Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Vi är tacksamma för den avancerade imaging anläggningen i CIBIO vid universitetet i Trento och BioOptics ljus Microscopy anläggningen på Max F. Perutz Laboratories (MFPL) i Wien personal. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från den Mahlke-Obermann Stiftung och EU: s sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration under bidragsavtalet ingen 609431 till EG. EG stöds av en Rita Levi Montalcini stipendium från det italienska ministeriet för utbildning och forskning (MIUR).

1. Urval av Neomycin resistenta kloner
<ol><li>Odla AGS cellerna i Ham's F-12_K (Kaighn) medium kompletteras med 10% fetalt bovint Serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (0,5 enheter per mL medium) och streptomycin (0.2 µg per mL medium) vid 37 ° C och 5% CO2. Transfect cellerna på en 50-60% sammanflödet med den sgRNA/Cas9 uttrycka vektor- och MS2 kassetten i en 1:10 molar förhållandet21. Obs: I en parallell experiment, verifiera transfection effektivitet genom transfecting...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

I denna artikel presenterar vi en metod för att generera mänskliga cancer cell kloner som innehåller MS2 sekvenser integrerade inom subtelomere 15q. Använder dessa kloner, upptäcks MS2-taggade TERRA molekylerna transkriberas från subtelomere 15q av fluorescensmikroskopi av samtidig uttryck av en MS2-GFP fusionsprotein. Denna metod gör det möjligt för forskare att studera dynamiken i TERRA uttryckt från en enda telomeren i levande celler21. I detta protokoll, är TERRA-MS2 kloner markerad...

Långa icke-kodande RNA TERRA är transkriberas från den subtelomeric regionen kromosomer och dess transkription fortsätter mot kromosom ändarna, avslutas inom den telomeric upprepa tarmkanalen1,2. Av denna anledning, TERRA avskrifter består av subtelomeric-derived sekvenser i sin 5'-änden och avsluta med telomeric repetitioner (UUAGGG hos ryggradsdjur)3. Viktiga roller har föreslagits för TERRA, inklusive Heterokromatin bildande på telomererna4,5, DNA-replikering6, främja homolog rekombination bland kromosom avslutas7,8 , 9, reglera telomeren struktur10och telomerens längd homeostas2,11,12,13. Dessutom interagerar TERRA avskrifter med talrika extratelomeric webbplatser att reglera utbredd genuttryck i mus embryonala stamceller (ES) celler14. I linje med dessa bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har visat att endast en delmängd av TERRA avskrifter lokalisera telomerer1,2,15. TERRA har dessutom rapporterats till formuläret nukleära aggregat lokalisera på X och Y kromosomerna i mus celler2,16. Dessa fynd tyder på att TERRA avskrifter genomgår komplexa dynamiken inom kärnan. Förstå dynamiken i TERRA molekyler kommer att hjälpa till att definiera deras funktion och verkningsmekanismer.
MS2-GFP systemet har använts att visualisera RNA-molekyler i levande celler från olika organismer17,18. Detta system har använts tidigare tagga och visualisera singel-telomer TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Med detta system, visades det nyligen att jäst TERRA avskrifter lokalisera inom cytoplasman under post-diauxic Skift, vilket tyder på att TERRA kan utöva extranuclear funktioner20. Vi har nyligen använt MS2-GFP systemet för att studera singel-telomer TERRA avskrifter i cancer celler21. I detta syfte vi anställd den CRISPR/Cas9 genom redigerande redskap att integrera MS2 sekvenser på en enda telomeren (telomeren 15q, nedan kallad Tel15q) och erhållna kloner att uttrycka MS2-taggade endogena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Samtidig uttryck för ett GFP-smält MS2 RNA-bindande protein (MS2-GFP) som känner igen och binder MS2 RNA sekvenser möjliggör visualisering av singel-telomer TERRA avskrifter i levande celler21. Syftet med protokollet illustreras här är att beskriva i detalj de steg som krävs för generering av TERRA-MS2 kloner.
