Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Мы благодарны сотрудникам передовой визуализации объекта CIBIO в университете Тренто и Фондом BioOptics свет микроскопия на Макс ф Perutz лабораторий (MFPL) в Вене. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Mahlke-Оберманн Stiftung и седьмой рамочной программы Европейского союза для исследований, технологических разработок и демонстрации соглашению Грант не 609431 в ЕС. EC поддерживается Рита Леви Монтальчини стипендий от итальянского министерства образования университета и исследования (MIUR).

1. Выбор неомицин устойчивостью клонов
<ol><li>Растут AGS клеток в среде Хам F-12_K (Kaighn), с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 2 мм L-глютамина, пенициллин (0,5 единиц / мл среды) и стрептомицин (0,2 мкг / мл среды) при 37 ° C и 5% CO2. Transfect клетки на 50-60% слияния с sgRNA/Cas9, выражая вектора и MS2 кассету в 1:10 молярно?...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

В этой статье мы представляем метод для создания человеческих раковых клеток клоны, содержащие MS2 последовательности в рамках subtelomere 15q. Используя эти клоны, мс2 тегами Терра молекул, трансляции из subtelomere 15q распознаются микроскопии флуоресцирования выражением совместного MS2-GFP синтез бе...

Длиной некодирующих Терра РНК транскрибируется из региона subtelomeric хромосом и его транскрипции приступает к концам хромосомы, завершение в течение1,telomeric повторить тракта2. По этой причине Терра стенограммы состоят из subtelomeric производные последовательностей в конце их 5' и прекратить с telomeric повторяется (UUAGGG позвоночных)3. Важные роли были предложены для TERRA, включая формирование гетерохроматин теломеры4,5, ДНК репликации6, поощрение гомологичная рекомбинация среди хромосома заканчивается7,8 , 9, регулирующих теломер структуры10и теломер длина гомеостаза2,11,12,13. Кроме того Терра стенограммы взаимодействуют с многочисленными extratelomeric сайтов для регулирования экспрессии генов широко в мыши эмбриональных стволовых (ES) клетки14. С учетом этих доказательств, флуоресценции в situ гибридизация РНК (РНК-рыбы) анализы показали что только подмножество Терра стенограммы локализовать теломеры1,2,15. Кроме того Терра сообщалось в форме ядерного агрегатов, локализация на X и Y хромосомы в мыши клетки2,16. Эти результаты показывают, что Терра стенограммы пройти сложную динамику в ядре. Понимание динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия.
MS2-GFP системы широко используется для визуализации молекул РНК в живых клетках различных организмов17,18. Эта система использовалась ранее тег и визуализировать сингл теломеры Терра молекул в S. cerevisiae12,19. С помощью этой системы, недавно было показано, что дрожжи Терра стенограммы локализовать в цитоплазме во время пост diauxic сдвиг фазы, предполагая, что Терра могут оказывать extranuclear функций20. Недавно мы использовали MS2-GFP системы для изучения одного теломеры Терра стенограммы в раковых клетках21. С этой целью мы заняты средство редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для интеграции MS2 последовательности в одном теломер (теломеры 15q, далее Tel15q) и получены клоны, выражая MS2-тегами эндогенного Tel15q TERRA (Терра-MS2 клоны). Сопредседатель выражение GFP-кварцевое MS2 RNA-связывая белка (MS2-GFP), что признает и связывает MS2 РНК последовательности позволяет визуализации одного теломеры Терра стенограмм в живых клетках21. Цель Протокола, показанные здесь является подробно описать шаги, необходимые для создания клонов Терра-MS2.
Для создания клонов Терра-MS2, мс2 кассету интегрирован в регионе subtelomeric теломер 15q, ниже по течению Терра промоутер региона и транскрипции запуск сайта. Кассета MS2 содержит ген сопротивления неомицин, обрамленная аргона p сайты, и ее интеграции в subtelomere 15q осуществляется с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas922. После того, как выбираются трансфекции MS2 Кассетный сингл клоны и subtelomeric интеграции кассеты проверяется методом ПЦР, ДНК последовательности и Южные помарки. Позитивные клоны были заражены Cre выражая аденовирус, чтобы удалить маркер выделения в кассету, оставив только MS2 последовательности и один жидкий кислород p сайта на subtelomere 15q. Выражения с меткой MS2 Терра транскрипты от Tel15q проверяется по RT-ПЦР. И наконец, выражается MS2-GFP синтез белка в Терра-MS2 клоны через ретровирусной инфекции для того, чтобы визуализировать MS2-Терра стенограммы микроскопии флуоресцирования. Терра стенограммы могут быть легко обнаружены РНК-рыба и клеток изображений с использованием telomeric повтор конкретных зондов1,2,15,23. Эти подходы обеспечивают важную информацию о локализации всего населения Терра молекул в одну ячейку резолюции. Поколение клонов, содержащих MS2 последовательности в одном subtelomere позволит исследователей для изучения динамики сингл теломеры Терра стенограмм в живых клетках, которые помогут определить функции и механизмы действия Терра.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Теломеры транскрибируется, рождая telomeric повтор содержащих длиной некодирующих РНК (Терра), которой было предложено играть важную роль в биологии теломер, включая формирование гетерохроматин и гомеостаза Длина теломер. Последние результаты показали, что молекулы Терра также взаимодействовать с внутренней хромосомных регионов для регулирования экспрессии генов в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток. С учетом этих доказательств, РНК флуоресценции в situ гибридизация (РНК-рыбы) анализы показали, что только подмножество Терра стенограммы локализовать на концах хромосомы. Лучшего понимания динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия. Здесь мы описываем метод ярлык и визуализировать сингл теломеры Терра стенограммы в раковых клетках, с использованием системы MS2-GFP. С этой целью мы представляем протокол для создания стабильной клоны, используя линии клеток рака человеческого желудка AGS, содержащий MS2 последовательности, интегрированных в один subtelomere. Транскрипция Терра с меткой MS2 теломер приводит выражение с тегами MS2 Терра молекул, которые визуализируются микроскопии флуоресцирования клеток после совместного выражение MS2 RNA-связывая протеинов, сливается с GFP (MS2-ГФП). Этот подход позволяет исследователям изучить динамику одного теломеры Терра молекул в раковых клетках, и он может быть применен к другим клеточных линий.

