Name: two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Vi tackar Cell och vävnad Imaging anläggning av Institut du Fer à Moulin, där alla bild förvärv och analys har utförts. Detta arbete har stötts i del av den Centre National de la Recherche Scientifique, den Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université vetenskaperna, och genom bidrag från Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie universitetar () Emergence-UPMC program 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale ”Equipe FRM DEQ2014039529”, det franska ministeriet för forskning (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 och den Investissements pris programmet ”Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) och en forskningssamverkan i Tillämpad neurovetenskap program, National Science Foundation/franska nationella byrån för forskning (nummer: 1515686). Alla författarna är anslutna för att forska i grupper som är medlemmar av den Paris skola för neurovetenskap (EGP) och de Bio-Psy Labex. F.E. är doktorand knuten till Sorbonne Université, Collège forskarnivå, F-75005 Paris, Frankrike, och finansieras av den Bio-Psy Labex. V.M. är en post-doc Karl som finansieras av den forskningssamverkan i Tillämpad neurovetenskap program, National Science Foundation/franska nationella byrån för forskning (nummer: 1515686). Författarna vill tacka Marta Kolodziejczak som deltog i inledningen av projektet.

Alla experiment godkändes av den lokala etiska kommittén (Darwin kommittén, avtal #1170 och #10921).
1. beredning av glas Mikropipetter för den lokala tillämpningen av föreningar
<ol><li>Förbereda pipetter från Borsilikat tunnväggiga glas kapillärer med en elektrod avdragare. Justera parametrarna för att erhålla pipetter med en 4-5 µm diameter på deras extremiteter. Figur 2D visar en pipett i brightfield vid låg förstoring.</li>
</ol><p class="jo...

<ol>
	<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+NMDA+receptors+triggers+transient+ATP-mediated+microglial+process+outgrowth.">Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Hristovska, I., Pascual, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Resting+Microglial+Morphology+and+Process+Motility+from+a+Synaptic+Prospect.">Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).</li><li>Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+morphological+dynamics+of+activated+microglia+after+induction+of+status+epilepticus.">Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).</li><li>Madry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Ramification,+Surveillance,+and+Interleukin-1&#946;+Release+Are+Regulated+by+the+Two-Pore+Domain+K+Channel+THIK-1.">Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1&#946; Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1.</a> Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+or+ADP+induce+chemotaxis+of+cultured+microglia+through+Gi/o-coupled+P2Y+receptors.">Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-induced+chemotaxis+of+microglial+processes+requires+P2Y+receptor-activated+initiation+of+outward+potassium+currents.">ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents.</a> Glia. 55 (8), 810-821 (2007).</li><li>Kolodziejczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+Modulates+Developmental+Microglia+via+5-HT+2BReceptors:+Potential+Implication+during+Synaptic+Refinement+of+Retinogeniculate+Projections.">Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Sculpt+Postnatal+Neural+Circuits+in+an+Activity+and+Complement-Dependent+Manner.">Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Pfeiffer, T., Avignone, E., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hippocampal+long-term+potentiation+increases+the+morphological+dynamics+of+microglial+processes+and+prolongs+their+contacts+with+dendritic+spines.">Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines.</a> Scientific Reports. 6, 32422 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Promote+Learning-Dependent+Synapse+Formation+through+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor.">Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Ohsawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y12+receptor-mediated+integrin-beta1+activation+regulates+microglial+process+extension+induced+by+ATP.">P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP.</a> Glia. 58 (7), 790-801 (2010).</li><li>Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation,+motility,+and+homing+of+neonatal+microglia+to+injured+neurons+does+not+require+protein+synthesis.">Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis.</a> Glia. 54 (1), 58-70 (2006).</li><li>Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microglial+activation:+a+confocal+time-lapse+analysis+in+hippocampal+slices.">Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices.</a> Glia. 33 (3), 256-266 (2001).</li><li>Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+Immunolabeling+of+Brain+Slices:+SNAPSHOT+Method.">Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method.</a> Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Paris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProMoIJ:+A+new+tool+for+automatic+three-dimensional+analysis+of+microglial+process+motility.">ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility.</a> Glia. 66 (4), 828-845 (2018).</li><li>Pagani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+microglial+development+in+the+hippocampus+of+Cx3cr1+deficient+mice.">Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).</li><li>Mainen, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+in+living+brain+slices.">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18 (2), 231-239 (1999).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Gyoneva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+inflammation+regulates+microglial+responses+to+tissue+damage+in+vivo.">Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo.</a> Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).</li><li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Morphological+Analysis+of+Microglia+After+Stroke.">Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).</li><li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures.">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li></ol>

