Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Somos gratos ao pessoal da instalação de imagem avançada do CIBIO para a Universidade de Trento e a facilidade de microscopia de luz de BioOptics na F. Max Perutz laboratórios (MFPL) em Viena. A pesquisa que conduz a estes resultados tem recebeu financiamento da Stiftung Mahlke-Anderson e o sétimo programa-quadro da União Europeia para a investigação, desenvolvimento tecnológico e demonstração no âmbito do acordo de concessão não 609431 CE. CE é apoiado por uma bolsa de Rita Levi Montalcini do Ministério da Educação Universidade e pesquisa (MIUR) italiano.

1. Seleção de Clones resistentes de neomicina
<ol><li>Desenvolvem-se células AGS no meio de F-12_K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% de soro bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio) e estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) a 37 ° C e 5% de CO2. Transfect as células em uma confluência de 50-60% com a sgRNA/Cas9 expressando o vetor e o cassette MS2 em um 01:10 razão molar21. Nota: Em um experimento paralelo, verificar eficiência do ...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. 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A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

Neste artigo, apresentamos um método para gerar clones de célula de câncer humano contendo sequências MS2 integradas dentro subtelomere 15q. Usando estes clones, as moléculas TERRA MS2-tag transcritas do subtelomere 15q são detectadas por microscopia de fluorescência pela expressão co de uma proteína de fusão MS2-GFP. Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica da TERRA, expressado de um único dos telômeros em vida células21. Neste protocolo, TERRA-MS2 clones são sel...

O tempo não-codificante TERRA de RNA é transcrito da região subtélomérique dos cromossomos e sua transcrição prossegue em direção as extremidades do cromossoma, encerra-se no âmbito do trato repetição oligospermia1,2. Por esta razão, transcrições TERRA consistem em sequências de derivados de subtelomeric na sua extremidade 5' e encerrar com repetições teloméricas (UUAGGG em vertebrados)3. Importantes funções têm sido propostos para a TERRA, incluindo a formação de heterocromatina telômeros4,5, DNA replicação6, promovendo uma recombinação homóloga entre cromossomo termina7,8 , 9, regulamenta o telômero estrutura10e telômero comprimento homeostase2,11,12,13. Além disso, transcrições TERRA interagirem com inúmeros locais de extratelomeric para regular a expressão gênica generalizada em rato de células estaminais embrionárias (ES)14. Em consonância com estas provas, RNA fluorescência em situ da hibridação análises (RNA-FISH) têm demonstrado que somente um subconjunto de transcrições TERRA localizar ao telômeros1,2,15. Além disso, a TERRA tem sido relatado para agregados nucleares de forma localizando nos cromossomos X e Y em células de rato2,16. Estes resultados indicam que as transcrições TERRA sofrer uma dinâmica complexa dentro do núcleo. Compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação.