För att generera TERRA-MS2 kloner, en MS2 kassett är integrerad i regionen subtelomeric i telomeren 15q, nedströms webbplatsen TERRA promotor regionen och transkription start. MS2 kassetten innehåller en neomycin motstånd gen flankerad av lox-p platser, och dess integration på subtelomere 15q utförs med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet22. Efter transfection av den MS2 kassett, enda kloner är markerade och subtelomeric integration av kassetten är verifierad av PCR, DNA ordningsföljd och Southern blot. Positiva kloner är infekterad med en Cre-uttryckande adenovirus för att ta bort markeringen markören i kassett, lämnar bara MS2 sekvenser och en enda lox-p-plats på subtelomere 15q. Uttryck för MS2-taggade TERRA avskrifter från Tel15q är verifierad av RT-qPCR. Slutligen, MS2-GFP fusion proteinet uttrycks i TERRA-MS2 kloner via retrovirala infektion för att visualisera MS2-TERRA avskrifter av fluorescensmikroskopi. TERRA avskrifter kan lätt upptäckas av RNA-fisk och live-cell bildåtergivning med telomeric repeat-specifika sonder1,2,15,23. Dessa metoder ger viktig information på localizationen av den sammanlagda befolkningen av TERRA molekyler i enskild cell upplösning. Generering av kloner som innehåller MS2 sekvenser på en enda subtelomere gör att forskare att studera dynamiken i singel-telomer TERRA avskrifter i levande celler, som kommer att hjälpa till att definiera funktion och verkningsmekanismer av TERRA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomerer transkriberas, ger upphov till telomeric repeat-innehållande länge icke-kodande RNAs (TERRA), som har föreslagits att spela viktiga roller i telomeren biologi, inklusive Heterokromatin bildandet och telomerens längd homeostas. Senaste resultaten avslöjade att TERRA molekyler också interagera med interna kromosomala regioner att reglera genuttrycket i mus embryonala stamceller (ES) används. I linje med detta bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har visat att endast en delmängd av TERRA lokalisera avskrifter i kromosom ändar. En bättre förståelse av dynamiken i TERRA molekyler kommer att hjälpa till att definiera deras funktion och verkningsmekanismer. Här, beskriver vi en metod för att märka och visualisera singel-telomer TERRA avskrifter i cancerceller med hjälp av MS2-GFP-systemet. I detta syfte presenterar vi ett protokoll för att generera stabil kloner, använda AGS mänskliga magen cancer cell linjen, som innehåller MS2 sekvenser är integrerade på ett enda subtelomere. Transkription av TERRA från MS2-taggade telomeren resulterar i uttrycket av MS2-taggade TERRA molekyler som visualiseras av live-cell fluorescensmikroskopi vid samtidig uttryck för en MS2 RNA-bindande protein smält till GFP (MS2-GFP). Denna metod gör det möjligt för forskare att studera dynamiken i singel-telomer TERRA molekyler i cancerceller, och det kan tillämpas på andra cellinjer.