Genom att bibehålla, till skillnad från i skiljas eller organotypic skiva kultur, en strukturell integritet med begränsat nätverk justeringar, akut hjärnskada skivor tillåter forskare att studera mikroglia i deras fysiologiska miljö. En av de stora begränsningarna är dock det faktum att förfarandet för skivning skapar skador som snabbt kan äventyra livskraften hos nervceller, särskilt i den vuxna hjärnan. Mikroglia är särskilt reaktiva till cellskador, är det viktigt att begränsa neuronal celldöd som m...

Mikrogliaceller är hjärnans bosatta makrofager och spela en roll i både fysiologiska och patologiska förhållanden1,2. De är har en starkt förgrenade morfologi ständigt utvidga och infällbara deras processer3,4. Problemet ”skanning” tros vara relaterade och nödvändigt att undersökningen av sin omgivning. Morfologiska plasticitet av mikroglia uttrycks i tre lägen. Först, vissa föreningar snabbt modulerar mikrogliala morfologi: tillägg av ATP5,6 eller NMDA5,7 medium bad akut hjärnskada skivor ökar komplexiteten i mikrogliala förgreningar, medan noradrenalin minskar det6. Dessa effekter antingen förmedlas direkt av mikrogliala receptorer (för ATP och noradrenalin) eller kräver en ATP-release från nervceller (för NMDA). Det andra kan mikrogliala processer, kallas motilitet eller ”övervakning”, tillväxt och upprullning hastighet påverkas av extracellulära faktorer8, homeostas störningar9,10eller mutationer9, 10,11. För det tredje, utöver dessa isotropiskt ändringar av morfologi och motilitet, mikroglia har kapacitet att utöka sina processer directionally mot en pipett som levererar ATP3,5,12, 13 , 14, i kulturen, i akut hjärnskada skivor eller in vivo, eller leverera 5-HT i akut hjärnskada skivor15. Sådan orienterad tillväxt av mikrogliala processer, även kallad riktad motilitet, beskrevs först som ett svar på en lokal laser lesion3,4. Således, fysiologiskt, det kan vara relaterade till svaret till skada eller krävs för att rikta mikrogliala processer mot synapser eller regioner i hjärnan som kräver beskärning under utveckling15,16, eller i fysiologiska17 ,18,19 eller patologiska situationer9,18,19,20 i vuxen ålder. De tre typerna av morfologiska förändringar lita på olika intracellulära mekanismer11,13,20, och en viss förening nödvändigtvis modulera inte dem (t.ex. NMDA, som verkar indirekt på alla mikroglia, har en effekt på Morfologi men inducerar inte riktad motilitet5,7). Därför, när syftar till att karakterisera effekten av en förening, en mutation eller en patologi på mikroglia, det är viktigt att karakterisera de tre komponenterna i deras morfologiska plasticitet. Här, beskriver vi en metod för att studera riktad tillväxten av mikrogliala processer mot en lokal källa av förening, som är, här, ATP eller 5-HT.
Det finns flera modeller att studera mikroglia processerna attraktion: primära kulturer i 3D-miljö6,18,19, akut hjärnskada skivor6,13,15, och i vivo Imaging3,13. Metoden i vivo är bäst att bevara det fysiologiska tillståndet av mikroglia. Dock intravital avbildning av djupa regioner kräver komplexa kirurgiska ingrepp, och därför är det ofta begränsade till ytliga kortikala lager. Användning av mikroglia primära kultur är den lättaste tekniken att testa ett stort antal villkor med ett begränsat antal djur. Dock är det omöjligt att få den samma cellmorfologi som i vivo och celler förlorar sin fysiologiska interaktioner med nervceller och astrocyter. Akut hjärnskada segment utgör en kompromiss mellan dessa två synsätt. Denna modell tillåter forskare att studera hjärnstrukturer som annars är svåra att nå bild med hög upplösning i vivo, och att undersöka skivor från neonatal stadier, medan transkraniell mikroskopi utförs mestadels vid vuxen ålder. Slutligen, det gör det möjligt att följa i realtid effekterna av lokal drog tillämpning, och upprepa experiment när du använder ett begränsat antal djur. Ett problem med akut hjärnskada skivor är dock begränsad tid (några timmar) under vilka celler förblir levande, särskilt för skivor från möss som är äldre än två veckor, och den eventuella ändringen av mikroglia morfologi över tid21,22 .
Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda akut hjärnskada skivor av unga och vuxna Cx3cr1GFP / + möss upp till två månader gammal, med bevarandet av mikroglia morfologi och motilitet i flera timmar. Sedan beskriver vi, hur man använder dessa skivor för att studera attraktion av mikrogliala processer mot föreningar som ATP eller 5-HT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>for pipettes preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0065</td>