O sistema MS2-GFP tem sido amplamente utilizado para visualizar moléculas de RNA em células vivas de vários organismos17,18. Este sistema tem sido anteriormente usado para tag e Visualizar moléculas TERRA single-telômero em S. cerevisiae12,19. Usando este sistema, recentemente foi demonstrado que as transcrições TERRA de levedura localizar dentro do citoplasma durante a fase de mudança de post-diauxic, sugerindo que a TERRA pode exercer funções extranuclear20. Recentemente nós usamos o sistema MS2-GFP estudar transcrições TERRA single-telômero em células de câncer21. Para este objectivo, que empregou a ferramenta de edição de genoma CRISPR/Cas9 integrar MS2 sequências em um único telômero (telômero 15q, doravante Tel15q) e obtidos clones expressando MS2-tag endógena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). Co a expressão de uma proteína GFP-fundido MS2 RNA-obrigatórias (MS2-GFP) que reconhece e liga MS2 RNA sequências permite visualização de transcrições TERRA single-telômero na vida células21. O objetivo do protocolo ilustrado aqui é descrever em detalhe os passos necessários para a geração de clones de TERRA-MS2.
Para gerar TERRA-MS2 clones, uma gaveta MS2 é integrada dentro da região de subtélomérique do telômero 15q, a jusante do TERRA promotor região e transcrição iniciar site. A MS2 gaveta contém um gene de resistência de neomicina ladeado por sites de salmão fumado-p, e sua integração no subtelomere 15q é executada usando o sistema CRISPR/Cas922. Depois de Transfeccao de gaveta, única clona o MS2 são selecionados e subtélomérique integração da fita é verificada pelo PCR, DNA, sequenciamento e Southern blot. Clones positivos estão infectados com um vírus adenoide Cre-expressando a fim de remover o marcador de seleção na gaveta, deixando apenas as sequências MS2 e um site único lox-p no subtelomere 15q. Expressão de transcritos TERRA MS2-tag de Tel15q é verificada por RT-qPCR. Finalmente, a proteína de fusão MS2-GFP é expressa em TERRA-MS2 clones através de infecção retroviral para visualizar as transcrições MS2-TERRA por microscopia de fluorescência. Transcrições TERRA podem ser facilmente detectadas por RNA-peixe e imagem latente da viver-pilha usando específicas repetição oligospermia sondas1,2,15,23. Estas abordagens fornecem informações importantes sobre a localização da população total de moléculas TERRA em resolução de célula única. A geração de clones contendo MS2 sequências em um único subtelomere permitirá aos pesquisadores estudar a dinâmica de transcrições TERRA single-telômero em células vivas, o que ajudarão a definir a função e os mecanismos de ação da TERRA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telômeros são transcritas, dando origem a oligospermia repetição-contendo o tempo não-codificante RNAs (TERRA), que têm sido propostos para desempenhar um papel importante na biologia do telômero, incluindo formação de heterocromatina e homeostase do comprimento dos telômeros. Descobertas recentes revelaram que as moléculas TERRA também interagirem com regiões cromossômicas internas para regular a expressão gênica em células-tronco embrionárias (ES) do mouse. Em consonância com esta evidência, RNA fluorescência em situ hibridização RNA-análises mostraram que somente um subconjunto de TERRA transcrições localizar nas extremidades do cromossomo. Uma melhor compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação. Aqui, descrevemos um método para rotular e visualizar as transcrições TERRA single-telômero nas células cancerosas, usando o sistema MS2-GFP. Para este objetivo, apresentamos um protocolo para gerar clones estáveis, usando a linhagem de células de câncer de estômago humano AGS, contendo sequências MS2 integradas em um único subtelomere. Transcrição de TERRA do telômero MS2-tag resulta na expressão de moléculas TERRA MS2-marcados que são visualizados por microscopia de fluorescência de viver-pilha sobre co expressão de uma proteína RNA MS2-fundida a GFP (MS2-GFP). Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica de moléculas TERRA single-telômero nas células cancerosas, e pode ser aplicado a outras linhas de célula.

