Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

We zijn dankbaar voor het personeel van de geavanceerde imaging faciliteit van CIBIO bij de Universiteit van Trento en de BioOptics licht microscopie faciliteit op de Max F. Perutz laboratoria (MFPL) in Wenen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Mahlke-Obermann-Stiftung en de zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie van de Europese Unie onder de Subsidieovereenkomst geen 609431 bij EG. EG wordt ondersteund door een Rita Levi Montalcini fellowship van het Italiaanse ministerie van onderwijs, Universiteit en onderzoek (MIUR).

1. Selectie van resistente neomycine klonen
<ol><li>AGS in Ham van F-12_K (Kaighn) medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) bij 37 ° C en 5% CO2cellen groeien. Transfect van de cellen aan een 50-60% samenvloeiing met de sgRNA/Cas9 uiten van vector en het MS2-cassette op een 1:10 molaire verhouding21. Opmerking: In een parallelle experiment, laten verifiër...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren van menselijke kanker cel klonen met MS2 sequenties geïntegreerd binnen subtelomere 15q. Met behulp van deze klonen, worden de transcriptie van de subtelomere-15q MS2-gelabeld TERRA-moleculen gedetecteerd door fluorescentie microscopie door co uitdrukking van een fusieproteïne MS2-GFP. Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van TERRA uitgedrukt uit een eenpersoons telomeer in levende cellen21. In dit protocol, worden TERRA...

De lange noncoding RNA TERRA is transcriptie van de subtélomérique regio van chromosomen en de transcriptie opbrengst naar de uiteinden van chromosomen, afgifte binnen de Telomere herhalen tract1,2. Om deze reden, TERRA Transcripten bestaan uit subtelomeric afkomstige sequenties aan hun 5'-eind en beëindigen met Telomere herhalingen (UUAGGG in Vertebraten)3. Belangrijke rollen zijn voorgesteld voor TERRA, met inbegrip van de heterochromatin formatie bij telomeren4,5, DNA replicatie6, bevordering van homologe recombinatie tussen chromosoom eindigt7,8 , 9, telomeer structuur10en telomeer lengte homeostase2,11,12,13te reguleren. Verder, TERRA afschriften communiceren met talrijke extratelomeric sites te reguleren van wijdverbreide genexpressie van muis embryonale stamcellen (ES) cellen14. In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA afschriften lokaliseren op telomeren1,2,15. Daarnaast is TERRA gemeld aan nucleaire aggregaten formulier lokaliseren op de X en Y chromosomen in2,16van de cellen van de muis. Deze bevindingen wijzen erop dat TERRA afschriften complexe dynamiek binnen de kern ondergaan. Inzicht in de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen definiëren hun functie en de mechanismen van de actie.
Het MS2-GFP-systeem is wijd verbeid gebruikt om te visualiseren de molecules van RNA in levende cellen van verschillende organismen17,18. Dit systeem is eerder gebruikt voor tag en visualiseren van single-telomeer TERRA moleculen in S. cerevisiae12,19. Met behulp van dit systeem, werd onlangs aangetoond dat gist TERRA afschriften binnen het cytoplasma tijdens de post-diauxie shift fase lokaliseren, suggereren dat TERRA extranuclear functies20kan uitoefenen. Onlangs hebben we het MS2-GFP-systeem gebruikt om te studeren van single-telomeer TERRA afschriften van kanker cellen21. Voor dit doel, wij het uitgeven hulpmiddel van CRISPR/Cas9 genoom te integreren MS2 sequenties op een enkele telomeer (telomeer 15q, hierna Tel15q) in dienst en verkregen klonen uiten MS2-gelabeld endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonen). Co uitdrukking van een GFP-gesmolten MS2 RNA-bindende eiwit (MS2-GFP) dat herkent en bindt MS2 RNA opeenvolgingen maakt visualisatie van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen21. Het doel van het protocol geïllustreerd hier is om te beschrijven in detail de stappen die nodig zijn voor de generatie van TERRA-MS2 klonen.
