Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

우리는 Trento의 대학에 CIBIO의 고급 이미징 시설 및 비엔나에서 BioOptics 빛 현미경 시설 최대 F. Perutz 실험실 (MFPL)에서 직원에 게 감사. 이러한 결과 연구는 기금을 받았다 Mahlke Obermann 재단 및 연구, 기술 개발 및 실증에 대 한 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램에서 부여 계약 없음 609431 적에 EC는 이탈리아 정부 대학 교육 및 연구 (MIUR)에서 리 타 레비 Montalcini 친교에 의해 지원 됩니다.

1입니다. 네오 마이 신 내성 클론의 선택
<ol><li>햄의 F-12_K (Kaighn) 매체와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 37 ° C, 5% CO2보충에 AGS 세포 성장. SgRNA/Cas9 벡터와 MS2 카세트 1시 10분에 표현 된 50-60% 합류에 셀 transfect 어 금 니 비율21. 참고: 병렬 실험에서 GFP 표현 벡터 (즉, Cas9-GFP 벡터) transfecting 여 trans...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. 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A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

이 문서에서 우리는 subtelomere 15q 통합 MS2 시퀀스를 포함 하는 인간의 암 세포 클론을 생성 하는 방법을 제시. 이러한 클론을 사용 하 여, subtelomere 15q에서에서 복사할 MS2 태그 테라 분자 MS2 GFP 융해 단백질의 공동 식으로 형광 현미경 검사 법에 의해 검색 됩니다. 이 방법은 단일에서 표현 하는 테라의 역학을 공부 하는 연구자 수 생활에서 telomere21세포. 이 프로토콜에서 테라 MS2 클?...

긴 noncoding RNA 테라 염색체의 subtelomeric 지역에서 복사할 및 그것의 녹음 방송 종료 telomeric 반복로1,2내 염색체 끝을 향해. 이러한 이유로, 테라 사본 그들의 5' 끝에 subtelomeric 파생 시퀀스의 구성 하 고 telomeric 반복 (척추 동물에 UUAGGG)3종료. 역할 제안 되었습니다 테라,7,8 끝 telomeres4,5, DNA 복제6, 염색체 가운데 동종 재결합을 추진에서 섬으로 형성을 포함 하 여 중요 한 , 9, telomere 구조10및 telomere 길이 항상성2,11,,1213통제. 또한, 테라 성적표 마우스 배아 줄기 (ES) 세포14에 광범위 한 유전자 발현 조절에 수많은 extratelomeric 사이트와 상호 작용 합니다. 이 맞춰 증거, RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 테라 성적 하위 집합 나타났습니다 telomeres1,,215에서 지역화 합니다. 또한, 테라 폼 핵 집계 마우스 세포2,16에서 X와 Y 염색체에서 지역화를 보고 되었습니다. 이러한 연구 결과 테라 성적표는 핵 내에서 복잡 한 역학 받아야 나타냅니다. 테라 분자의 역학을 이해 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다.
MS2 GFP 시스템은 다양 한 유기 체17,18에서 살아있는 세포에서 RNA 분자를 시각화 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이 시스템은 이전 태그를 S. cerevisiae12,19에서 단일 telomere 테라 분자 시각화 사용 되었습니다. 이 시스템을 사용 하 여, 최근에 보였다는 효 모 테라 성적표 지역화 세포질 내 게시물-diauxic 이동 단계 동안 테라 extranuclear 기능20발휘 수 있습니다 제안. 최근 암 세포21단일 telomere 테라 성적표 공부 MS2 GFP 시스템을 사용 했습니다. 이 목표를 우리 MS2 시퀀스는 단일 telomere (telomere 15q,이 하 Tel15q)에 통합 하는 CRISPR/Cas9 게놈 편집 도구를 고용 하 고 얻은 MS2 태그 내 생 Tel15q 테라 (테라 MS2 클론)을 표현 하는 클론. 인식 하 고 생활에 단일 telomere 테라 성적 MS2 RNA 시퀀스 수 시각화를 바인딩합니다 MS2 RNA 바인딩 GFP 융합 단백질 (MS2-GFP)의 공동 식21세포. 여기 설명 하는 프로토콜의 목적은 테라 MS2 클론의 생성에 필요한 단계를 자세히 설명 하는 것입니다.
