Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

हम ट्रेंटो के विश्वविद्यालय में CIBIO की उन्नत इमेजिंग सुविधा के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं और वियना में मैक्स एफ Perutz प्रयोगशालाओं (MFPL) में प्रकाशिकी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा. इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान Mahlke-Obermann Stiftung और यूरोपीय संघ अनुसंधान, तकनीकी विकास और अनुदान समझौते नहीं ६०९४३१ चुनाव आयोग के तहत प्रदर्शन के लिए सातवें ढांचे के कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है । चुनाव आयोग एक रीता लेवी Montalcini फैलोशिप शिक्षा विश्वविद्यालय और अनुसंधान (MIUR) के इतालवी मंत्रालय से समर्थित है ।

1. निओमायसिन प्रतिरोधी क्लोनों का चयन
<ol><li>है हैम एफ में AGS कोशिकाओं बढ़ो-12K (Kaighn) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 2 मिमी एल-glutamine, पेनिसिलिन (०.५ मध्यम प्रति मिलीलीटर), और streptomycin (०.२ µ ग्राम प्रति मिलीलीटर) ?...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

इस लेख में हम मानव कैंसर कोशिका subtelomere 15q भीतर एकीकृत MS2 दृश्यों युक्त क्लोन उत्पंन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इन क्लोनों का प्रयोग, MS2-टेरा subtelomere 15q से प्रतिलिखित अणुओं एक MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन की सह अ?...

