Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Vi er taknemmelige for ansatte i den avancerede billedbehandling anlæg i CIBIO på universitetet i Trento og BioOptics lys mikroskopi facilitet på Max F. Perutz laboratorier (MFPL) i Wien. Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra Mahlke-Obermann Stiftung og EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration under tilskudsaftalen ingen 609431 til EF. EF er understøttet af en Rita Levi Montalcini stipendium fra det italienske ministerium for uddannelse University og forskning (MIUR).

1. Udvalg af Neomycin resistente kloner
<ol><li>Vokse AGS celler i skinkes F-12_K (Kaighn) medium suppleret med 10% føtal bovin Serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (0,5 enheder pr. mL medium) og streptomycin (0,2 µg pr. mL medium) ved 37 ° C og 5% CO2. Transfect cellerne i en 50-60% sammenløbet med sgRNA/Cas9 at udtrykke vektor og MS2 kassetten på en 1:10 molære forhold21. Bemærk: I en parallel eksperiment, kontrollere Transfektion effektivitet af transfecting et udtryk...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

I denne artikel præsenterer vi en metode til at generere menneskelige kræft celle kloner indeholdende MS2 sekvenser integreret inden for subtelomere 15q. Brug disse kloner, registreres MS2-tagged TERRA molekyler transskriberet fra subtelomere 15q af Fluorescens mikroskopi af co udtryk for en normal god landbrugspraksis MS2 fusion protein. Denne tilgang gør det muligt for forskere at studere dynamikken i TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler,21. I denne protokol, er TERRA-MS2 klon...

Den lange noncoding RNA TERRA er transskriberet fra regionen subtelomeric i kromosomer og dens transskription provenuet mod kromosom enderne, terminering i telomeric gentage tarmkanalen1,2. Af denne grund, TERRA udskrifter består af subtelomeric-afledte sekvenser på deres 5' ende og opsige med telomeric gentagelser (UUAGGG i hvirveldyr)3. Vigtige roller er blevet foreslået for TERRA, herunder heterochromatin dannelse på telomerer4,5, DNA replikation6, fremme homologe rekombination blandt kromosom slutter7,8 , 9, regulering af telomere struktur10og telomere længde homøostase2,11,12,13. Derudover interagere TERRA udskrifter med talrige extratelomeric websteder til at regulere udbredt genekspression i mus embryonale stamceller (ES) celler14. I overensstemmelse med disse beviser, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist, at kun et undersæt af TERRA udskrifter lokalisere på telomerer1,2,15. Derudover er TERRA blevet rapporteret at form nukleare aggregater lokalisering på X- og Y-kromosomer i mus celler2,16. Disse resultater viser, at TERRA udskrifter gennemgå kompleks dynamik i kernen. Forståelse af dynamikken i TERRA molekyler vil hjælpe med at definere deres funktion og virkningsmekanismer.
MS2-normal god landbrugspraksis system har været meget anvendt til at visualisere RNA molekyler i levende celler fra forskellige organismer17,18. Dette system har tidligere været anvendt til tag og visualisere single-telomere TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Ved hjælp af dette system, blev det for nylig vist, gær TERRA udskrifter lokalisere i cytoplasma i post-diauxic Skift fase, tyder på, at TERRA kan udøve extranuclear funktioner20. Vi har for nylig brugt MS2-normal god landbrugspraksis systemet for at studere single-telomere TERRA udskrifter i kræft celler21. Til dette formål, vi ansat CRISPR/Cas9 genom redaktion værktøj at integrere MS2 sekvenser på en enkelt telomere (telomere 15q, i det følgende benævnt Tel15q) og opnået kloner udtrykker MS2-tagged endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Co udtryk for en normal god landbrugspraksis-smeltet MS2 RNA-bindende protein (MS2-NGL), genkender og binder MS2 RNA sekvenser giver mulighed for visualisering af single-telomere TERRA udskrifter i levende celler,21. Formålet med protokollen illustreret her er at beskrive i detaljer de trin, der kræves for generation af TERRA-MS2 kloner.
For at generere TERRA-MS2 kloner, en MS2 kassette er integreret inden for regionen subtelomeric af telomere 15q, neden for TERRA promotor-regionen og transskription startsted. MS2 kassette indeholder et neomycin resistens gen flankeret af lox-p steder, og dets integration ved subtelomere 15q udføres ved hjælp af CRISPR/Cas9 system22. Efter Transfektion af MS2 kassette, enkelt kloner er valgt og subtelomeric integration af kassetten bekræftes ved PCR, duppes DNA sekvensering og sydlige. Positive kloner er inficeret med en Cre-udtrykker adenovirus for at fjerne markeringen markør i kassette, forlader kun MS2 sekvenser og en enkelt lox-p websted på subtelomere 15q. Udtryk for MS2-tagged TERRA udskrifter fra Tel15q er verificeret af RT-qPCR. Endelig, MS2-normal god landbrugspraksis fusion protein er udtrykt i TERRA-MS2 kloner via retroviral infektion for at visualisere MS2-TERRA udskrifter af Fluorescens mikroskopi. TERRA udskrifter kan let påvises af RNA-fisk og live-celle imaging ved hjælp af telomeric repeat-specifikke sonder1,2,15,23. Disse tilgange giver vigtige oplysninger om lokalisering af den samlede befolkning i TERRA molekyler med enkelt celle opløsning. Generation af kloner indeholdende MS2 sekvenser på en enkelt subtelomere vil sætte forskerne i at studere dynamikken i single-telomere TERRA udskrifter i levende celler, som vil hjælpe med at definere funktion og virkningsmekanismer af TERRA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomerer er transskriberet, giver anledning til telomeric repeat-holdige længe noncoding RNA'er (TERRA), som er blevet foreslået til at spille en vigtig rolle i telomere biologi, herunder heterochromatin dannelse og telomere længde homøostase. De seneste resultater viste, at TERRA molekyler også interagere med interne kromosomale områder at regulere genekspression i mus embryonale stamceller (ES) celler. I overensstemmelse med denne dokumentation, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist, at kun et undersæt af TERRA udskrifter lokalisere på kromosom ender. En bedre forståelse af dynamikken i TERRA molekyler vil hjælpe med at definere deres funktion og virkningsmekanismer. Her, beskriver vi en metode til at mærke og visualisere single-telomere TERRA udskrifter i kræftceller ved hjælp MS2-normal god landbrugspraksis system. Til dette formål præsenterer vi en protokol til at generere stabile kloner, ved hjælp af AGS menneskelige mave cancer cellelinie, indeholder MS2 sekvenser integreret på en enkelt subtelomere. Transskription af TERRA fra MS2-tagged telomere resulterer i udtryk for MS2-tagged TERRA molekyler, der er visualiseret ved live-celle Fluorescens mikroskopi efter Co udtryk for en MS2 RNA-bindende protein smeltet til normal god landbrugspraksis (MS2-NGL). Denne tilgang gør det muligt for forskere at studere dynamikken i single-telomere TERRA molekyler i kræftceller, og det kan anvendes til andre cellelinjer.

