Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Vi er takknemlige til ansatte i avansert tenkelig anlegget i CIBIO ved Universitetet i Trento og BioOptics lys mikroskopi anlegget på Max F. Perutz Laboratories (MFPL) i Wien. Forskningen førte til disse resultatene har fått støtte fra Mahlke-SS-Obermann-Stiftung og EUs syvende rammeprogram for forskning og teknologiutvikling demonstrasjon grant avtalen ingen 609431 til EC. EC støttes av en Rita Levi Montalcini fellowship fra det italienske Forsvarsdepartementet utdanning universitet og forskning (MIUR).

1. Utvalg av Neomycin motstandsdyktig kloner
<ol><li>Vokse AGS celler i Ham F-12_K (Kaighn) medium med 10% fosterets Bovine Serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (0,5 enheter per mL av medium) og streptomycin (0,2 µg per mL av medium) på 37 ° C og 5% CO2. Transfect cellene på en 50-60% samløpet med sgRNA/Cas9 uttrykke vektor og MS2 kassetten på en 1:10 molar forholdet21. Merk: I en parallell eksperiment, kan du kontrollere hva effektivitet ved transfecting en GFP-uttrykke ...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

I denne artikkelen presenterer vi en metode for å generere menneskelige kreft cellen kloner som inneholder MS2 sekvenser integrert i subtelomere 15q. Bruker disse kloner, er MS2-merket TERRA molekylene transkribert fra subtelomere 15q oppdaget av fluorescens mikroskopi av co uttrykk for en MS2-GFP fusion protein. Dette gir forskere til å studere dynamikken i TERRA uttrykt fra en enkelt telomere i levende celler21. I denne protokollen velges TERRA-MS2 kloner i AGS celle linjen som representerer e...

Den lange noncoding RNA TERRA er transkribert fra subtelomeric regionen av kromosomer, og dens transkripsjon fortsetter mot kromosom endene, avsluttes innen telomeric gjenta spor1,2. Derfor TERRA transkripsjoner består av subtelomeric-avledet sekvenser på 5' slutten og avslutte med telomeric gjentar (UUAGGG i virveldyr)3. Viktige roller er foreslått for TERRA, inkludert heterochromatin formasjon på telomeres4,5, DNA replikering6, fremme homologe rekombinasjon blant kromosom ender7,8 , 9, regulere telomere struktur10og telomere lengde homeostase2,11,12,13. Videre samhandle TERRA transkripsjoner med mange extratelomeric nettsteder å regulere utbredt byggkorn under musen embryonic stem (ES) celler14. I tråd med dette bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist at bare et delsett av TERRA transkripsjoner lokalisere telomeres1,2,15. I tillegg har TERRA blitt rapportert til skjemaet kjernefysiske aggregat lokalisere på X og Y kromosomer i musen celler2,16. Disse funnene tyder på at TERRA transkripsjoner gjennomgå komplekse dynamikken i kjernen. Forstå dynamikken i TERRA molekyler vil bidra til å definere sine funksjon og virkningsmekanismer.
MS2-GFP systemet har vært mye brukt til å visualisere RNA molekyler i levende celler fra ulike organismer17,18. Dette systemet har tidligere blitt brukt til å kode og visualisere single-telomere TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Bruke dette systemet, var det nylig vist at gjær TERRA transkripsjoner lokalisere i cytoplasma i post-diauxic Skift fasen antyder at TERRA kan utøve extranuclear funksjoner20. Vi har nylig brukt MS2-GFP systemet for å studere single-telomere TERRA utskrifter i kreft celler21. Til dette målet, vi ansatt CRISPR/Cas9 genomet redigering verktøyet å integrere MS2 sekvenser på en enkelt telomere (telomere 15q, senere Tel15q) og fikk kloner uttrykke MS2-merket endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Co uttrykk for et GFP-smeltet MS2 RNA-bindende protein (MS2-GFP) som gjenkjenner og binder MS2 RNA sekvenser gjør visualisering av enkelt-telomere TERRA utskrifter i levende celler21. Formålet med protokollen illustrert her er å beskrive i detalj trinnene som kreves for generasjonen av TERRA-MS2 kloner.
Vil generere TERRA-MS2 kloner, kassetteninn MS2 er integrert i subtelomeric regionen av telomere 15q, nedstrøms TERRA promoter regionen og transkripsjon startwebstedet. MS2 kassett inneholder et neomycin motstand gen flankert av lox-p, og integrasjon på subtelomere 15q utføres med CRISPR/Cas9 systemet22. Etter hva av MS2 kassett, enkelt kloner velges og subtelomeric integrering av kassetten er bekreftet av PCR, DNA sekvensering og sørlige blot. Positiv kloner er infisert med en grobunn-uttrykke adenovirus for å fjerne markøren i kassetten, bare MS2 sekvenser og et enkelt lox-p nettsted på subtelomere 15q. Uttrykk for MS2-merket TERRA transkripsjoner fra Tel15q kontrolleres av RT-qPCR. Endelig MS2-GFP fusion protein er uttrykt i TERRA-MS2 kloner via retroviral infeksjon for å visualisere MS2-TERRA transkripsjoner av fluorescens mikroskopi. TERRA utskrifter kan lett oppdaget av RNA-fisk og live-celle bildevisning telomeric gjenta-spesifikke sonder1,2,15,23. Disse gir viktig informasjon om lokalisering av den totale befolkningen i TERRA molekyler enkeltcelle oppløsning. Generering av kloner som inneholder MS2 sekvenser på en enkelt subtelomere kan forskere til å studere dynamikken i enkelt-telomere TERRA utskrifter i levende celler, som bidrar til å definere funksjonen og virkningsmekanismer av TERRA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomeres er transkribert, gir opphav til telomeric gjenta inneholder lang noncoding RNAs (TERRA), som har blitt foreslått å spille viktige roller i telomere biologi, inkludert heterochromatin formasjon og telomere lengde homeostase. Nyere funn avslørte at TERRA molekyler også samhandle med interne chromosomal områder å regulere byggkorn under musen embryonic stem (ES) celler. I tråd med dette beviset, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist at bare et delsett av TERRA transkripsjoner lokalisere kromosom slutter. En bedre forståelse av dynamikken i TERRA molekyler bidrar til å definere deres funksjon og virkningsmekanismer. Her beskriver vi en metode for å merke og visualisere single-telomere TERRA utskrifter i celler ved hjelp av MS2-GFP-systemet. Til dette målet presenterer vi en protokoll for å generere stabil kloner, bruker AGS menneskelige mage kreft cellen linjen som inneholder MS2 sekvenser integrert på en enkelt subtelomere. Transkripsjon av TERRA fra MS2-merket telomere gir uttrykk for MS2-merket TERRA molekyler som er visualisert ved live-celle fluorescens mikroskopi på co uttrykk for et MS2 RNA-bindende protein smeltet til GFP (MS2-GFP). Dette gir forskere til å studere dynamikken i enkelt-telomere TERRA molekyler i kreftcellene, og den kan brukes på andre linjer.