테라 MS2 클론을 생성 하려면 MS2 카세트 telomere 15q의 subtelomeric 지역 통합은 테라 발기인 지역 및 전사 시작 사이트의 다운스트림. MS2 카세트 lox p 사이트에 의해 형벌 네오 마이 신 저항 유전자를 포함 하 고 subtelomere 15q에의 통합 CRISPR/Cas9 시스템22를 사용 하 여 수행 됩니다. 카세트, 단일 클론 MS2의 transfection 선택 후 카세트의 subtelomeric 통합 PCR에 의해 확인 된다 DNA 시퀀싱 및 남쪽 오 점. 긍정적인 복제품만 MS2 시퀀스 및 subtelomere 15q에 단일 lox p 사이트는 카세트에 선택 표시를 제거 하려면 Cre 표현 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Tel15q에서 MS2 태그 테라 성적 표현의 실시간 정량 Pcr에 의해 확인 됩니다. 마지막으로, MS2 GFP 융해 단백질은 표현 형광 현미경 검사 법에 의해 MS2 테라 성적표를 시각화 하기 위해 retroviral 감염을 통해 테라 MS2 클론에. 테라 성적표 RNA 물고기에 의해 쉽게 검출 될 수 있다 고 반복 전용 telomeric를 사용 하 여 라이브 셀 이미징 프로브1,2,,1523. 이러한 접근에는 단일 셀 해상도에서 테라 분자의 전체 인구의 지역화에 대 한 중요 한 정보가 나와 있습니다. 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스를 포함 하는 클론의 세대에는 단일 telomere 테라 성적 기능과 테라의 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다 살아있는 세포에서의 역학을 공부 하는 연구자 수 있게 된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomeres는 복사할 수, 반복 포함 하는 긴 noncoding RNAs (테라), telomeric를 야 기한는 telomere 생물학, telomere 길이 항상성 섬으로 형성 등 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 최근 연구 결과 밝혀 테라 분자도 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 유전자 발현을 조절 하기 위해 내부 염색체 영역 상호 작용. 이 증거에 따라 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 하위 집합으로 나타났습니다 테라의 성적표는 염색체 끝에 지역화. 테라 분자의 역학의 더 나은 이해는 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다. 여기, 우리 고 MS2 GFP 시스템을 사용 하 여 암 세포에서 단일 telomere 테라 성적표를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 목표에 선물이 안정적인 클론을 생성 하는 프로토콜 MS2 시퀀스에서 단일 subtelomere 통합을 포함 하 AGS 인간 위 암 세포 라인을 사용 하 여. MS2 태그 telomere에서 테라의 전사 (MS2-GFP) GFP 융합 MS2 RNA 의무적인 단백질의 공동 식 시 라이브 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 시각 MS2 태그 테라 분자의 표현을 결과입니다. 이 방법은 수 연구원은 암 세포에서 단일 telomere 테라 분자의 역학을 공부 하 고 다른 셀 라인에 적용 될 수 있습니다.