Figur 1 repræsenterer en oversigt over den eksperimentelle strategi. De vigtigste trin i protokollen og en vejledende tidsplan for generation af TERRA-MS2 kloner i AGS celler er vist (figur 1A). På dag 1, er flere brønde i en 6 godt plade transfekteret med MS2 kassette og sgRNA/Cas9 at udtrykke vektorer (vist i figur 1B). To forskellige subtelomere 1...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Vi præsenterer her, en protokol for at generere kræft celle kloner indeholdende en MS2 sekvens tag på en enkelt subtelomere. Denne tilgang, lid MS2-normal god landbrugspraksis system, giver mulighed for visualisering af de endogene afskrifter af telomeric repeat-holdige RNA (TERRA) udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler.

Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om Telomeres, såsom gær telomeric noncoding RNA TERRA lokalisering, og jeg kan insistere på, at det er telomere af oprindelse eller i trans, en anden cromes-mants Den største fordel ved denne teknik er, at det giver forskerne mulighed for at visualisere TERRA molekyler udtrykke fra en enkelt telomere i levende celler. Demonstration af proceduren vil være Claudio Oss Pegorar og Nicole Bettin, to kandidatstuderende fra mit laboratorium. For at begynde at dyrke AGS-celler i henhold til tekstprotokollen.Så når cellerne nå 50 til 60% sammenløb transspect dem med sgRNA Cas9 udtrykke vektor og MS2 kassette. Den næste dag erstatte dyrkning medium med medium, der indeholder Neomycin. Efter denne tilføje 10 mikroliter af 0,25% Tripsyn til hver brønd af en 96 brønd plade.Ved hjælp af et mikroskop og en markør skal du markere placeringen af hver klon synlig i skålen. Udskift Neomycin-dyrkningsmediet med nok PBS til at danne en tynd film af væske på klonerne. Ved hjælp af en 10 mikroliterpipette, der indeholder fem mikroliter Trypsin, skal du langsomt slippe Trypsin på kolonien.Lad Trypsin løsne cellerne i et minut. Skrab kolonien med spidsen, og suge den op i spidsen. Derefter overføres cellerne fra kolonien til en brønd af 96 brøndpladen.Pladen inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Fyld derefter brønden med 150 mikroliter selektivt medium. Dernæst tilsættes 100 mikroliter gelatine til hver brønd af tre 96 brøndplader.Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter, og pladerne vaskes to gange med PBS. Når klonerne når 90% sammenløb, aspirere mediet fra hver brønd af pladen, og vask pladen med PBS. Derefter tilsættes 30 mikroliter trypsin til hver brønd, og inkubere pladen ved 37 grader celsius i fem minutter.Dernæst tilsættes 70 mikroliter selektivt medium til hver af brøndene. Forstyrre cellerne ved pipettering op og ned. Overfør 30 mikroliter af blandingen til brønden af den gelatinerede DNA-plade, der indeholder 120 mikroliter selektivt medium.Derefter overføres 30 mikroliter af blandingen til den gelatiniserede fryseplade, der indeholder 50 mikroliter medium. Placer DNA i inkubatoren, og lad cellerne til at vokse ved 37 grader celsius, indtil de når 90% sammenløb. Efter dette, tilsættes 80 mikroliter iskold frysning medium til hver brønd af frysepladen.Forsegle pladen med parafilm, erstatte låget, og wrap pladen i aluminiumsfolie. Hold derefter frysepladerne ved 80 grader celsius. Når klonerne i DNA-pladen når 90%sammenløb, vaskes pladen med PBS to gange.Derefter lyse cellerne med 50 mikroliter af Lysis buffer. Dæk pladen med parafilm, udskift låget, og pak pladen ind i saran wrap. Herefter inkuberes