Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Wir sind dankbar für das Personal der die erweiterte Bildgebung von CIBIO an der Universität Trient und BioOptics Licht Mikroskopie Facility bei Max F. Perutz Laboratories (MFPL) in Wien. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Mahlke-Obermann-Stiftung und der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration unter Finanzhilfevereinbarung keine 609431 EG EG wird unterstützt durch ein Rita Levi Montalcini-Stipendium vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung (MIUR).

1. Auswahl von Neomycin resistente Klone
<ol><li>Wachsen Sie AGS-Zellen in Ham es F-12_K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium) und Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Zellen mit einem 50-60 % Zusammenfluss mit dem SgRNA/Cas9 mit dem Ausdruck Vektor und der MS2-Kassette auf eine 01:10 transfizieren Molverhältnis21. Hinweis: In einer parallelen Programmierung überprüfen ...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Krebserkrankungen Zellklonen mit MS2 Sequenzen innerhalb Produktlinie 15q integriert zu generieren. Diese Klone verwenden, werden die MS2-Tags TERRA-Moleküle aus der Produktlinie 15q transkribiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie von Co Ausdruck ein MS2-GFP Fusionsprotein erkannt. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik der TERRA von einem einzigen ausgedrückt zu studieren Telomere in lebenden Zellen21. In diesem Protokoll werde...

Die lange nichtcodierender RNA-TERRA ist aus der Region subtelomerischen Chromosomen transkribiert und seine Transkription verläuft in Richtung der Chromosomenenden, beendet in der telomeric repeat Trakt1,2. Aus diesem Grund TERRA Abschriften bestehen aus subtelomeric stammenden Sequenzen an ihrem 5'-Ende und beenden mit telomeric Wiederholungen (UUAGGG bei Wirbeltieren)3. Wichtige Rollen vorgeschlagen worden für TERRA, einschließlich Heterochromatin Bildung Telomere4,5, DNA-Replikation6, Förderung der homologen Rekombination zwischen Chromosom7,8 endet , 9, Regulierung der Telomere Struktur10und Telomere Länge Homöostase2,11,12,13. Darüber hinaus interagieren TERRA Transkripte mit zahlreichen Extratelomeric Websites, weit verbreitete Genexpression in Maus embryonaler Stammzellen (ES) Zellen14zu regulieren. Im Einklang mit diesen Beweis, RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge der TERRA Transkripte lokalisieren Telomere1,2,15. Darüber hinaus wurde TERRA Form nuklearen Aggregate Lokalisierung auf der X und Y Chromosomen in Maus Zellen2,16berichtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass TERRA Transkripte komplexe Dynamik innerhalb des Zellkerns zu unterziehen. Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA wird dazu beitragen, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren.
Das MS2-GFP-System hat verbreitet, RNA-Moleküle in lebenden Zellen aus verschiedenen Organismen17,18zu visualisieren. Dieses System hat früher zu markieren und zu visualisieren Single-Telomere TERRA Moleküle in S. Cerevisiae12,19. Mit diesem System vor kurzem zeigte sich, dass Hefe TERRA Transkripte lokalisieren innerhalb des Zytoplasmas während der Phase der Post-Diauxic-Schicht darauf hindeutet, dass TERRA extranuclear Funktionen20ausüben kann. Wir haben vor kurzem MS2-GFP-System verwendet, um Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebs Zellen21zu studieren. Zu diesem Zweck wir beschäftigt die CRISPR/Cas9-Genom-editing-Tool, MS2 Sequenzen an ein einzelnes Telomer (Telomere 15q, im folgenden Tel15q) zu integrieren und erhalten Klone MS2-Tags endogenen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 Klone) zum Ausdruck zu bringen. Co Ausdruck ein GLP-verschmolzen MS2-RNA-bindende Protein (MS2-GFP), das erkennt und bindet MS2-RNA Sequenzen ermöglicht Visualisierung von Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen21. Das hier abgebildete Protokoll soll für die Generation von TERRA-MS2 Klonen erforderlichen Schritte im Detail zu beschreiben.
Um TERRA-MS2 Klone zu erzeugen, ist eine MS2 Kassette innerhalb der subtelomerischen Region der Telomere 15q, integriert der TERRA Promotor Region und Transkription Startsite nachgeschaltet. Die MS2-Kassette enthält eine Neomycin-Resistenz-Gen von Lox-p Seiten flankiert, und seine Integration in die Produktlinie 15q erfolgt über CRISPR/Cas9 System22. Nach Transfektion von der MS2 Kassette, einzelnen Klone ausgewählt sind und subtelomerischen Integration der Kassette wird verifiziert durch PCR, DNA Sequenzierung und Southern blot. Positive Klone sind mit einem Cre exprimierenden Adenovirus infiziert, um die Auswahlmarkierung in der Kassette entfernen nur MS2 Sequenzen und eine einzelne Lox-p vor Ort bei der Produktlinie 15q verlassen. Ausdruck der MS2-Tags TERRA Abschriften von Tel15q wird von RT-qPCR überprüft. Zu guter Letzt drückt sich die MS2-GFP Fusionsprotein in TERRA-MS2 Klone über retroviralen Infektion um MS2-TERRA Transkripte von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. TERRA Transkripte von RNA-Fisch leicht nachweisbar und live Cell Imaging mit telomeric Repeat-spezifische Sonden1,2,15,23. Diese Ansätze liefern wichtige Informationen über die Lokalisation der Gesamtbevölkerung von TERRA Moleküle in einzelne Zelle Auflösung. Die Generation der Klone mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie ermöglicht es Forscher studieren die Dynamik des Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen, die helfen die Funktion und die Mechanismen der Wirkung von TERRA zu definieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomere sind transkribiert telomeric Repeat-haltigen lange forensisches RNAs (TERRA), verursachend, die sind vorgeschlagen worden, eine wichtige Rolle in der Telomere Biologie, einschließlich Heterochromatin Bildung und Telomere Länge Homöostase spielen. Neue Erkenntnissen zufolge TERRA Moleküle auch mit inneren chromosomalen Regionen zur Regulierung der Genexpression in Mauszellen embryonaler Stammzellen (ES) interagieren. Im Einklang mit dieser Beweis RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge von TERRA Abschriften an Chromosomenenden lokalisieren. Ein besseres Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA hilft, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren. Hier beschreiben wir eine Methode zum Beschriften und Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebszellen mit dem MS2-GFP-System zu visualisieren. Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll, um stabile Klone zu erzeugen mit Hilfe der AGS menschlichen Magen Krebs Zell-Linie mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie integriert. Transkription von TERRA von MS2-Tags Telomere ergibt sich in der Expression von MS2-Tags TERRA-Moleküle, die durch live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie auf Co Ausdruck ein MS2-RNA-bindende Protein mit GFP (MS2-GFP) verschmolzen visualisiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik des Single-Telomere TERRA Moleküle in Krebszellen zu studieren, und es kann auf andere Zelllinien angewendet werden.

