Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

ونحن ممتنون لموظفي مرفق التصوير المتقدم من سيبيو في بجامعة ترنتو ومرفق "بيوبتيكس الخفيفة الميكروسكوب" في واو ماكس بيروتس المختبرات (مفبل) في فيينا. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من ستيفتونغ اوبرمان مالك والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتنمية التكنولوجية ومظاهره تحت المنحة من لا 609431 للجماعة الأوروبية. تدعمه المفوضية الأوروبية على زمالة ريتا ليفي مونتالشيني من الوزارة الإيطالية للتعليم الجامعي والبحوث (وزارة).

1. التحديد من الحيوانات المستنسخة مقاومة النيوميسين
<ol><li>تنمو خلايا AGS في المتوسط F-12_K في لحم الخنزير (كين) تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين والبنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة) ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ترانسفيكت الخلايا في التقاء 50-...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

في هذا المقال نقدم وسيلة لتوليد السرطان البشرية استنساخ الخلية التي تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة داخل سوبتيلوميري 15q. استخدام هذه الحيوانات المستنسخة، الجزيئات تيرا MS2 معلم نسخها من سوبتيلوميري 15q اكتشاف بالفحص المجهري fluorescence المشارك التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل. هذا ?...

تيرا الحمض النووي الريبي فضله طويلة يتم نسخها من منطقة سوبتيلوميريك في الكروموسومات والنسخ العائدات نحو نهايات الكروموسومات، تنتهي داخل المسالك تكرار تيلوميريك1،2. لهذا السبب، تتكون من تسلسل المستمدة من سوبتيلوميريك في نهايتها 5 ' تيرا النصوص وإنهاء مع تكرار تيلوميريك (أوواجج في الفقاريات)3. أهمية الأدوار قد اقترحت للأرض، بما في ذلك تشكيل heterochromatin التيلومير4،5، الحمض النووي النسخ المتماثل6، تشجيع جزئ مثلى بين كروموسوم ينتهي7،8 , 9تنظيم هيكل telomere10و telomere طول التوازن2،11،،من1213. وعلاوة على ذلك، محاضر تيرا التفاعل مع العديد من المواقع اكستراتيلوميريك لتنظيم التعبير الجيني على نطاق واسع في الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES)14. تمشيا مع هذه الأدلة، الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين وأظهرت تحاليل الحمض النووي الريبي (الأسماك) أن فقط مجموعة فرعية نصوص تيرا المعربة في التيلومير1،2،15. وباﻹضافة إلى ذلك، أبلغ تيرا على شكل مجاميع النووية إضفاء الطابع المحلي على الكروموسومات X و Y في الماوس الخلايا2،16. تشير هذه النتائج إلى أن النصوص تيرا الخضوع للديناميات المعقدة داخل النواة. فهم ديناميات الجزيئات تيرا سيساعد على تحديد مهمتها والآليات من العمل.
وقد استخدمت نظام MS2-التجارة والنقل على نطاق واسع لتصور جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية من مختلف الكائنات17،18. وقد استخدمت هذا النظام سابقا الوسم ووضع تصور لجزيئات تيرا telomere واحد في12، S. cerevisiae19. باستخدام هذا النظام، فقد ظهر مؤخرا أن الخميرة تيرا النصوص المعربة داخل السيتوبلازم خلال مرحلة التحول دياوكسيك بوست، مما يوحي بأن الأرض قد تمارس مهام اكسترانوكلير20. أننا استخدمت مؤخرا نظام MS2-التجارة والنقل لدراسة النصوص تيرا telomere واحد في خلايا السرطان21. لتحقيق هذا الهدف، ونحن استخدمت أداة التحرير الجينوم كريسبر/Cas9 لدمج تسلسلات MS2 في telomere واحد (telomere 15q، يشار إليها فيما بعد Tel15q) والحصول على استنساخ معربا عن معلم MS2 تيرا Tel15q الذاتية (استنساخ تيرا-MS2). التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر فيها التجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل) التي تعترف ويربط التصور تمكن تسلسل الحمض النووي الريبي MS2 telomere واحد تيرا النصوص في المعيشة الخلايا21. وغرض البروتوكول هو موضح هنا أن يصف بالتفصيل الخطوات اللازمة لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2.
لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، تم دمج كاسيت MS2 داخل منطقة سوبتيلوميريك telomere 15q، المصب تيرا مروج المنطقة والنسخ الموقع ابدأ. كاسيت MS2 يحتوي على مورثة مقاومة النيوميسين محاط بمواقع لوكس-p، وإدماجه في سوبتيلوميري 15q تتم باستخدام نظام Cas9 كريسبر/22. بعد أن يتم تحديد تعداء MS2 استنساخ الكاسيت، واحد ويتم التحقق من التكامل سوبتيلوميريك للكاسيت ببكر، لطخة الحمض النووي تتابعها والجنوب. استنساخ إيجابية مصابون إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية بغية إزالة علامة الاختيار في الكاسيت، تاركاً فقط MS2 متواليات وموقع واحد لوكس-ف في سوبتيلوميري 15q. يمكن التحقق منه التعبير عن النصوص تيرا MS2 معلم من Tel15q ب RT-قبكر. وأخيراً، يتم التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل في استنساخ تيرا-MS2 عبر عدوى الفيروسات الرجعية من أجل تصور النصوص تيرا MS2 بالفحص المجهري الأسفار. يمكن اكتشاف النصوص تيرا سهولة بالجيش الملكي النيبالي-الأسماك وخلية يعيش التصوير باستخدام تيلوميريك الخاصة بتكرار يسبر1،2،،من1523. هذه النهج معلومات هامة عن التعريب من مجموع السكان من جزيئات تيرا في قرار وحيد الخلية. الجيل من الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على تسلسلات MS2 في سوبتيلوميري واحد سوف تمكن الباحثين من دراسة ديناميات telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا الحية، التي تساعد في تعريف الدالة وآليات عمل تيرا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