Figur 1 representerer en oversikt over den eksperimentelle strategien. De viktigste trinnene av protokollen og en indikativ tidslinje for generering av TERRA-MS2 kloner i AGS celler vises (figur 1A). På dag 1, flere brønner i en 6 godt plate er transfekterte med MS2 kassett og sgRNA/Cas9 uttrykke vektorer (vist i figur 1B). To forskjellige subtelomere...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Her presenterer vi en protokoll for å generere kreft cellen kloner en MS2 sekvens kode på en enkelt subtelomere. Denne tilnærmingen, avhengig av MS2-GFP systemet, gjør visualisering av endogene transkripsjoner av telomeric gjenta inneholder RNA (TERRA) uttrykt fra en enkelt telomere i levende celler.

Generering av kreft cellen kloner å visualisere Telomeric gjenta inneholder RNA TERRA uttrykt fra en enkelt Telomere i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om Telomeres, for eksempel gjær telomeric noncoding RNA TERRA lokalisering, og jeg kan insistere på at det er telomere opprinnelse eller i trans, en annen cromes-mants Den største fordelen med denne teknikken er at det tillater forskere å visualisere TERRA molekyler uttrykke fra en enkelt telomere i levende celler. Viser prosedyren vil være Claudio Oss Pegorar og Nicole Bettin, to graduate studenter fra laboratoriet mitt. For å begynne å vokse AGS-celler i henhold til tekstprotokollen.Så når cellene når 50 til 60% samløpet transpect dem med sgRNA Cas9 uttrykker vektor og MS2 kassett. Neste dag erstatte kultering medium med medium som inneholder Neomycin. Etter dette legger du til 10 mikroliter på 0,25% Tripsyn til hver brønn av en 96 brønnplate.Ved hjelp av et mikroskop og en markør, merk posisjonen til hver klone synlig i parabolen. Erstatt Neomycin-kulteringsmediet med nok PBS til å danne en tynn film av væske på klonene. Bruk en 10 mikroliter pipette som inneholder fem mikroliter Trypsin, slipp sakte Trypsin på kolonien.La Trypsin løsne cellene i ett minutt. Skrap kolonien med spissen, og suge den opp i spissen. Etter dette overfører du cellene fra kolonien til en brønn av 96-brønnplaten.Inkuber platen i fem minutter ved romtemperatur. Fyll deretter brønnen med 150 mikroliter selektivt medium. Deretter legger du til 100 mikroliter gelatin til hver brønn på tre 96 brønnplater.Inkuber platene ved romtemperatur i 30 minutter, og vask platene med PBS to ganger. Etter at klonene når 90% samløpet, aspirerer mediet fra hver brønn av platen, og vask platen med PBS. Tilsett deretter 30 mikroliter Trypsin til hver brønn, og inkuber platen ved 37 grader celsius i fem minutter.Deretter legger du til 70 mikroliter selektivt medium til hver av brønnene. Forstyrre cellene ved å pipetter opp og ned. Overfør 30 mikroliter av blandingen til brønnen av den gelatiniserte DNA-platen som inneholder 120 mikroliter selektivt medium.Overfør deretter 30 mikroliter av blandingen til den gelatiniserte fryseplaten som inneholder 50 mikroliter medium. Plasser DNA i inkubatoren, og la cellene vokse ved 37 grader celsius til de når 90% samløpet. Etter dette legger du til 80 mikroliter iskaldt frysemedium til hver brønn av fryseplaten.Forsegle platen med parafilm, bytt lokket, og pakk platen i aluminiumsfolie. Hold deretter fryseplatene på 80 grader celsius. Etter at klonene i DNA-platen når 90% samløpet, vask platen med PBS to ganger.Deretter lyse cellene med 50 mikroliter lysis buffer. Dekk platen med parafilm, sett på lokket og pakk