Рисунок 1 представляет собой обзор экспериментальной стратегии. Основные этапы протокола и ориентировочные сроки для поколения Терра-MS2 клонов в клетках AGS показываются (рис . 1А). В день 1 несколько скважин 6 хорошо плиты явл...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Здесь мы представляем протокол для создания клоны клеток рака, содержащий MS2 последовательности тег в одной subtelomere. Этот подход, опираясь на системе MS2-GFP, позволяет визуализации эндогенного стенограммы из telomeric повтор содержащие РНК (Терра) выразил от одного теломер в живых клетках.

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о Теломеры, такие как дрожжи теломерных некодирующих РНК TERRA локализации, и я могу настаивать на том, что это теломер происхождения или в транс, различные cromes-mants Основное преимущество этой техники является то, что она позволяет исследователям визуализировать молекулы TERRA выразить из одного теломер в живых клетках. Демонстрация процедуры будет Клаудио Осс Пегорар и Николь Беттин, два аспиранта из моей лаборатории. Чтобы начать выращивать клетки AGS в соответствии с текстовым протоколом.Затем, когда клетки достигают от 50 до 60%слияние transpect их с sgRNA Cas9 экспресс вектор и MS2 кассеты. На следующий день заменить культивирование среды со средой, содержащей неомицин. После этого добавить 10 микролитров 0,25%Tripsyn к каждому колодец из 96 пластины хорошо.Используя микроскоп и маркер, отметь положение каждого клона, видимого в блюде. Замените среду культивирования неомицина на достаточное количество PBS, чтобы сформировать тонкую пленку жидкости на клонах. Используя 10 микролитровую пипетку, содержащую пять микролитров трипсина, медленно отпустите трипсин в колонию.Разрешить трипсина, чтобы отделить клетки в течение одной минуты. Очисти колонию кончиком и сосать ее в кончик. После этого перенесите клетки из колонии в колодец 96 хорошо пластины.Инкубировать тарелку в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем заполните колодец 150 микролитров селективной среды. Затем добавьте 100 микролитров желатина к каждому колодец из трех пластин 96 хорошо.Инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 минут, и мыть пластины с PBS в два раза. После того, как клоны достигают 90% слияния, аспирировать среды из каждого колодец пластины, и мыть пластину с PBS. Затем добавьте 30 микролитров трипсина к каждой хорошо, и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Далее добавьте к каждой из скважин 70 микролитров селективной среды. Нарушить клетки, трубя вверх и вниз. Перенесите 30 микролитров смеси в колодец желатиновой пластины ДНК, содержащей 120 микролитров селективной среды.Затем перенесите 30 микролитров смеси на желатинизированную замерзающую пластину, содержащую 50 микролитров среднего. Поместите ДНК в инкубатор, и позволить клеткам расти при 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут 90% слияния. После этого добавьте 80 микролитров ледяной ледяной морозной среды к каждому колодец замерзающей пластины.Печать пластины с парафильмом, заменить крышку, и оберните пластину в алюминиевой фольге. Затем держите замерзающих пластин при 80 градусах по Цельсию. После того, как клоны в пластине ДНК достигнут 90% слияния, мыть пластину с PBS в два раза.Затем вылизать клетки с 50 микролитров буфера лиза. Обложка пластины с парафильмом, заменить крышку, и оберните пластину в саран обернуть. После этого инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию на ночь.