			<td>Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td>Zeitz Instrumente</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride SigmaUltra &#62;99,0% (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>for all the solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 200 mL crystalizing dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mL Pyrex beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Dolethal 50 mg/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers (Whatman)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA1001042</td>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food box 10 cm diameter, 8 cm Height</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue (ethyl cyanoacrylate)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>super glue 3 power flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampal Tool (spatula)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10099-15</td>
			<td>The largest extremity has to be angled at 90 &#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps (curved)</td>
			<td>Moria</td>
			<td>MC31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 7 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>For the slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice interface holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating slicer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>720-2709</td>
			<td>Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 32&#176;C (first recovery step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#215; 25 0.95 NA water-immersion objective</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td>HCX Irapo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antlia-3C Digital Peristaltic pump</td>
			<td>DD Biolab</td>
			<td>178961</td>
			<td>For 2-photon chamber perfusion with aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td>
			<td>Air Liquide France Industrie</td>
			<td>I1501L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser</td>
			<td>Coherent (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable transfer pipettes , wide mouth</td>
			<td>ThermoFischer scientific</td>
			<td>for example : 232-11</td>
			<td>5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emission filter SP680</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection)</td>
			<td>Leica Microsystems (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating system</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>Automatic Heater Controller TC-324B</td>
			<td>to maintain perfusion solution at 32&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice holder (&#34;harp&#34;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for slice stimulation </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-26209</td>
			<td>to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4&#176;C (a few hours) and diluted just before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (optional)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-6377</td>
			<td>use at 1 &#181;M final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>connected to the micropipette holde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>same as for eletrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serotonin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-9523</td>
			<td>aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20&#176;C. 500&#181;M solution prepared the day of the experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5mL (without needle)</td>
			<td>Terumo medical products</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tubing</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11750105</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482; Tygon&#8482; E-3603 Non-DEHP Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icy</td>
			<td>Institut Pasteur</td>
			<td>http://icy.bioimageanalysis.org</td>
			<td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1-GFP mice</td>
			<td>Jung et al, 2000</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1creER-YFP mice</td>
			<td>Parkhurst et al 2013</td>
			<td></td>
			<td>male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of microglial processes' attraction toward atp or serotonin in acute brain slices