pladen ved 37 grader celsius natten over.Den næste dag tilsættes 100 mikroliter ethanol natriumchlorid opløsning til hver brønd, og lad DNA nedbør i seks timer eller natten over ved stuetemperatur. Derefter vende pladen og vaske det tre gange med 200 mikroliter ethanol 70% per brønd. Tilsæt 20 mikroliter RNase En opløsning til hver brønd af pladen, og inkuber pladen ved 37 grader celsius i en time.Derefter skal du bruge tre mikroliter genomisk DNA til PCR-forstærkning og sætte PCR-maskinen op. Dyrk PCR-positive kloner i seks brøndplader i henhold til tekstprotokollen. Når klonerne når 90%sammenløb, vaske cellerne med PBS, og tilsæt 250 mikroliter af Lysis buffer med Proteinase K til hver brønd.Brug en celleskraber til at skrabe cellerne og overføre lysatet til et 1,5 milliliterrør. Inkuber lysatet ved 37 grader celsius i 16 timer. Tilsæt en milliliter ethanol til lysatet, og ryst kraftigt.Lad klonerne vokse i F-12K-medie i henhold til tekstprotokollen. Derefter tilsættes Cre-udtrykkende adenovirus til cellerne, når de når 70% sammenløb. 48 timer efter infektion, opdele cellerne i tre 10 centimeter retter.Derefter kultur den tredje retter til celle frysning, og RNA ekstraktion. Først plade TERRA-MS2 kloner og den vilde type AGS celler i glasbunden retter. Derefter tilsættes Polybrene og MS2-GFP udtrykke retrovirus til mediet.Efter 24 timer kassér mediet indeholdende retrovirus, og tilsæt frisk medium uden phenol rød til cellerne. Endelig ved hjælp af en omvendt mikroskop og et følsomt kamera billede cellerne med det rette mål og blænde. I denne protokol kræft celle kloner, der indeholder en MS2 sekvens tag på en enkelt subtelomere blev oprettet og afbildet.Neomycin resistente kloner blev screenet ved hjælp af PCR. De positive kloner blev dyrket ved lysed for genomisk DNA-ekstraktion og sydlig blot analyse. Klonerne positive for PCR og southern blot analyse blev inficeret med CRE-GFP udtrykke Adenovirus for at fjerne Neomycin genet til stede i MS2 kassette.Når elimineringen af neomycinresistensgenet blev bekræftet, blev RNA udvundet fra klonerne testet for ekspression af TERRA-MS2-udskrifter. For at visualisere TERRA-MS2 udskrifter i levende celler ved konfokal mikroskopi, de udvalgte kloner blev inficeret med en retrovirus udtrykke en MS2-GFP fusion protein. TERRA-MS2 udskrifter og telomerer blev samtidig visualiseret i levende celler via konfokal mikroskopi ved co-udtrykke MS2-GFP fusion protein og en mCherry smeltet telomere bindende protein, TRF2, i de udvalgte kloner.Når du forsøger denne procedure er det vigtigt at gøre alt for at vælge en enkelt klon i stedet for en blandet population af kloner. Efter denne procedure, andre metoder som en DNA-fisk på kromosom spreads, kan bruges til at visualisere integrationen af MS2 kassette i faste celler. Efter sin udvikling, denne teknik kan bane vejen for forskere inden for telomerer at udforske den cellulære lokalisering af enkelt telomere TERRA molekyler i levende menneskelige celler.Glem ikke, at arbejde med virale vektorer og radioaktive materialer kan være yderst usikker. Og forholdsregler, såsom iført lab frakker, handsker og ved hjælp af plexiglas skjolde for at minimere stråling bør altid tages, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Under anvendelse af et fluorescerende PCR-kapillær gelelektroforese Teknik til genotype CRISPR / Cas9-medieret Knockout Mutanter i et format med høj kapacitet

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...