التيلومير يتم نسخها، مما أدى إلى تيلوميريك المحتوية على تكرار الكشف فضله منذ فترة طويلة (TERRA)، التي اقترحت أن تلعب أدواراً هامة في علم الأحياء telomere، بما في ذلك تشكيل هيتيروتشروماتين والتوازن طول telomere. وأظهرت النتائج الأخيرة أن جزيئات تيرا تتفاعل أيضا مع المناطق الكروموسومات الداخلية لتنظيم التعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس. وتمشيا مع هذه الأدلة، أظهرت الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التحليلات التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) فقط مجموعة فرعية من تيرا ترجمة النصوص في نهايات الكروموسومات. سوف تساعد على فهم أفضل لديناميات الجزيئات تيرا تحديد وظيفتها والآليات من العمل. هنا، نحن تصف طريقة للتسمية، وتصور telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا السرطانية باستخدام نظام MS2-التجارة والنقل. لتحقيق هذا الهدف، نقدم بروتوكولا لإنشاء استنساخ مستقرة، باستخدام خط خلية سرطان المعدة البشرية AGS، تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري واحد. يؤدي النسخ تيرا من telomere MS2 معلم في التعبير عن جزيئات تيرا MS2 المعلمة التي يتم تصور بالفحص المجهري خلية يعيش الأسفار عند التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر للتجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل). هذا النهج يتيح للباحثين لدراسة ديناميات telomere واحد تيرا الجزيئات في الخلايا السرطانية، ويمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى.