Voor het genereren van TERRA-MS2 klonen, een MS2 cassette is geïntegreerd in de regio subtélomérique telomeer 15q, stroomafwaarts van de TERRA promotor regio en transcriptie begin site. De MS2 cassette bevat een neomycine resistentie gen geflankeerd door lox-p sites, en zijn integratie op subtelomere 15q wordt uitgevoerd met behulp van het systeem CRISPR/Cas922. Nadat de transfectie van het MS2 cassette, enkele klonen zijn geselecteerd en subtélomérique integratie van de cassette wordt gecontroleerd door PCR, DNA sequencing en Southern blot. Positieve klonen zijn besmet met een adenovirus Cre-uiten ter opheffing van de markering van selectie in de cassette, waardoor alleen MS2 sequenties en een enkele lox-p-site op de subtelomere-15q. Expressie van TERRA MS2-gelabeld transcripties van Tel15q wordt gecontroleerd door RT-qPCR. Tot slot het MS2-GFP fusieproteïne wordt uitgedrukt in TERRA-MS2 klonen via retrovirale infectie om te visualiseren MS2-TERRA afschriften door fluorescentie microscopie. TERRA afschriften kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door RNA-vis en live-cel geschikt zijn met behulp van Telomere herhalen-specifieke sondes1,2,15,23. Deze benaderingen leveren belangrijke informatie over de lokalisatie van de totale bevolking van TERRA moleculen bij eencellige resolutie. De generatie van klonen met MS2 sequenties op een enkel subtelomere kunnen onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen, die zal helpen bij het definiëren van de functie en de mechanismen van de actie van TERRA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomeren zijn getranscribeerd, die aanleiding geven tot Telomere herhalen-bevattende lang noncoding RNAs (TERRA), die zijn voorgesteld om te spelen belangrijke rollen in de telomeer biologie, met inbegrip van de heterochromatin formatie en telomeer lengte homeostase. Recente bevindingen bleek dat TERRA moleculen ook met interne chromosomale regio's communiceren te regelen van genexpressie in cellen van muis embryonale stamcellen (ES). In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA lokaliseren afschriften aan chromosoom uiteinden. Een beter begrip van de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen bepalen hun functie en de mechanismen van de actie. Hier beschrijven we een methode om te etiketteren en visualiseren van single-telomeer TERRA afschriften in kankercellen met behulp van het MS2-GFP-systeem. Voor dit doel presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele klonen, opdrachtregel de AGS menselijke maag kanker cel, met MS2 sequenties op een één subtelomere geïntegreerd. Transcriptie van TERRA van het MS2-gelabeld telomeer resulteert in de expressie van TERRA MS2-gelabelde moleculen die worden gevisualiseerd door live-cel fluorescentie microscopie op co expressie van een MS2 RNA-bindende eiwit gesmolten tot GFP (MS2-GFP). Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA moleculen in kankercellen, en het kan worden toegepast op andere cellijnen.

Figuur 1 geeft een overzicht van de experimentele strategie. De belangrijkste stappen van het protocol en een indicatief tijdschema voor de generatie van TERRA-MS2 klonen in AGS cellen worden weergegeven(figuur 1). Op dag 1, zijn meerdere putjes van een 6 goed plaat transfected met de MS2 cassette en sgRNA/Cas9 uiten van vectoren (afgebeeld in figuur 1B...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over Telomeren, zoals gist telomeric noncoding RNA TERRA lokaliseren, en ik kan erop aandringen dat het telomeer van oorsprong of in trans, een andere cromes-mants Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om TERRA moleculen te visualiseren uitdrukken van een enkele telomeer in levende cellen. Demonstreren van de procedure zal Claudio Oss Pegorar en Nicole Bettin, twee afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen met het kweken van AGS-cellen volgens het tekstprotocol.Wanneer de cellen 50 tot 60% samenvloeiing bereiken, transpect ze dan met sgRNA Cas9 uitdrukkende vector en de MS2 cassette. De volgende dag vervang het culturing medium door medium met Neomycine. Voeg hierna 10 microliter van 0,25% Tripsyn toe aan elke put van een 96 putplaat.Met behulp van een microscoop en een marker, markeer de positie van elke kloon zichtbaar in de schotel. Vervang het Neomycine kweekmedium door voldoende PBS om een dunne laag vloeistof op de klonen te vormen. Met behulp van een 10 microliter pipet met vijf microliters trypsin, langzaam laat de Trypsin op de kolonie.Laat de Trypsin de cellen een minuut losmaken. Schraap de kolonie met de punt, en zuig het op in de punt. Breng hierna de cellen van de kolonie over naar een put van de 96 putplaat.Broed de plaat vijf minuten lang in bij kamertemperatuur. Vul vervolgens de put met 150 microliters van selectief medium. Voeg vervolgens 100 microliters gelatine toe aan elke put van drie 96 putplaten.Incubeer