Mikrogliaceller är bosatta innate immuna celler i hjärnan som ständigt skannar omgivningen med sin långa processer och, vid avbrott i homeostas, genomgå snabba morfologiska förändringar. Till exempel inducerar en laser-lesion på några minuter en orienterad tillväxt av mikrogliala processer, även kallad ”riktad motilitet”, mot platsen för skadan. En liknande effekt kan erhållas genom att leverera lokalt ATP eller serotonin (5-hydroxytryptamin [5-HT]). I den här artikeln beskriver vi ett protokoll att framkalla en riktad tillväxt av mikrogliala processer mot en lokal tillämpning av ATP eller 5-HT i akut hjärnskada skivor av unga och vuxna möss och att bilden denna attraktion över tiden av multiphoton mikroskopi. En enkel metod för kvantifiering med fri och öppen källkod bild analys programvara föreslås. En utmaning som fortfarande kännetecknar akut hjärnskada skivor är den begränsade tid, minskar med åldern, under vilka celler förblir i ett fysiologiskt tillstånd. Detta protokoll, således höjdpunkter några tekniska förbättringar (medium, luft-vätska gränssnitt avdelningen imaging kammare med en dubbel perfusion) som syftar till att optimera lönsamheten för mikrogliaceller över flera timmar, särskilt i skivor från vuxna möss.

Det här protokollet beskriver en metod för att framkalla, iaktta och kvantifiera orienterade tillväxten av mikrogliala processer mot ett lokalt tillämpade förening, exempelvis ATP eller 5-HT, i akut hjärnskada skivor från ung eller vuxen (minst upp till två månader gamla) möss. Bland de faktorer som bidrar till att upprätthålla hjärnan skivor från vuxna djur i felfritt tillstånd i flera timmar är användningen av två verktyg för att optimera cellöverlevnad två stegen i...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Mikroglia, bosatt immuncellerna i hjärnan, svara snabbt med morfologiska förändringar ändringar av deras miljö. Det här protokollet beskriver hur man använder två-foton mikroskopi för att studera attraktion av mikrogliala processer mot serotonin eller ATP i akut hjärnskada skivor av möss.

Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

För att fullt ut karakterisera en mikroglial fenotyp är det viktigt att ta itu med både basala och riktad motilitet. Detta protokoll kan användas för att testa riktningsmotiliteten hos mikroglia genom tvåfotonavbildning i möss hjärnskivor, med hjälp av anpassade 3D-utskriftsgränssnitt och perfusionskammare. Demonstrerar förfarandet kommer att Vara Fanny Etienne, en doktorand, och Vincenzo Mastriolia, en post-doktoral forskare, båda från våra laboratorier.Minst 30 minuter före dissektionen, börja bubbla 70 milliliter av kolin konstgjorda ryggmärgsvätskan, eller kolin aCSF, på is. Tillsätt 150 milliliter kolin aCSF vid 32 grader Celsius, med karbiogen. Placera en 200 milliliter kristalliserande maträtt med en bar magnet i en förseglad matlåda och tillsätt 200 milliliter aCSF till skålen.Placera en 3D tryckt gränssnitt skiva hållare ovanpå skålen och ta bort överflödig vätska från kristalliserande skålen, tills endast en tunn film av lösning som täcker nätet av gränssnittet glidhållaren kvar. Tillsätt några millimeter aCSF längst ner i matlådan och börja bubbla vätskan med karbiogen. Stäng sedan den förseglade lådan samtidigt som konstant karbiogenering för att skapa en fuktad, 95%syre, 5%-koldioxidrik gränssnittskammare.Efter skörd, placera hjärnan på en bit av aCSF-indränkt filterpapper och dissekera regionen av intresse, enligt den föredragna vinkeln för skivning. För koronala skivor, position och lim hjärnans caudal ansikte på en 10 centimeter Petri skålen fäst vid skärblocket av en vibrerande skivare, och placera blocket i reservoaren kammaren av vibrerande skivare i en stor kammare fylld med is. Fyll skålen med iskall kolin aCSF och använda slicer för att få 300-mikrometer tjocka hjärnan skivor, med hjälp av en fyra millimeter diameter disponibel överföring pipett efter varje pass av bladet för att samla varje skiva.Låt varje skiva återhämta sig i 32 grader Celsius kolin aCSF för ca 10 minuter efter det erhålls, innan överföring av skivor på bitar av lins rengöring papper, toppad med en droppe kolin aCSF. Sedan aspirera överskottet kolin aCSF och använda en spatel för att överföra skivorna på nätet av gränssnittet kammaren, vilket gör att skivorna att återhämta sig i denna miljö i minst 30 minuter. 30 minuter innan inspelningen påbörjas, anslut peristaltiska pumpen till en anpassad inspelningskammare med topp och bottenperfusion för optimering av syresättning och viabilitet av vävnadsskivorna, och rengör hela perfusionssystemet med 50 milliliter ultrarent vatten.I slutet av rengöringscykeln, starta perfusionen av inspelningskammaren med 50 milliliter aCSF i en glasbägare under konstant karbiogenering, och använd en engångs, wide-mun överföringspipett för att överföra den första skiva att avbildas till bägaren för att ta bort linsen papper. När sektionen har sjunkit till bägarens botten, överför du sektionen till inspelningskammaren och placerar skivhållaren på skiva för att minimera rörelse som framkallas av perfusionsflödet. Använd ljus-fält belysning för att rikta hjärnan regionen av intresse under en fem till 10x förstoring.Sedan använder en 25x målsättning med en 0.35x vatten nedsänkning lins för att justera positionen för visningsfältet. Använd fluorescensbelysning för att lokalisera de fluorescerande mikroglialcellerna och fyll ut pipetten med 10 mikroliter av aCSF som innehåller den intresseförening som är av intresse vid dess slutliga koncentration. Rikta spetsen nedåt med varsam skakning för att avlägsna eventuella luftbubblor som fastnat i spetsen och montera den fyllda pipetten i en pipetthållare som är ansluten till en fem milliliterspruta med kolven placerad vid fem milliliterpositionen och monterad på en treaxlig mikromanipulator.Sänk pipetten försiktigt mot skivan, kontrollera och justera målsättningen samtidigt, tills pipettens spets lätt vidrör ytan av skivan. Nu tune lasern och växla mikroskopet till multiphoton läge. Se till att kammaren är avskärmad från vilken ljuskälla som helst och slå på de icke-avscannade detektorerna.Ange förstärkningen och använd en uppslagstabell med en färgkodad övre gräns för att undvika att färgtonera pixlarna i bilden. Börja sedan spela in under en total varaktighet på minst 30 minuter, långsamt deprimerande sprutkolven från fem till en milliliter position, efter fem minuter, under en period av fem sekunder, att tillämpa föreningen till avsnittet. För bildanalys, först utföra z-projektion och drift korrigering med ImageJ på filen av intresse.Öppna sedan den modifierade filen i Isig och rita ett cirkulärt, 35-mikrometerdiameterregion av intresse, centrerat över injektionsstället. Kör filmen igen med roi,- -för att säkerställa att den är välpositionerad. Sedan använder regionen intresseintensitet evolution plugin för att mäta medelvärdet intensitet över tiden i regionen av intresse, och spara resultaten som en xls-fil.Detta protokoll gör att svaren induceras av olika föreningar, som ATP eller serotonin, som skall mätas. Även injektion av ATP framkallar en ökning av fluorescens, efter de flesta ATP injektioner, det finns en omedelbar, liten minskning av fluorescens på grund av vävnad distorsion som kommer tillbaka efter några minuter. Storleken på den region av intresse påverkar också kvantifieringen, eftersom en ökning av diametern minskar variationen bland experimenten, men minskar noggrannheten och omfattningen av det upptäckta svaret.Bedömning av mikroglialt svar vid en specifik tidpunkt kan vara användbart för statistisk jämförelse av olika föreningar, eller för att testa effekterna av specifika antagonister som lagts till perfusionslösningen. För att kvantifiera motiliteten i tre dimensioner, vet att du kanske måste ändra z-steg-intervallet och samplingsfrekvensen för förvärvet för att passa inom analyskraven.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Två-foton Imaging av Cellular Dynamics i ryggmärgen hos möss

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Två-foton avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Avbildning av intracellulära ATP i Organotypic vävnad skivor av musen hjärnan med hjälp av bandet-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillär tvåfotoner in vivo-avbildning av musens näthinna

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...