platen i saranfolie. Etter dette, inkuber platen ved 37 grader celsius over natten.Neste dag legger du til 100 mikroliter etanolnatriumkloridløsning til hver brønn, og la DNA-nedbør i seks timer eller over natten ved romtemperatur. Deretter inverterer platen og vask den tre ganger med 200 mikroliter etanol 70% per brønn. Tilsett 20 mikroliter RNase A-løsning på hver brønn av platen, og inkuber platen ved 37 grader celsius i en time.Etter dette bruker du tre mikroliter genomisk DNA til PCR-forsterkning, og setter opp PCR-maskinen. Vokse PCR positive kloner i seks brønnplater i henhold til tekstprotokollen. Når klonene når 90% samløpet, vask cellene med PBS, og tilsett 250 mikroliter Lysis buffer med Proteinase K til hver brønn.Bruk en celleskraper til å skrape cellene, og overfør Lysate til et 1,5 milliliter rør. Inkuber lysatet ved 37 grader celsius i 16 timer. Tilsett en milliliter etanol til Lysate, og rist kraftig.La klonene vokse i F-12K medium i henhold til tekstprotokollen. Deretter legger cre-uttrykkende adenovirus til cellene når de når 70% samløpet. 48 timer etter infeksjon, del cellene i tre 10 centimeter retter.Deretter kultur de tredje rettene for celle frysing, og RNA utvinning. Først plate TERRA-MS2 kloner og vill type AGS celler i glass bunnretter. Deretter legger Polybrene og MS2-GFP som uttrykker retrovirus til mediet.Etter 24 timer kast mediet som inneholder retroviruset, og tilsett friskt medium uten fenolrød til cellene. Til slutt, ved hjelp av et omvendt mikroskop og et følsomt kamerabilde, cellene med riktig mål og blenderåpning. I denne protokollen ble kreftcellekloner som inneholder en MS2-sekvenskode ved en enkelt undertelomer opprettet og avbildet.Neomycinresistente kloner ble screenet ved hjelp av PCR. De positive klonene ble dyrket på lysed for genomisk DNA-ekstraksjon og Southern blot analyse. Klonene som var positive til PCR- og Southern blot-analysen ble infisert med CRE-GFP som uttrykte Adenovirus for å fjerne Neomycin-genet som finnes i MS2-kassetten.Når elimineringen av neomycinresistensgenet ble bekreftet, ble RNA hentet fra klonene testet for uttrykk for TERRA-MS2-transkripsjoner. For å visualisere TERRA-MS2 transkripsjoner i levende celler ved konfokal mikroskopi, ble de valgte klonene infisert med et retrovirus som uttrykte et MS2-GFP fusjonsprotein. TERRA-MS2 transkripsjoner og telomerer ble samtidig visualisert i levende celler via konfokal mikroskopi ved å samtidig uttrykke MS2-GFP fusjonsprotein og et mCherry smeltet telomere binding protein, TRF2, i de valgte klonene.Når du prøver denne prosedyren er det viktig å gjøre sitt ytterste for å velge en enkelt klone i stedet for en blandet populasjon av kloner. Etter denne prosedyren kan andre metoder som en DNA FISH på kromosomspreder, brukes for å visualisere integreringen av MS2-kassetten i faste celler. Etter utviklingen kan denne teknikken bane vei for forskere innen telomerer for å utforske cellulær lokalisering av enkelt telomere TERRA molekyler i levende menneskelige celler.Ikke glem at det kan være svært usikkert å jobbe med virusvektorer og radioaktive materialer. Og forholdsregler, for eksempel bruk av laboratoriefrakker, hansker og bruk av plexiglassskjold for å minimere stråling, bør alltid tas når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknologi Dictyostelium discoideum cellene basert på valget og vekst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...