Abbildung 1 stellt einen Überblick über die experimentelle Strategie. Die wichtigsten Schritte des Protokolls und einer indikativen Zeitlinie zur Erzeugung von TERRA-MS2 Klone in AGS Zellen werden (Abb. 1A) angezeigt. Am 1. Tag sind mehrere Brunnen von einem 6-well-Platte mit der MS2 Kassette und SgRNA/Cas9 zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildung 1B)...

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Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Krebs Zellklonen mit einem MS2 Sequenz Beschriftung auf einer einzigen Produktlinie zu generieren. Dieser Ansatz, unter Berufung auf das MS2-GFP-System ermöglicht die Visualisierung der endogenen Abschriften der telomeric Repeat-haltigen RNA (TERRA) von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt.

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über Telomere zu beantworten, wie Hefe telomernichtcodierende RNA TERRA Lokalisierung, und ich kann darauf bestehen, dass es Telomer des Ursprungs oder in trans, ein anderes cromes-mants Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Forschern ermöglicht, TERRA Moleküle aus einem einzigen Telomer in lebenden Zellen auszudrücken. Demonstriert wird das Verfahren von Claudio Oss Pegorar und Nicole Bettin, zwei Doktoranden aus meinem Labor. Um mit dem Wachstum von AGS-Zellen gemäß dem Textprotokoll zu beginnen.Wenn die Zellen dann 50 bis 60% Konfluenz erreichen, werden sie mit dem sgRNA Cas9-Expressionsvektor und der MS2-Kassette betrachtet. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Kultivierungsmedium durch ein Medium, das Neomycin enthält. Danach fügen Sie 10 Mikroliter von 0,25%Tripsyn zu jedem Brunnen einer 96 Brunnenplatte hinzu.Markieren Sie mit einem Mikroskop und einem Marker die Position jedes klonenden Klons, der in der Schale sichtbar ist. Ersetzen Sie das Neomycin-Kultivierungsmedium durch genügend PBS, um einen dünnen Flüssigkeitsfilm auf den Klonen zu bilden. Mit einer 10-Mikroliter-Pipette mit fünf Mikroliter Trypsin, lassen Sie das Trypsin langsam auf die Kolonie.Lassen Sie das Trypsin die Zellen für eine Minute lösen. Scrape die Kolonie mit der Spitze, und saugen Sie es in die Spitze. Danach übertragen Sie die Zellen aus der Kolonie in einen Brunnen der 96-Brunnenplatte.Inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann füllen Sie den Brunnen mit 150 Mikroliter selektivem Medium. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Gelatine zu jedem Brunnen von drei 96 Brunnenplatten hinzu.Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten, und waschen Sie die Platten mit PBS zweimal. Nachdem die Klone 90% Zusammenfluss erreichen, das Medium aus jedem Brunnen der Platte aspirieren und die Platte mit PBS waschen. Dann fügen Sie 30 Mikroliter Trypsin zu jedem Brunnen, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Als nächstes fügen Sie 70 Mikroliter selektives Medium zu jedem der Brunnen hinzu. Stören Sie die Zellen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie 30 Mikroliter der Mischung auf den Brunnen der gelatinierten DNA-Platte, die 120 Mikroliter selektives Medium enthält.Dann 30 Mikroliter der Mischung auf die gelatinierte Gefrierplatte mit 50 Mikroliter Medium übertragen. Legen Sie die DNA in den Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 90% Zusammenfluss erreichen. Danach 80 Mikroliter eiskaltes Gefriermedium zu jedem Brunnen der Gefrierplatte hinzufügen.Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, ersetzen Sie den Deckel, und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie. Dann die Gefrierplatten bei 80 Grad Celsius aufbewahren. Nachdem die Klone in der DNA-Platte 90% Zusammenfluss erreicht haben, waschen Sie die Platte zweimal mit PBS.Dann lysieren Sie die Zellen mit 50 Mikroliter LysisPuffer. Bedecken Sie die Platte mit Parafilm, ersetzen Sie den Deckel und wickeln Sie die Platte in Saran-Wrap. Danach bebrüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag 100 Mikroliter Ethanol-Natriumchlorid-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, und ermöglichen DNA-Fällung für sechs Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Dann die Platte umkehren und dreimal mit 200 Mikroliter Ethanol 70% pro Brunnen waschen. Fügen Sie 20 Mikroliter RNase Eine Lösung zu jedem Brunnen der Platte hinzu und brüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Danach verwenden Sie drei Mikroliter genomischer DNA für die PCR-Verstärkung und richten Sie die PCR-Maschine ein. Wachsen Sie die PCR-positiven Klone in sechs Well-Platten nach dem Textprotokoll. Sobald die Klone 90% Konfluss erreichen, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 250 Mikroliter Lysispuffer mit Proteinase K zu jedem Brunnen hinzu.Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu kratzen, und übertragen Sie das Lysat in ein 1,5 Milliliter-Rohr. Inkubieren Sie das Lysat bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden. Fügen Sie dem Lysat einen Milliliter Ethanol hinzu und schütteln Sie es kräftig.Lassen Sie die Klone in F-12K Medium entsprechend dem Textprotokoll wachsen. Fügen Sie dann das Cre-exezierende Adenovirus in die Zellen ein, sobald sie 70% Zusammenfluss erreicht haben. 48 Stunden nach der Infektion, teilen Sie die Zellen in drei 10-Zentimeter-Gerichte.Dann kulturieren Sie die dritten Gerichte für Daseinfrieren der Zelle und DIE RNA-Extraktion. Zuerst die TERRA-MS2-Klone und die wilden AGS-Zellen in Glasbodenschalen auftellern. Fügen Sie dann Polybren und das MS2-GFP, das Retrovirus exzessient, auf das Medium.Nach 24 Stunden das Medium, das das Retrovirus enthält, entsorgen und frisches Medium ohne Phenolrot in die Zellen geben. Schließlich, mit einem invertierten Mikroskop und einer empfindlichen Kamera Bild die Zellen mit dem entsprechenden Objektiv und Blende. In diesem Protokoll wurden Krebszellklone erstellt und abgebildet, die ein MS2-Sequenz-Tag an einem einzelnen Subtelomere enthalten.Die Neomycin-resistenten Klone wurden mit PCR gescreent. Die positiven Klone wurden zur genomischen DNA-Extraktion und Südfleckanalyse kultiviert. Die klonpositiven Klone für PCR und Die Southern Blot Analyse wurden mit dem CRE-GFP-Exzessatos Adenovirus infiziert, um das in der MS2-Kassette enthaltene Neomycin-Gen zu entfernen.Nachdem die Eliminierung des Neomycin-Resistenzgens bestätigt wurde, wurde die aus den Klonen extrahierte RNA auf die Expression von TERRA-MS2-Transkripten getestet. Um TERRA-MS2-Transkripte in lebenden Zellen durch konfokale Mikroskopie zu visualisieren, wurden die ausgewählten Klone mit einem Retrovirus infiziert, das ein MS2-GFP-Fusionsprotein exdrückte. TERRA-MS2-Transkripte und Telomere wurden gleichzeitig in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie visualisiert, indem das MS2-GFP-Fusionsprotein und ein mCherry-fused Telomer-Bindungsprotein TRF2 in den ausgewählten Klonen mitexzidiert wurden.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Anstrengungen zu unternehmen, um einen einzelnen Klon anstelle einer gemischten Population von Klonen auszuwählen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie ein DNA-FISCH auf Chromosomenaufstrichen verwendet werden, um die Integration der MS2-Kassette in feste Zellen zu visualisieren. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Telomere ebnen, um die zelluläre Lokalisierung einzelner Telomer-TERRA-Moleküle in lebenden menschlichen Zellen zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren und radioaktiven Materialien extrem unsicher sein kann. Und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Labormänteln, Handschuhen und die Verwendung von Plexiglasschilden zur Minimierung der Strahlung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Forschung

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...