Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

. אנחנו אסירי תודה על הסגל של המתקן הדמיה מתקדמות של CIBIO ב אוניברסיטה של טרנטו (trento), המתקן מיקרוסקופ אור BioOptics-מעבדות פרוץ פ מקס (MFPL) בווינה. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן Stiftung Mahlke-Obermann של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, הפגנה תחת גרנט הסכם אין 609431 כדי לכלכלת EC נתמך על ידי מלגת ריטה לוי Montalcini איטלקית משרד החינוך ואוניברסיטת המחקר (MIUR).

1. הבחירה של שיבוטים Neomycin עמיד
<ol><li>לגדל תאים AGS במדיום F-12_K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינונית)-CO 37 ° C ו-5%2. Transfect התאים ב- 50-60% בשילוב עם sgRNA/Cas9 להביע וקטור, בקלטת MS2 בעשר: 1 יחס טוחנת<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

במאמר זה אנו מציגים שיטה לייצר שיבוטים תאים סרטניים אנושיים המכיל רצפי MS2 משולב בתוך subtelomere 15q. באמצעות שיבוטים אלה, מולקולות טרה מתויג MS2 עיבד מ subtelomere 15q מזוהים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ על ידי ביטוי משותף של חלבון פיוז'ן MS2-GFP. גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של טרה הביע א?...

טרה RNA noncoding זמן הוא עיבד מאזור subtelomeric של כרומוזומים, שעתוק שלה ההכנסות לכיוון הקצוות כרומוזום, הפסקת בתוך בדרכי. אני חוזר telomeric1,2. מסיבה זו, טרה תעתיקים מורכב subtelomeric, נגזר רצפים בסוף 5' ולסיים עם telomeric חזרה (UUAGGG גולגולת)3. חשוב תפקידי הוצעו על TERRA, כולל הטרוכרומטין היווצרות-טלומרים4,5, ה-DNA שכפול6, קידום רקומבינציה הומולוגית בין כרומוזום מסתיים7,8 , 9, ויסות טלומר מבנה10ו טלומר אורך הומאוסטזיס2,11,12,13. יתר על כן, טרה תעתיקים אינטראקציה עם אתרים רבים extratelomeric להסדיר ביטוי גנים נרחבת תאי גזע עובריים (ES) העכבר14. בקנה אחד עם אלה ראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה ניתוחים (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה הפרוטוקולים לשפה טלומרים1,2,15. בנוסף, טרה דווח טופס גרעיני אגרגטים לוקליזציה על הכרומוזומים X ו- Y העכבר תאים2,16. ממצאים אלה מצביעים על TERRA תעתיקים לעבור דינמיקה מורכבת בתוך הגרעין. הבנת הדינמיקה של מולקולות טרה תסייע להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם.
מערכת MS2-GFP כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש מולקולות RNA בתאים חיים של אורגניזמים שונים17,18. מערכת זו שימש בעבר כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר מולקולות טרה cerevisiae ס12,19. באמצעות מערכת זו, זה היה לאחרונה הוכיח כי שמרים טרה תעתיקים בתרגום בתוך הציטופלסמה במהלך שלב shift פוסט-diauxic, רומז כי טרה לנצל פונקציות extranuclear20. השתמשנו לאחרונה מערכת MS2-GFP ללמוד יחיד-טלומר תעתיקים טרה סרטן תאים21. לכוונה זו, אנחנו מועסקים CRISPR/Cas9 הגנום כלי עריכה כדי לשלב את רצפי MS2 ב טלומר יחיד (טלומר 15q, להלן Tel15q) וקיבלתי שיבוטים ביטוי מתויג MS2 אנדוגני Tel15q טרה (TERRA-MS2 שיבוטים). ביטוי שיתוף התמזגו-GFP MS2 RNA מחייב חלבון (MS2-GFP) מזהה ומאגד רצפי MS2 RNA מאפשר החזיית יחיד-טלומר טרה תעתיקים חי תאים21. המטרה של פרוטוקול מאויר כאן היא לתאר בפירוט את הפעולות הדרושות עבור הדור של טרה-MS2 שיבוטים.
כדי ליצור שיבוטים טרה-MS2, קלטת MS2 משולב בתוך האזור subtelomeric של טלומר 15q, במורד הזרם של טרה יזם האזור ואת שעתוק התחלה האתר. בקלטת MS2 מכילה גן עמידות neomycin ולצדו אתרי סלומון-p, בהיותה אינטגרטיבית-subtelomere 15q מתבצעת באמצעות מערכת CRISPR/Cas922. לאחר תקנים של MS2 קלטת, יחיד שיבוטים שנבחרו subtelomeric שילוב של הקלטת מאומת על ידי ה-PCR, כתם DNA רצף ובדרום. שיבוטים חיובי נגוע אדנו לבטא-Cre למען הסר סמן הבחירה בקלטת, עוזב רק רצפי MS2 ואתר לקס יחיד-p-subtelomere 15q. הביטוי של טרה מתויג MS2 הפרוטוקולים מ Tel15q מאומתת על ידי RT-qPCR. בסופו של דבר, בא לידי ביטוי החלבון פיוז'ן MS2-GFP ב- TERRA-MS2 שיבוטים דרך זיהום retroviral כדי להמחיש תעתיקים MS2-טרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טרה תעתיקים אפשר לזהות בקלות בעזרת RNA-דג, הדמיה לחיות תאים באמצעות telomeric חוזר ספציפי רגשים1,2,15,23. גישות אלה לספק מידע חשוב על הלוקליזציה של מכלל האוכלוסייה של טרה מולקולות ברזולוציה תא בודד. הדור של שיבוטים המכיל רצפי MS2 ב subtelomere יחיד יאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאים חיים, אשר יסייע להגדיר את תפקוד ואת מנגנוני הפעולה של טרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