लंबे समय से डिकोडिंग आरएनए टेरा गुणसूत्रों के subtelomeric क्षेत्र से लिखित है और गुणसूत्र की ओर अपनी प्रतिलेखन आय समाप्त होता है, telomeric दोहराने पथ1,2के भीतर समाप्त । इस कारण से, टेरा टेप subtelomeric से मिलकर बनता है-उनके ' 5 अंत में दृश्यों व्युत्पंन और telomeric दोहराता के साथ समाप्त (रीढ़ में UUAGGG)3। महत्वपूर्ण भूमिकाओं टेरा के लिए प्रस्तावित किया गया है, telomeres में heterochromatin गठन सहित4,5, डीएनए प्रतिकृति6, गुणसूत्र के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन को बढ़ावा देने के7,8 समाप्त होता है , 9, विनियमन telomere संरचना10और telomere लंबाई homeostasis2,11,12,13। इसके अलावा, टेरा टेप कई extratelomeric साइटों के साथ बातचीत करने के लिए माउस भ्रूण स्टेम में व्यापक जीन अभिव्यक्ति को विनियमित (ES) कोशिकाओं14। इन सबूत के साथ लाइन में, आरएनए प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (आरएनए-मछली) विश्लेषण से पता चला है कि केवल टेरा टेप का एक सबसेट telomeres1,2,15पर information. इसके अतिरिक्त, टेरा को माउस कोशिकाओं2,16में एक्स और वाई गुणसूत्रों में स्थानीयकरण के लिए परमाणु समुच्चय के रूप में सूचित किया गया है । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि टेरा टेप नाभिक के भीतर जटिल गतिशीलता से गुजरना । टेरा अणुओं की गतिशीलता को समझने में मदद उनके समारोह और कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित करेगा ।
MS2-GFP प्रणाली को व्यापक रूप से विभिन्न जीवों17,18से जीवित कोशिकाओं में आरएनए अणुओं कल्पना करने के लिए प्रयोग किया गया है । इस प्रणाली को पहले टैग और एस cerevisiae12,19में एकल telomere टेरा अणुओं कल्पना किया गया है । इस प्रणाली का प्रयोग, यह हाल ही में दिखाया गया है कि खमीर टेरा टेप पोस्ट के दौरान कोशिका द्रव्य के भीतर स्थानीयकरण-diauxic बदलाव चरण, सुझाव है कि टेरा extranuclear कार्यों20लागू हो सकता है । हम हाल ही में उपयोग किया है MS2-GFP प्रणाली के अध्ययन के लिए एकल-telomere टेरा टेप कैंसर कोशिकाओं में21। इस उद्देश्य के लिए, हम CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन उपकरण कार्यरत एक एकल telomere में MS2 दृश्यों को एकीकृत (telomere 15q, इसके बाद Tel15q) और प्राप्त MS2-अंतर्जात Tel15q टेरा (टेरा-MS2 क्लोन)-टैग व्यक्त क्लोन । एक GFP-आपस में जुड़े MS2 आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (MS2-GFP) की सह-अभिव्यक्ति, जो पहचानता है और बांधता है MS2 आरएनए अनुक्रम एकल-telomere टेरा टेप के दृश्य में सक्षम बनाता है रहने वाली कोशिकाओं में21। यहां सचित्र प्रोटोकॉल का उद्देश्य विस्तार में टेरा-MS2 क्लोनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है ।
टेरा-MS2 क्लोन उत्पंन करने के लिए, एक MS2 कैसेट telomere 15q, टेरा प्रमोटर क्षेत्र और प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के बहाव के subtelomeric क्षेत्र के भीतर एकीकृत है । MS2 कैसेट एक निओमायसिन प्रतिरोध लोक्स-पी साइटों द्वारा पार्श्व जीन होता है, और subtelomere 15q में अपने एकीकरण CRISPR/Cas922प्रणाली का उपयोग किया जाता है । MS2 कैसेट के अभिकर्मक के बाद, एकल क्लोन का चयन कर रहे है और कैसेट के subtelomeric एकीकरण पीसीआर, डीएनए अनुक्रमण और दक्षिणी दाग द्वारा सत्यापित है । सकारात्मक क्लोन एक Cre-व्यक्त एडीनोवायरस से संक्रमित करने के लिए कैसेट में चयन मार्कर को दूर करने के लिए, केवल MS2 दृश्यों और एक भी लोक्स-पी साइट subtelomere 15q में छोड़ रहे हैं । MS2 की अभिव्यक्ति-Tel15q से टैग टेरा टेप आरटी द्वारा सत्यापित है-qPCR । अंत में, MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन retroviral संक्रमण के माध्यम से टेरा-MS2 क्लोन में व्यक्त की है क्रम में MS2 माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिदीप्ति-टेरा टेप कल्पना है । टेरा टेप आसानी से आरएनए द्वारा पता लगाया जा सकता है-मछली और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग telomeric दोहराने विशिष्ट जांच1,2,15,23। इन दृष्टिकोण एकल सेल संकल्प पर टेरा अणुओं की कुल जनसंख्या के स्थानीयकरण पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं । एक एकल subtelomere में MS2 दृश्यों युक्त क्लोन की पीढ़ी के शोधकर्ताओं ने एक जीवित कोशिकाओं है, जो समारोह और टेरा की कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित करने में मदद मिलेगी में telomere टेरा टेप की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomeres लिखित हैं, telomeric दोहराने-युक्त लंबे समय से कोडिंग RNAs (टेरा), जिसमें heterochromatin गठन और telomere लंबाई homeostasis सहित telomere जीवविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का प्रस्ताव किया गया है, को जंम दे रही है । हाल के निष्कर्षों से पता चला कि टेरा अणु भी आंतरिक गुणसूत्र क्षेत्रों के साथ बातचीत करने के लिए माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित । इस प्रमाण के साथ लाइन में, आरएनए प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (आरएनए-मछली) विश्लेषण से पता चला है कि केवल टेरा टेप का एक सबसेट गुणसूत्र में स्थानीयकृत समाप्त होता है । टेरा अणुओं की गतिशीलता की एक बेहतर समझ में मदद मिलेगी उनके समारोह और कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए लेबल और MS2-GFP प्रणाली का उपयोग कर कैंसर की कोशिकाओं में एकल telomere टेरा टेप कल्पना । इस उद्देश्य के लिए, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान स्थिर क्लोन उत्पंन करने के लिए, AGS मानव पेट कैंसर सेल लाइन का उपयोग कर, MS2 एक एकल subtelomere में एकीकृत अनुक्रम युक्त । MS2 से टेरा के प्रतिलेखन-MS2 की अभिव्यक्ति में telomere परिणाम टैग-टेरा अणुओं है कि जी द्वारा कल्पना कर रहे है-सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सह पर एक MS2 आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति GFP (MS2-GFP) से जुड़े । यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को एक कैंसर की कोशिकाओं में telomere टेरा अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, और यह अंय सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है ।

चित्रा 1 प्रयोगात्मक रणनीति के एक सिंहावलोकन का प्रतिनिधित्व करता है । प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों और AGS कोशिकाओं में टेरा-MS2 क्लोनों की पीढ़ी के लिए एक संकेत समयरेखा (चित्रा </stron...