الرقم 1 يمثل نظرة استراتيجية تجريبية. تظهر الخطوات الرئيسية للبروتوكول ومخطط زمني إرشادي للجيل من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2 في الخلايا AGS (الشكل 1أ). في اليوم الأول، هي transfected آبار متعددة للوحة جيدا 6 مع كاسيت MS2 وسجرنا/Cas9 الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

نقدم هنا، بروتوكولا لتولد السرطان استنساخ الخلية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في سوبتيلوميري واحد. ويمكن هذا النهج، الاعتماد على نظام MS2-التجارة والنقل، والتصور النصوص الذاتية من تيلوميريك التي تحتوي على تكرار "الحمض النووي الريبي" (TERRA) أعرب من telomere واحدة في الخلايا الحية.

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التيلوميرات، مثل الخميرة التيلmeric noncoding الحمض النووي الريبي تيرا المترجمة، وأستطيع أن أصر على أنه تيلومير من أصل أو في عبر، وكروم مانت مختلفة الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح للباحثين لتصور جزيئات تيرا التعبير عن من التيلومير واحد في الخلايا الحية. سيكون إثبات الإجراء هو كلاوديو أوس بيغور ونيكول بيتين، وهما طالبان دراسات عليا من مختبري. لبدء تنمو الخلايا AGS وفقا لبروتوكول النص.ثم عندما تصل الخلايا 50 إلى 60٪ التقاء عبر الالتقاء لهم مع SgRNA Cas9 التعبير عن ناقلات وMS2 كاسيت. في اليوم التالي استبدال المتوسطة زراعة مع المتوسطة التي تحتوي على النيومايسين. بعد هذا إضافة 10 ميكرولترات من 0.25٪ Tripsyn إلى كل بئر من 96 بئر لوحة.باستخدام المجهر وعلامة، وضع علامة على موقف كل استنساخ مرئية في الطبق. استبدال النيوميسين زراعة المتوسطة مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتشكيل طبقة رقيقة من السائل على استنساخ. باستخدام ماصة 10 ميكرولتر تحتوي على خمسة ميكرولترات من تريبسين، ببطء الافراج عن التربسين على المستعمرة.السماح لـ Trypsin بفصل الخلايا لمدة دقيقة واحدة. كشط المستعمرة مع طرف، وامتص حتى في طرف. بعد ذلك، نقل الخلايا من مستعمرة إلى بئر من 96 لوحة البئر.احتضان لوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم املأ البئر بـ 150 ميكرولترات من المتوسط الانتقائي. بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من الجيلاتين إلى كل بئر من ثلاث 96 لوحات جيدا.احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، وغسل لوحات مع برنامج تلفزيوني مرتين. بعد أن تصل إلى استنساخ 90٪ التقاء، التعرق المتوسطة من كل بئر من لوحة، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 30 ميكرولترات من تريبسين إلى كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، إضافة 70 ميكرولترات من المتوسط الانتقائي لكل من الآبار. تعطيل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل 30 ميكرولترات من الخليط إلى بئر من لوحة الحمض النووي الجيلاتية التي تحتوي على 120 ميكرولترات من المتوسطة انتقائية.ثم نقل 30 ميكرولترات من الخليط إلى لوحة تجميد الجيلاتينية التي تحتوي على 50 ميكرولترات من المتوسط. وضع الحمض النووي في الحاضنة، والسماح للخلايا لتنمو في 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 90٪التقاء. بعد ذلك، إضافة 80 ميكرولترات من الجليد تجميد المتوسطة الباردة إلى كل بئر من لوحة تجميد.ختم لوحة مع parafilm، واستبدال الغطاء، والتفاف لوحة في رقائق الألومنيوم. ثم الحفاظ على لوحات تجميد في 80 درجة مئوية. بعد أن تصل المستنسخات في لوحة الحمض النووي إلى 90٪ من الالتقاء ، اغسل اللوحة مع PBS مرتين.