Figura 1 representa uma visão geral da estratégia experimental. As principais etapas do protocolo e um calendário indicativo para a geração de clones de TERRA-MS2 em células AGS são mostradas (Figura 1A). No dia 1, vários poços de uma placa bem 6 são transfectados com o MS2 gaveta e sgRNA/Cas9 expressando vetores (mostrados na Figura 1B). Duas...

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Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre telômeros, como a localização do RNA TERRA telomérica de levedura, e posso insistir que é telômero de origem ou em trans, um cromes-mants diferente A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores visualizar moléculas TERRA expressas a partir de um único telômero em células vivas. Demonstrando o procedimento estarão Claudio Oss Pegorar e Nicole Bettin, dois estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar a cultivar células AGS de acordo com o protocolo de texto.Em seguida, quando as células atingem 50 a 60% de confluência transpect-los com sgRNA Cas9 expressando vetor e o MS2. No dia seguinte substitua o meio de cultivo por meio contendo Neomicina. Depois disso adicione 10 microliters de 0,25% Tripsyn a cada poço de uma placa de 96 poços.Usando um microscópio e um marcador, marque a posição de cada clone visível no prato. Substitua o meio de cultivo de Neomicina por PBS suficiente para formar uma fina película de líquido nos clones. Usando uma pipeta de 10 microliteres contendo cinco microliters de Trypsin, solte lentamente o Trypsin na colônia.Permita que a Trypsin desprende as células por um minuto. Raspe a colônia com a ponta, e suge-a na ponta. Depois disso, transfira as células da colônia para um poço da placa do poço 96.Incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, encha o poço com 150 microliters de meio seletivo. Em seguida, adicione 100 microliters de gelatina a cada poço de três 96 placas de poço.Incubar as placas em temperatura ambiente por 30 minutos e lavar as placas com PBS duas vezes. Após os clones atingirem 90% de confluência, aspire o meio de cada poço da placa e lave a placa com PBS. Em seguida, adicione 30 microliters de Trypsin a cada poço, e incubar a placa a 37 graus celsius por cinco minutos.Em seguida, adicione 70 microliters de meio seletivo a cada um dos poços. Interrompa as células se escoando para cima e para baixo. Transfira 30 microliters da mistura para o poço da placa de DNA gelatinizada contendo 120 microliters de meio seletivo.Em seguida, transfira 30 microliters da mistura para a placa de congelamento gelatinizada contendo 50 microliters de médio. Coloque o DNA na incubadora, e permita que as células cresçam a 37 graus celsius até atingirem 90% de confluência. Depois disso, adicione 80 microliters de gelo frio congelando médio para cada poço da placa de congelamento.Sele a placa com parafilm, substitua a tampa e enrole a placa em papel alumínio. Em seguida, mantenha as placas de congelamento a 80 graus celsius. Depois que os clones na placa de DNA atingirem 90% de confluência, lave a placa com PBS duas vezes.Em seguida, lise as células com 50 microliters de tampão de lysis. Cubra a placa com parafilm, substitua a tampa e enrole a placa em envoltório saran. Depois disso, incubar a placa a 37 graus celsius durante a noite.No dia seguinte, adicione 100 microliters de solução de cloreto de sódio etanol a cada poço, e permita a precipitação de DNA por seis horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, inverta a placa e lave-a três vezes com 200 microliters de etanol 70% por poço. Adicione 20 microliters de RNase Uma solução a cada poço da placa, e incubar a placa a 37 graus celsius por uma hora.Depois disso, use três microliters de DNA genômico para amplificação pcr, e configure a máquina PCR. Cresça os clones positivos do PCR em seis placas de poço de acordo com o protocolo de texto. Uma vez que os clones atinjam 90% de confluência, lave as células com PBS, e adicione 250 microliters de tampão de lysis com Proteinase K em cada poço.Use um raspador de células para raspar as células e transfira o Lysate para um tubo de 1,5 mililitro. Incubar o Lysate a 37 graus celsius por 16 horas. Adicione um mililitro de etanol ao Lysate, e agite vigorosamente.Permita que os clones cresçam em meio F-12K de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione o adenovírus expresso em Cre às células assim que atingirem 70% de confluência. 48 horas após a infecção, divida as células em três pratos de 10 centímetros.Em seguida, cultura os terceiros pratos para congelamento celular, e extração de RNA. Primeiro, emplaque os clones TERRA-MS2 e as células AGS do tipo selvagem em pratos de fundo de vidro. Em seguida, adicione Polybrene e o MS2-GFP expressando retrovírus ao meio.Após 24 horas descarte o meio contendo o retrovírus e adicione meio fresco sem fenol vermelho às células. Finalmente, usando um microscópio invertido e uma imagem sensível da câmera as células com o objetivo e abertura apropriados. Neste protocolo, clones de células cancerígenas contendo uma sequência MS2 em um único subtelomere foram criados e imagens.Os clones resistentes à Neomicina foram rastreados usando PCR. Os clones positivos foram cultivados em lysed para extração genômica de DNA e análise de manchas do sul. Os clones positivos para a análise de PCR e manchas do Sul foram infectados com o CRE-GFP expressando Adenovírus, a fim de remover o gene Neomicina presente no MS2.Uma vez confirmada a eliminação do gene de resistência à neomicina, o RNA extraído dos clones foi testado para a expressão de transcrições TERRA-MS2. A fim de visualizar as transcrições TERRA-MS2 em células vivas por microscopia confocal, os clones selecionados foram infectados com um retrovírus expressando uma proteína de fusão MS2-GFP. As transcrições e telômeros TERRA-MS2 foram visualizados simultaneamente em células vivas por meio de microscopia confocal, co-expressando a proteína de fusão MS2-GFP e uma proteína de ligação de telômero fundido mCherry, TRF2, nos clones selecionados.Ao tentar este procedimento é importante fazer todos os esforços para selecionar um único clone em vez de uma população mista de clones. Após este procedimento, outros métodos como um PEIXE DE DNA em spreads de cromossomo, podem ser usados para visualizar a integração do MS2 em células fixas. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores do campo dos telômeros explorarem a localização celular de moléculas de simples telomere TERRA em células humanas vivas.Não se esqueça que trabalhar com vetores virais e materiais radioativos pode ser extremamente incerto. E precauções, como usar jalecos, luvas e usar escudos de plexiglass para minimizar a radiação devem ser sempre tomadas na realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genética

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...