámara de grabación con 50 mililitros de aCSF en un vaso de precipitados de vidrio bajo carbogenación constante, y utilice una pipeta desechable de transferencia de boca ancha para transferir la primera rebanada a ser imagen al vaso de precipitados para retirar el papel de la lente. Cuando la sección se haya hundido en la parte inferior del vaso de precipitados, transfiera la sección a la cámara de grabación y coloque el soporte de la rebanada en la rebanada para minimizar el movimiento inducido por el flujo de perfusión. Usa la iluminación de campo brillante para apuntar a la región cerebral de interés bajo un aumento de cinco a 10 veces.A continuación, utilice un objetivo de 25x con una lente de inmersión en agua de 0,35x para ajustar la posición del campo de visión. Utilice la iluminación de fluorescencia para localizar las células microgliales fluorescentes y rellenar la pipeta con 10 microlitros de aCSF que contienen el compuesto de interés en su concentración final. Apunte la punta hacia abajo con un suave temblor para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la punta y monte la pipeta llena en un soporte de pipeta conectado a una jeringa de cinco mililitros con el émbolo colocado en la posición de cinco mililitros y montado en un micromanipulador de tres ejes.Baje la pipeta suavemente hacia la rebanada, controlando y ajustando el objetivo al mismo tiempo, hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la superficie de la rebanada. Ahora afina el láser y cambia el microscopio al modo multifono. Asegúrese de que la cámara esté filtrada desde cualquier fuente de luz y encienda los detectores no predefinidos.Establezca la ganancia y utilice una tabla de búsqueda con un límite superior codificado por colores para evitar saturar los píxeles de la imagen. A continuación, comience a grabar durante una duración total de al menos 30 minutos, presionando lentamente el émbolo de la jeringa de la posición de cinco a un mililitro, después de cinco minutos, durante un período de cinco segundos, para aplicar el compuesto a la sección. Para el análisis de imágenes, primero realice la proyección z y la corrección de deriva con ImageJ en el archivo de interés.A continuación, abra el archivo modificado en Icy y dibuje una región circular de 35 micrómetros de diámetro de interés, centrada sobre el lugar de inyección. Ejecute la película de nuevo con el ROI, para asegurarse de que está bien posicionada. A continuación, utilice el plugin de evolución de la intensidad de la región de interés para medir la intensidad media a lo largo del tiempo en la región de interés, y guarde los resultados como un archivo xls.Este protocolo permite medir las respuestas inducidas por diferentes compuestos, como ATP o serotonina. Aunque la inyección de ATP provoca un aumento de la fluorescencia, después de la mayoría de las inyecciones de ATP, hay una disminución inmediata, leve en la fluorescencia debido a la distorsión del tejido que vuelve después de unos minutos. El tamaño de la región de interés también afecta a la cuantificación, ya que el aumento del diámetro reduce la variabilidad entre los experimentos, pero disminuye la precisión y magnitud de la respuesta detectada.La evaluación de la respuesta microglial en un momento específico puede ser útil para la comparación estadística de diferentes compuestos, o para probar los efectos de antagonistas específicos añadidos a la solución de perfusión. Para cuantificar la motilidad en tres dimensiones, sepa que puede tener que cambiar el intervalo del paso z y la tasa de muestreo de la adquisición para que se ajuste a los requisitos de análisis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

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In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imagen de ATP intracelular en rebanadas de tejido organotípico del cerebro del ratón utilizando el sensor basado en FRET ATeam1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...