На следующий день добавить 100 микролитров этанола раствор хлорида натрия в каждой хорошо, и позволяют ДНК осадков в течение шести часов или на ночь при комнатной температуре. Затем инвертировать пластину и мыть его три раза с 200 микролитров этанола 70% на колодец. Добавьте 20 микролитров раствора RNase A к каждому колодец пластины и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.После этого используйте три микролитера геномной ДНК для усиления ПЦР и установив ПЦР-машину. Выращиваем положительные клоны ПЦР в шести хорошо пластин в соответствии с текстовым протоколом. После того, как клоны достигают 90% слияния, мыть клетки с PBS, и добавить 250 микролитров буфера лиза с Proteinase K к каждому хорошо.Используйте сотовый скребок, чтобы соскребать клетки, и передать Lysate в 1,5 миллилитровую трубку. Инкубировать лисуат при 37 градусах по Цельсию в течение 16 часов. Добавить один миллилитр этанола в лисат, и встряхнуть энергично.Разрешить клонов расти в F-12K среды в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте аденовирус Cre-экспрессии к клеткам, как только они достигнут 70% слияния. Через 48 часов после заражения, разделить клетки на три 10 сантиметров посуды.Затем культура третьего блюда для замораживания клеток, и РНК-экстракции. Во-первых, пластины КЛОНОВ TERRA-MS2 и диких клеток типа AGS в стеклянной нижней посуде. Затем добавьте Полибрен и MS2-GFP, выражаюющий ретровирус в среду.Через 24 часа отбросить среду, содержащую ретровирус, и добавить свежие среды без фенола красный клеток. Наконец, с помощью перевернутого микроскопа и чувствительного изображения камеры клетки с соответствующей целью и диафрагмой. В этом протоколе были созданы и изображены клоны раковых клеток, содержащие тег последовательности MS2 в одном подтеломере.Клоны, устойчивые к неомицину, были проверены с помощью ПЦР. Положительные клоны были выуфированы на lysed для геномного извлечения дна и южного анализа помарки. Клоны, положительное для ПЦР и анализа помарки юга, были заражены CRE-GFP, выражают аденовирус, чтобы удалить ген неомицина, присутствующий в кассете MS2.После того, как ликвидация гена устойчивости неомицина была подтверждена, РНК, извлеченная из клонов, была протестирована на экспрессию транскриптов TERRA-MS2. Для визуализации транскриптов TERRA-MS2 в живых клетках с помощью конфокальные микроскопии выбранные клоны были заражены ретровирусом, выражают белок синтеза MS2-GFP. Транскрипты TERRA-MS2 и теломеры одновременно визуализировались в живых клетках с помощью конфокальную микроскопию путем совместного выражения белка синтеза MS2-GFP и мчерри, сплавленного теломерного связывающего белка, TRF2, в выбранных клонах.При попытке этой процедуры важно приложить все усилия, чтобы выбрать одного клона вместо смешанной популяции клонов. После этой процедуры, другие методы, такие как ДНК FISH на хромосоме распространяется, могут быть использованы для того, чтобы визуализировать интеграцию кассеты MS2 в фиксированных клетках. После его развития, этот метод может проложить путь для исследователей в области теломер, чтобы исследовать клеточной локализации одного теломера TERRA молекул в живых клетках человека.Не забывайте, что работа с вирусными переносчиками и радиоактивными материалами может быть крайне неопределенной. И меры предосторожности, такие как ношение лабораторных пальто, перчаток и использование плексигласовых щитов, чтобы свести к минимуму излучение всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...