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Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

यहां, हम एक एकल subtelomere में एक MS2 अनुक्रम टैग युक्त कैंसर सेल क्लोन उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण, MS2 पर भरोसा-GFP प्रणाली, telomeric दोहराने युक्त आरएनए (टेरा) के अंतर्जात टेप के दृश्य में सक्षम बनाता है रहने वाले कोशिकाओं में एक ही telomere से व्यक्त की ।

कैंसर सेल क्लोन की पीढ़ी Telomeric दोहराने-युक्त आरएनए टेरा कल्पना करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक एकल Telomere से व्यक्त

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

इस विधि से टेलोमेरेस के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है, जैसे खमीर टेलोमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए टेरा स्थानीयकरण, और मैं इस बात पर जोर दे सकता हूं कि यह मूल का टेलोमेरे है या ट्रांस में, एक अलग क्रोम्स-मैंट्स इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को जीवित कोशिकाओं में एक टेलोमेरे से टेरा अणुओं को व्यक्त करने की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन क्लाउडियो ओस पेगोरर और निकोल बेटटिन, मेरी प्रयोगशाला से दो स्नातक छात्र होंगे। पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार एजीएस कोशिकाओं को विकसित करना शुरू करना।फिर जब कोशिकाएं 50 से 60% संगम तक पहुंचती हैं तो उन्हें वेक्टर और एमएस 2 कैसेट व्यक्त करने वाले sgRNA Cas9 के साथ स्पेक्ट करें। अगले दिन खेती माध्यम को नियोमाइसिन युक्त माध्यम से प्रतिस्थापित करें। इसके बाद 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.25% ट्रिपसिन के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।माइक्रोस्कोप और एक मार्कर का उपयोग करके, डिश में दिखाई देने वाले प्रत्येक क्लोन की स्थिति को चिह्नित करें। क्लोन पर तरल की एक पतली फिल्म बनाने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ नियोमाइसिन संस्कृति माध्यम को बदलें। ट्राइप्सिन के पांच माइक्रोलीटर युक्त 10 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे ट्राइप्सिन को कॉलोनी पर छोड़ दें।ट्रिप्सिन को एक मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति दें। टिप के साथ कॉलोनी को कुरेदें, और इसे टिप में चूसें। इसके बाद, कॉलोनी से कोशिकाओं को 96 अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट। इसके बाद चुनिंदा माध्यम के 150 माइक्रोलीटर से कुएं को भरें। इसके बाद, तीन 96 अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में जिलेटिन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और प्लेटों को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, प्लेट के प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें, और प्लेट को पीबीएस से धोएं। फिर प्रत्येक कुएं में ट्रिप्सिन के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इसके बाद, प्रत्येक कुएं में चुनिंदा माध्यम के 70 माइक्रोलीटर जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कोशिकाओं को बाधित करें। मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर को जिलेटिनीकृत डीएनए प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें चयनात्मक माध्यम के 120 माइक्रोलीटर होते हैं।फिर मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर को जिलेटिनीकृत फ्रीजिंग प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें मध्यम के 50 माइक्रोलीटर होते हैं। डीएनए को इनक्यूबेटर में रखें, और कोशिकाओं को 90% संगम तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। इसके बाद, ठंड प्लेट के प्रत्येक कुएं में बर्फ ठंड ठंड माध्यम के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्लेट को पैराफिल्म से सील करें, ढक्कन को बदलें, और प्लेट को एल्यूमीनियम फॉयल में लपेटें। इसके बाद फ्रीजिंग प्लेट्स को 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। डीएनए प्लेट में क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, दो बार पीबीएस के साथ प्लेट धोएं।फिर लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को लाइसे करें। प्लेट को पैराफिल्म से ढककर, ढक्कन को बदलें, और थाली को सारण लपेटें में लपेटें। इसके बाद रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें।अगले दिन प्रत्येक कुएं में इथेनॉल सोडियम क्लोराइड समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर छह घंटे या रात भर के लिए डीएनए वर्षा की अनुमति दें। फिर प्लेट को उलटा करें और इसे 200 माइक्रोलीटर इथेनॉल 70% प्रति अच्छी तरह से धोएं। RNase के 20 माइक्रोलीटर प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक समाधान जोड़ें, और एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट ।इसके बाद पीसीआर एम्पलीफिकेशन के लिए जीनोमिक डीएनए के तीन माइक्रोलीटर का इस्तेमाल करें और पीसीआर मशीन को सेटअप करें । टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार छह अच्छी प्लेटों में पीसीआर पॉजिटिव क्लोन बढ़ाएं। एक बार क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोएं, और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रोटीनेज कश्मीर के साथ लाइसिस बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें।कोशिकाओं को कुरेदने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें, और लिसेट को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Lysate इनक्यूबेट। Lysate करने के लिए इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें, और सख्ती से हिला।क्लोन को टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एफ-12K माध्यम में बढ़ने दें। फिर 70% संगम तक पहुंचने के बाद कोशिकाओं में क्रे-एक्सप्रेसिंग एडेनोवायरस जोड़ें। संक्रमण के 48 घंटे बाद कोशिकाओं को तीन 10 सेंटीमीटर व्यंजनों में विभाजित करें।फिर सेल फ्रीजिंग, और आरएनए निष्कर्षण के लिए तीसरे व्यंजन संस्कृति। सबसे पहले, ग्लास बॉटम डिश में टेरा-एमएस2 क्लोन और जंगली प्रकार एजीएस कोशिकाओं को प्लेट करें। फिर मध्यम में रेट्रोवायरस व्यक्त करते हुए पॉलीब्रेन और एमएस2-जीएफपी जोड़ें।24 घंटे के बाद रेट्रोवायरस युक्त माध्यम को त्यागें, और कोशिकाओं में फिनोल लाल के बिना ताजा माध्यम जोड़ें। अंत में, एक उल्टे माइक्रोस्कोप और एक संवेदनशील कैमरा छवि उचित उद्देश्य और एपर्चर के साथ कोशिकाओं का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में कैंसर सेल क्लोन एक ही सबटेलोमेरे पर एक MS2 अनुक्रम टैग युक्त बनाया और छवि थे ।नियोमाइसिन प्रतिरोधी क्लोन पीसीआर का उपयोग कर जांच की गई। जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और दक्षिणी दाग विश्लेषण के लिए सकारात्मक क्लोन को सुसंस्कृत किया गया था। पीसीआर और दक्षिणी दाग विश्लेषण के लिए सकारात्मक क्लोन MS2 कैसेट में मौजूद नियोमाइसिन जीन को हटाने के लिए Adenovirus व्यक्त सीआरई-GFP से संक्रमित थे ।एक बार नियोमाइसिन प्रतिरोध जीन के उन्मूलन की पुष्टि हो जाने के बाद, क्लोन से निकाले गए आरएनए का परीक्षण टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति के लिए किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट की कल्पना करने के लिए, चयनित क्लोन MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हुए रेट्रोवायरस से संक्रमित थे। टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट और टेलोमेरेस को चयनित क्लोनों में एमएस2-जीएफपी फ्यूजन प्रोटीन और एक रीचेरी फ्यूज्ड टेलोमेरे बाइंडिंग प्रोटीन, टीआरएफ 2 को सह-व्यक्त करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में एक साथ कल्पना की गई थी।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय क्लोन की मिश्रित आबादी के बजाय एक क्लोन का चयन करने के लिए हर संभव प्रयास करना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, गुणसूत्र फैलता पर एक डीएनए मछली की तरह अन्य तरीकों, क्रम में तय कोशिकाओं में MS2 कैसेट के एकीकरण की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, यह तकनीक टेलोमेरेस के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए जीवित मानव कोशिकाओं में एकल टेलोमेरे टेरा अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त कर सकती है।मत भूलना कि वायरल वैक्टर और रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करना बेहद अनिश्चित हो सकता है। और इस तरह के प्रयोगशाला कोट, दस्ताने पहनने और विकिरण को कम करने के लिए प्लेक्सीग्लास ढाल का उपयोग कर के रूप में सावधानियों, हमेशा लिया जाना चाहिए जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

प्रोस्टेट कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर organoids की पीढ़ी

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...