그림 1 실험적인 전략의 개요를 나타냅니다. 프로토콜 및 AGS 셀에서 테라 MS2 클론의 세대를 위한 나타내는 타임 라인의 주요 단계 (그림 1A) 표시 됩니다. 1 일에서 6 잘 플레이트의 여러 우물 MS2 카세트와 sgRNA/Cas9 (참조 그림 1B) 벡터 표현 페는. 2 개의 다른 subtelomere 15q 전?...

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Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

이 방법은 효모 텔로머 비코딩 RNA TERRA 국소화와 같은 텔로미어에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며, 나는 그것이 기원 또는 트랜스의 텔로미어라고 주장 할 수 있습니다, 다른 cromes-mants이 기술의 주요 장점은 연구원이 살아있는 세포에서 단일 텔로미어에서 표현 테라 분자를 시각화 할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 클라우디오 오스 페고라와 니콜 베틴, 내 실험실에서 두 대학원생이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 AGS 셀을 성장하기 시작합니다.그런 다음 세포가 50~ 60%에 도달하면 sgRNA Cas9 발현 벡터 및 MS2 카세트로 변환합니다. 다음 날 배양 매체를 네오마이신을 함유한 매체로 대체한다. 이 후 추가 10 마이크로 리터 0.25% 96 잘 플레이트의 각 우물에 Tripsyn.현미경과 마커를 사용하여 접시에 보이는 각 클론의 위치를 표시합니다. 네오마이신 배양 매체를 충분한 PBS로 교체하여 클론에 액체의 박막을 형성한다. 트립신의 5 마이크로 리터를 포함하는 10 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 천천히 식민지에 트립신을 해제합니다.트립신이 세포를 1분 동안 분리하도록 허용합니다. 끝으로 식민지를 긁어, 끝에 빨아. 이 후, 콜로니에서 세포를 96 웰 플레이트의 우물로 옮킨다.상온에서 5분간 접시를 배양합니다. 그런 다음 선택적 매체의 150 마이크로 리터로 우물을 채웁니다. 다음으로, 3개의 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 젤라틴을 추가합니다.플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 클론이 90 %에 도달 한 후, 접시의 각 우물에서 매체를 흡인하고 PBS로 접시를 씻습니다. 그런 다음 트립신 의 마이크로 리터 30 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.다음으로 각 웰에 70마이크로리터의 선택적 배지를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 세포를 방해. 120 마이크로리터를 포함하는 젤라틴화된 DNA 플레이트의 웰에 혼합물의 30마이크로리터를 전달한다.그런 다음 혼합물의 마이크로리터 30을 50 마이크로리터를 포함하는 젤라틴 냉동 플레이트로 전달한다. 인큐베이터에 DNA를 놓고, 세포가 90%의 합류에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 자랄 수 있도록 합니다. 그 후, 얼음 냉기 냉동 매체 80 마이크로리터를 동결 판의 각 웰에 추가합니다.접시를 파라필름으로 밀봉하고 뚜껑을 교체하고 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그런 다음 냉동 판을 섭씨 80도에서 유지하십시오. DNA 플레이트의 클론이 90%에 도달하면 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.그런 다음 Lysis 버퍼의 50 마이크로 리터로 세포를 lyse. 접시를 파라필름으로 덮고 뚜껑을 교체하고 접시를 사란 랩으로 감쌉니다. 그 후 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오.다음 날 각 우물에 100 마이크로리터의 염화나트륨 용액을 추가하고 실온에서 6시간 또는 하룻밤 동안 DNA 강수량을 허용합니다. 그런 다음 접시를 반전하고 잘 당 70 %의 200 마이크로 리터로 세 번 세척하십시오. 접시의 각 웰에 RNase A 용액 20 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.그 후 PCR 증폭을 위해 게놈 DNA 3마이크로리터를 사용하고 PCR 기계를 설치합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 6개의 웰 플레이트에서 PCR 양성 클론을 성장시다. 클론이 90%에 도달하면 PBS로 세포를 세척하고, 각 웰에 Proteinase K로 250 마이크로리터를 추가합니다.세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 Lysate를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 16시간 동안 섭씨 37도에서 Lysate를 배양합니다. Lysate에 에탄올 1 밀리리터를 넣고 힘차게 흔들어 줍니다.텍스트 프로토콜에 따라 F-12K 배지에서 클론을 성장시킬 수 있습니다. 그런 다음 70%의 합류에 도달하면 세포에 Cre-expressing 아데노바이러스를 추가합니다. 감염 후 48시간 후에 세포를 3개의 10센티미터 요리로 나눕습니다.그런 다음 세포 동결 및 RNA 추출을 위한 세 번째 접시를 배양합니다. 먼저, 테라-MS2 클론과 야생형 AGS 세포를 유리 바닥 접시에 접시에 담는다. 그런 다음 폴리브레인과 바이러스 를 발현하는 MS2-GFP를 배지에 추가합니다.24시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 배지를 버리고, 페놀 레드 없이 신선한 배지를 세포에 첨가한다. 마지막으로, 반전된 현미경과 민감한 카메라 영상을 사용하여 적절한 목표와 조리개를 가진 세포를 이미지하게 됩니다. 단일 서브텔로미어에서 MS2 서열 태그를 포함하는 이 프로토콜암 세포 클론이 생성되고 이미지화되었다.네오마이신 내성 클론은 PCR을 사용하여 스크리니징되었다. 양성 클론은 게놈 DNA 추출 및 남부 얼룩 분석을 위해 lysed에서 배양되었습니다. PCR 및 남부 블롯 분석에 양성클론은 MS2 카세트에 존재하는 네오마이신 유전자를 제거하기 위해 아데노바이러스를 발현하는 CRE-GFP에 감염되었다.네오마이신 저항 유전자의 제거가 확인되면, 클론으로부터 추출된 RNA는 테라-MS2 전사체의 발현을 위해 시험되었다. 공초점 현미경검사법에 의한 살아있는 세포에서 테라-MS2 전사체를 시각화하기 위해, 선택된 클론은 MS2-GFP 융합 단백질을 발현하는 레트로바이러스에 감염되었다. TERRA-MS2 전사체와 텔로미어는 선택된 클론에서 MS2-GFP 융합 단백질과 mCherry 융합 텔로미어 결합 단백질인 TRF2를 공동 발현함으로써 공초점 현미경 검사를 통해 살아있는 세포에서 동시에 시각화되었다.이 절차를 시도할 때 클론의 혼합 된 인구 대신 단일 클론을 선택하기 위해 모든 노력을 기울이는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색체 스프레드에 대한 DNA FISH와 같은 다른 방법은 고정 된 세포에서 MS2 카세트의 통합을 시각화하기 위해 사용될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 텔로미어 분야의 연구원들이 살아있는 인간 세포에서 단일 텔로미어 테라 분자의 세포 국소화를 탐구하는 길을 열 수 있습니다.바이러스 벡터 및 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 불확실 할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 실험실 코트, 장갑 착용 및 방사선을 최소화하기 위해 플렉시 유리 방패를 사용하는 것과 같은 예방 조치는이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

연구

유전학

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...