de platen op kamertemperatuur gedurende 30 minuten en was de platen twee keer met PBS. Nadat de klonen 90% samenvloeiing bereiken, het medium uit elke put van de plaat aanzuigen en de plaat wassen met PBS. Voeg vervolgens 30 microliter trypsin toe aan elke put en broed de plaat gedurende vijf minuten uit op 37 graden Celsius.Voeg vervolgens 70 microliter selectief medium toe aan elk van de putten. Verstoor de cellen door op en neer te pipetten. Breng 30 microliter van het mengsel over naar de put van de gelatiniseerde DNA-plaat met 120 microliter van selectief medium.Breng vervolgens 30 microliter van het mengsel over naar de gelatiniseerde vriesplaat met 50 microliter van het medium. Plaats het DNA in de couveuse, en laat de cellen groeien op 37 graden Celsius totdat ze 90% samenvloeiing bereiken. Voeg hierna 80 microliters ijskoud ijskoud medium toe aan elke put van de vriesplaat.Verzegel de plaat met parafilm, vervang het deksel en wikkel de plaat in aluminiumfolie. Houd dan de ijskoude platen op 80 graden celsius. Nadat de klonen in de DNA-plaat 90% samenvloeiing hebben bereikt, was de plaat twee maal met PBS.Vervolgens lyse de cellen met 50 microliter van Lysis buffer. Bedek de plaat met parafilm, vervang het deksel en wikkel de plaat in saran wrap. Daarna, incubeer de plaat op 37 graden celsius 's nachts.De volgende dag voeg 100 microliter ethanol natriumchloride oplossing aan elke put, en laat DNA-neerslag voor zes uur of 's nachts bij kamertemperatuur. Keer de plaat vervolgens om en was deze drie keer met 200 microliter ethanol 70% per put. Voeg 20 microliter RNase Een oplossing toe aan elke put van de plaat en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius.Gebruik hierna drie microliters genomisch DNA voor PCR-versterking en stel de PCR-machine in. Laat de PCR-positieve klonen groeien in zes goed platen volgens het tekstprotocol. Zodra de klonen bereiken 90%-samenvloeiing, was de cellen met PBS, en voeg 250 microliters van Lysis buffer met Proteinase K aan elke put.Gebruik een celschraper om de cellen te schrapen en breng het Lysaat over naar een buis van 1,5 milliliter. Broed het Lysaat op 37 graden celsius gedurende 16 uur. Voeg een milliliter ethanol toe aan het Lysaat en schud krachtig.Laat de klonen groeien in F-12K medium volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens het Cre-uitdrukkende adenovirus toe aan de cellen zodra ze 70% samenvloeiing bereiken. 48 uur na infectie, split de cellen in drie 10 centimeter gerechten.Dan cultuur de derde gerechten voor cel bevriezing, en RNA extractie. Ten eerste, plaat de TERRA-MS2 klonen en het wilde type AGS cellen in glazen bodem schotels. Voeg vervolgens Polybrene en de MS2-GFP die retrovirus uitdrukken toe aan het medium.Na 24 uur gooi het medium met het retrovirus weg en voeg het verse medium zonder fenolrood toe aan de cellen. Ten slotte, met behulp van een omgekeerde microscoop en een gevoelige camera beeld van de cellen met de juiste doelstelling en diafragma. In dit protocol kankercel klonen met een MS2 sequentie tag op een enkele subtelomere werden gemaakt en afgebeeld.De Neomycine resistente klonen werden gescreend met behulp van PCR. De positieve klonen werden gekweekt op lysed voor genomic DNA extractie en Zuidelijke vlek analyse. De klonen die positief zijn voor pcr- en zuidelijke vlekanalyse werden besmet met de CRE-GFP die Adenovirus uitdrukte om het Neomycine-gen in de MS2-cassette te verwijderen.Zodra de eliminatie van het Neomycine resistentiegen werd bevestigd, werd RNA uit de klonen getest op de expressie van TERRA-MS2 transcripties. Om TERRA-MS2 transcripties in levende cellen per confocale microscopie te visualiseren, werden de geselecteerde klonen geïnfecteerd met een retrovirus dat een MS2-GFP-fusieeiwit uitdrukte. TERRA-MS2 transcripties en telomeren werden gelijktijdig gevisualiseerd in levende cellen via confocale microscopie door co-expressing de MS2-GFP fusie-eiwit en een mCherry gesmolten telomeer bind eiwit, TRF2, in de geselecteerde klonen.Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om alles in het werk te stellen om een enkele kloon te selecteren in plaats van een gemengde populatie klonen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals een DNA FISH op chromosoom spreads worden gebruikt om de integratie van de MS2 cassette in vaste cellen te visualiseren. Na de ontwikkeling ervan kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van telomeren om de cellulaire lokalisatie van enkele telomeer TERRA moleculen in levende menselijke cellen te verkennen.Vergeet niet dat het werken met virale vectoren en radioactieve materialen uiterst onzeker kan zijn. En voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van labjassen, handschoenen en het gebruik van plexiglas schilden om straling te minimaliseren moet altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...