ثم lyse الخلايا مع 50 ميكروليترس من العازلة Lysis. غطي الطبق بالبارا فيلم، واستبدل الغطاء، ولف الطبق في غلاف ساران. بعد هذا، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي إضافة 100 ميكرولترات من محلول كلوريد الصوديوم الإيثانول إلى كل بئر، والسماح للحمض النووي هطول الأمطار لمدة ست ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم عكس لوحة وغسلها ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ في البئر. إضافة 20 ميكرولترات من RNase A حل لكل بئر من لوحة، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، استخدم ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي الجينومي لتضخيم PCR، وإعداد جهاز PCR. تنمو استنساخ PCR إيجابية في ستة لوحات جيدا وفقا لبروتوكول النص. مرة واحدة في استنساخ تصل إلى 90٪ التقاء، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 250 ميكرولترات من العازلة تحلل مع البروتينات K إلى كل بئر.استخدم مكشطة خلية لتكشط الخلايا، ونقل الLysate إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان ال ليسات في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. إضافة ملليلتر واحد من الإيثانول إلى ليسات، ويهز بقوة.السماح للمستنسخين بالنمو في F-12K المتوسطة وفقا لبروتوكول النص. ثم إضافة الفيروس الغدي كريس التعبير عن الخلايا بمجرد أن تصل إلى التقاء 70٪. بعد 48 ساعة من العدوى، قسمت الخلايا إلى ثلاثة أطباق طولها 10 سنتيمترات.ثم ثقافة الأطباق الثالثة لتجميد الخلية، واستخراج الحمض النووي الريبي. أولا، لوحة استنساخ TERRA-MS2 وخلايا AGS نوع البرية في أطباق القاع الزجاج. ثم إضافة بوليبرين وMS2-GFP التعبير عن الفيروس الرجعي إلى المتوسطة.بعد 24 ساعة تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الفيروس الرجعي، وإضافة المتوسطة الطازجة دون الحمراء الفينول إلى الخلايا. وأخيرا ، وذلك باستخدام المجهر المقلوب وصورة كاميرا حساسة الخلايا مع الهدف المناسب والفتحة. في هذا البروتوكول تم إنشاء استنساخ الخلايا السرطانية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في فرعي واحد وصور.تم فحص المستنسخات المقاومة للنيومايسين باستخدام PCR. وكانت الحيوانات المستنسخة الإيجابية مُثقَة في تحلل لاستخراج الحمض النووي الجينومي وتحليل البقعة الجنوبية. وقد أصيبت المستنسخات الإيجابية ل PCR وتحليل البقعة الجنوبية مع CRE-GFP التعبير عن الفيروس أدينو من أجل إزالة الجين Neomycin الموجودة في كاسيت MS2.وبمجرد تأكيد القضاء على الجين المقاومة النيومايسين، تم اختبار الحمض النووي الريبي المستخرج من استنساخ للتعبير عن نصوص TERRA-MS2. من أجل تصور النصوص TERRA-MS2 في الخلايا الحية عن طريق المجهر confocal، تم إصابة المستنسخين المختارين بفيروس رجعي يعبر عن بروتين اندماج MS2-GFP. تم تصور نصوص TERRA-MS2 والتيلوميرات في وقت واحد في الخلايا الحية عن طريق المجهر confocal عن طريق المشاركة في التعبير عن بروتين الانصهار MS2-GFP وmCherry تنصهر بروتين الربط التيلومير، TRF2، في المستنسخات المختارة.عند محاولة هذا الإجراء من المهم بذل كل جهد ممكن لتحديد استنساخ واحد بدلا من مجموعة مختلطة من المستنسخين. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل FISH DNA على ينتشر الكروموسوم، من أجل تصور التكامل بين كاسيت MS2 في خلايا ثابتة. بعد تطورها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التيلومير لاستكشاف التوطين الخلوي لجزيئات التيلومير TERRA الفردية في الخلايا البشرية الحية.لا تنس أن العمل مع ناقلات الفيروسية والمواد المشعة يمكن أن تكون غير مؤكدة للغاية. وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء معاطف المختبر، والقفازات واستخدام دروع زجاج شبكي للحد من الإشعاع عند تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...