טלומרים משוקלטים, והוליד telomeric המכילים חוזר זמן noncoding RNAs (TERRA), אשר הוצעו כדי לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה טלומר, כולל היווצרות הטרוכרומטין טלומר אורך הומאוסטזיס. הממצאים האחרונים גילה כי מולקולות טרה גם לקיים אינטראקציה עם אזורים פנימיים כרומוזומלית להסדיר ביטוי גנים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר. בקנה אחד עם הראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA ניתוחים בחיי עיר הכלאה (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה תעתיקים לשפה קצותיו כרומוזום. הבנה טובה יותר של הדינמיקה של מולקולות טרה נעזור להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאי סרטן באמצעות מערכת MS2-GFP. לכוונה זו, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור שיבוטים יציב, באמצעות AGS שהבטן האנושית סרטן תא קו, המכיל רצפי MS2 משולב ב subtelomere יחיד. תמלול של טרה מ טלומר מתויג MS2 תוצאות הביטוי של מולקולות מתויג MS2 טרה הם דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ על ביטוי משותף של חלבון מחייב MS2 RNA דבוקה GFP (MS2-GFP). גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר טרה מולקולות בתאים סרטניים, ניתן להחיל אותה על שורות תאים אחרים.

איור 1 מייצג סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני. השלבים העיקריים של הפרוטוקול, ציר מעיד לדור של טרה-MS2 שיבוטים בתאים AGS מוצגים (איור 1א'). יום 1, בארות מרובים של צלחת טוב 6 הם transfected עם קלטת MS2, sgRNA/Cas9 לבטא וקטורים (המוצג באיור </strong...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על טלומרים, כגון שמרים טלומרים noncoding RNA TERRA לוקליזציה, ואני יכול להתעקש שזה טלומר ממוצא או טרנס, קרומס-mants שונים היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לחוקרים לדמיין מולקולות TERRA לבטא טלומר אחד בתאים חיים. להדגים את ההליך יהיו קלאודיו אוס פגואר וניקול בטין, שני סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל לגדל תאי AGS בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, כאשר התאים מגיעים 50 עד 60%confluence לשנות אותם עם sgRNA Cas9 המביע וקטור ואת הקלטת MS2. למחרת להחליף את המדיום culturing עם בינוני המכיל Neomycin. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של 0.25% Tripsyn לכל באר של צלחת 96 באר.באמצעות מיקרוסקופ וסמן, סמן את המיקום של כל שיבוט גלוי בצלחת. החלף את המדיום culturing Neomycin עם מספיק PBS כדי ליצור סרט דק של נוזל על השיבוטים. באמצעות פיפטה 10 microliter המכיל חמישה microliters של טריפסין, לאט לשחרר את טריפסין למושבה.אפשר ל- Trypsin לנתק את התאים למשך דקה אחת. לגרד את המושבה עם הקצה, ולמצוץ אותו לתוך הקצה. לאחר מכן, להעביר את התאים מהמושבה לתוך באר של צלחת 96 באר.דגירה הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מלאו את הטוב ב-150 מיקרוליטרים של מדיום סלקטיבי. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ג'לטין לכל באר של שלוש 96 צלחות באר.הדגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולשטוף את הצלחות עם PBS פעמיים. לאחר השיבוטים להגיע 90% confluence, שאפו את המדיום מכל באר של הצלחת, ולשטוף את הצלחת עם PBS. לאחר מכן מוסיפים 30 מיקרוליטרים של טריפסין לכל באר, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, להוסיף 70 microliters של מדיום סלקטיבי לכל בארות. לשבש את התאים על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים 30 מיקרוליטרים של התערובת לגם של צלחת הדנ"א הג'לטין המכילה 120 מיקרוליטרים של מדיום סלקטיבי.לאחר מכן מעבירים 30 מיקרוליטרים של התערובת לצלחת ההקפאה הג'לטין המכילה 50 מיקרוליטרים של מדיום. מניחים את הדנ"א באינקובטור, ומאפשרים לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים ל-90%. לאחר מכן, מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מדיום מקפיא קר כקרח לכל באר של הצלחת המקפיאה.לאטום את הצלחת עם parafilm, להחליף את המכסה, ולעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום. ואז לשמור על צלחות הקפאה ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר השיבוטים בצלחת ה-DNA להגיע 90% confluence, לשטוף את הצלחת עם PBS פעמיים.לאחר מכן lyse התאים עם 50 microliters של מאגר Lysis. מכסים את הצלחת בפרפילם, מחליפים את המכסה, ועוטפים את הצלחת בגלישת סארן. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.למחרת להוסיף 100 microliters של פתרון נתרן כלוריד אתנול לכל באר, ולאפשר משקעים DNA במשך שש שעות או לילה בטמפרטורת החדר. ואז להפוך את הצלחת ולשטוף אותו שלוש פעמים עם 200 microliters של אתנול 70% לגם. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של פתרון RNase A לכל באר של הצלחת, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, השתמש בשלושה מיקרוליטרים של דנ"א גנומי להגברת PCR, והגדר את מכונת ה- PCR. לגדול שיבוטים חיוביים PCR בשש צלחות גם על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר השיבוטים להגיע 90%confluence, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף 250 microliters של חיץ ליזה עם Proteinase K לכל באר.השתמש מגרד תא כדי לגרד את התאים, ולהעביר את Lysate לצינור 1.5 מיליליטר. דגירה Lysate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול ללייט, ומנערים במרץ.אפשר לשכפול לגדול בגודל F-12K על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסיפו את אדנווירוס ההבעה של Cre לתאים ברגע שהם מגיעים ל-70%. 48 שעות לאחר ההדבקה, לפצל את התאים לשלוש מנות 10 ס"מ.ואז תרבות הכלים השלישיים להקפאת תאים, והפקת RNA. ראשית, צלחת שיבוטים TERRA-MS2 ואת סוג הבר AGS תאים במנות תחתית זכוכית. לאחר מכן הוסיפו את פוליברן ואת MS2-GFP המבטאת רטרווירוס למדיום.לאחר 24 שעות להשליך את המדיום המכיל את רטרווירוס, ולהוסיף מדיום טרי ללא פנול אדום לתאים. לבסוף, באמצעות מיקרוסקופ הפוך ותצלמת מצלמה רגישה התאים עם המטרה המתאימה ואת הצמצם. בפרוטוקול זה שיבוטים של תאים סרטניים המכילים תג רצף MS2 בתת-בית אחד נוצרו ודימוי.שיבוטים עמידים Neomycin הוקרן באמצעות PCR. השיבוטים החיוביים היו מתורבתים ב lysed עבור מיצוי DNA גנומי וניתוח כתם דרומי. השיבוטים החיוביים לניתוח כתמים PCR ודרום נדבקו ב- CRE-GFP המבטא את אדנווירוס על מנת להסיר את הגן Neomycin הנוכחי בקלטת MS2.לאחר חיסול גן ההתנגדות Neomycin אושרה, RNA שחולצו מן השיבוטים נבדקו לביטוי של תעתיקים TERRA-MS2. על מנת לדמיין תעתיקי TERRA-MS2 בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית, השיבוטים שנבחרו היו נגועים רטרווירוס המבטא חלבון היתוך MS2-GFP. תעתיקי TERRA-MS2 וטרומרים הודמיו בו זמנית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית על ידי ביטוי שותף של חלבון ההיתוך MS2-GFP וחלבון מחייב טלומר מותך mCherry, TRF2, ב השיבוטים שנבחרו.בעת ניסיון הליך זה חשוב לעשות כל מאמץ כדי לבחור שיבוט יחיד במקום אוכלוסייה מעורבת של שיבוטים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו DNA FISH על התפשטות כרומוזום, ניתן להשתמש כדי לדמיין את השילוב של קלטת MS2 בתאים קבועים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הטלומרים לחקור את לוקליזציה תאית של מולקולות TERRA טלומר יחיד בתאים אנושיים חיים.אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ויראליים וחומרים רדיואקטיביים יכול להיות מאוד לא בטוח. ואמצעי זהירות, כגון לבישת חלוקי מעבדה, כפפות ושימוש במגני פרספקס כדי למזער את הקרינה תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...