Figur 1 representerar en översikt över experimentella strategin. De viktigaste stegen i protokollet och en vägledande tidsplan för generering av TERRA-MS2 kloner i AGS celler visas (figur 1A). På dag 1, är flera brunnar 6 väl platta transfekterade med MS2 kassett och sgRNA/Cas9 uttrycker vektorer (visas i figur 1B). Två olika subtelomere 15q-spe...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Här presenterar vi ett protokoll för att generera cancer cell kloner som innehåller en MS2 sekvens tagg på en enda subtelomere. Detta tillvägagångssätt, att förlita sig på MS2-GFP systemet, möjliggör visualisering av endogena avskrifter av telomeric repeat-innehållande RNA (TERRA) uttryckt från en enda telomeren i levande celler.

Generation av Cancer Cell kloner att visualisera Telomeric Repeat-innehållande RNA TERRA uttryckt från en enda telomeren i levande celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om Telomerer, såsom jäst telomeric noncoding RNA TERRA lokalisera, och jag kan insistera på att det är telomer av ursprung eller i trans, en annan cromes-mants Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter forskare att visualisera TERRA molekyler uttryck från en enda telomer i levande celler. Demonstrera förfarandet kommer att Claudio Oss Pegorar och Nicole Bettin, två doktorander från mitt laboratorium. Att börja växa AGS-celler enligt textprotokollet.Sedan när cellerna når 50 till 60%sammanflödet transpect dem med sgRNA Cas9 uttrycker vektor och MS2 kassett. Nästa dag ersätta odlingsmediet med medium som innehåller Neomycin. Efter detta lägga 10 mikroliter av 0,25%Tripsyn till varje brunn av en 96 väl platta.Med hjälp av ett mikroskop och en markör, markera positionen för varje klon synlig i skålen. Byt ut Neomycin-kultsubstratet mot tillräckligt med PBS för att bilda en tunn film av vätska på klonerna. Med hjälp av en 10 mikroliterpipett som innehåller fem mikroliter av Trypsin släpper du långsamt ut Trypsin på kolonin.Låt Trypsin att ta loss cellerna i en minut. Skrapa kolonin med spetsen, och sug upp den i spetsen. Efter detta överför cellerna från kolonin till en brunn av 96 brunnsplattan.Inkubera plattan i fem minuter i rumstemperatur. Fyll sedan brunnen med 150 mikroliter av selektivt medium. Därefter lägger du till 100 mikroliter gelatin till varje brunn av tre 96 brunnsplattor.Inkubera plattorna i rumstemperatur i 30 minuter, och tvätta plattorna med PBS två gånger. Efter klonerna når 90%sammanflödet, aspirera mediet från varje brunn av plattan, och tvätta plattan med PBS. Tillsätt sedan 30 mikroliter Trypsin till varje brunn, och inkubera plattan vid 37 grader celsius i fem minuter.Därefter lägger du till 70 mikroliter av selektivt medium till var och en av brunnarna. Störa cellerna genom att pipettera upp och ner. Överför 30 mikroliter av blandningen till brunnen av den gelatiniserade DNA-platta som innehåller 120 mikroliter av selektivt medium.Överför sedan 30 mikroliter av blandningen till den gelatiniserade frysplattan som innehåller 50 mikroliter medium. Placera DNA i inkubatorn, och låt cellerna växa vid 37 grader celsius tills de når 90% sammanflödet. Efter detta, tillsätt 80 mikroliter iskall frysning medium till varje brunn av frysplattan.Täta plattan med parafilm, byt locket, och linda plattan i aluminiumfolie. Håll sedan frysplattorna på 80 grader celsius. Efter att klonerna i DNA-plattan nått 90%sammanflödet, tvätta plattan med PBS två gånger.Sedan lyse cellerna med 50 mikroliter av Lysis buffert. Täck plattan med parafilm, sätt tillbaka locket, och linda plattan i saran wrap. Efter detta, inkubera plattan vid 37 grader celsius över natten.Nästa dag tillsätt 100 mikroliter av etanol natriumkloridlösning till varje brunn, och tillåta DNA-nederbörd i sex timmar eller över natten i rumstemperatur. Sedan invertera plattan och tvätta den tre gånger med 200 mikroliter av etanol 70%per brunn. Tillsätt 20 mikroliter av RNase A-lösning till varje brunn av plattan, och inkubera plattan vid 37 grader celsius i en timme.Efter detta, använd tre mikroliter av genomisk DNA för PCR förstärkning, och setup PCR-maskinen. Odla PCR-positiva klonerna i sex brunnsplattor enligt textprotokollet. När klonerna når 90%sammanflödet, tvätta cellerna med PBS, och tillsätt 250 mikroliter av Lysbuffert med Proteinase K till varje brunn.Använd en cellskrapa för att skrapa cellerna, och överför Lysate till ett 1,5 milliliterrör. Inkubera Lysate vid 37 grader celsius i 16 timmar. Tillsätt en milliliter etanol till Lysate, och skaka kraftigt.Låt klonerna växa i F-12K-medium enligt textprotokollet. Lägg sedan till Cre-uttryck adenovirus till cellerna när de når 70% sammanflödet. 48 timmar efter infektion, dela cellerna i tre 10 centimeter rätter.Sedan odla den tredje rätter för cell frysning, och RNA extraktion. Först, platta TERRA-MS2 kloner och vilda typ AGS celler i glas botten rätter. Lägg sedan till Polybrene och MS2-GFP som uttrycker retrovirus till mediet.Efter 24 timmar kasta mediet som innehåller retrovirus, och tillsätt färskt medium utan fenolröd till cellerna. Slutligen, med hjälp av en inverterad mikroskop och en känslig kamera bild cellerna med lämplig målsättning och bländare. I detta protokoll cancer cell kloner som innehåller en MS2 sekvens tag vid en enda subtelomer skapades och avbildas.De Neomycin resistenta klonerna var screenas med hjälp av PCR. De positiva klonerna var odlade vid lysed för genomisk DNA-extraktion och Southern blot analys. Klonerna positiva till PCR och Southern blot analys var infekterade med CRE-GFP uttrycker Adenovirus i syfte att ta bort Neomycin genen som finns i MS2 kassetten.När elimineringen av Neomycin-resistensgenen hade bekräftats testades RNA som extraherades från klonerna för uttrycket av TERRA-MS2-avskrifter. För att visualisera TERRA-MS2-transkriptioner i levande celler genom konfokalmikroskopi, infekterades de utvalda klonerna med ett retrovirus som uttrycker ett MS2-GFP fusionsprotein. TERRA-MS2 avskrifter och telomerer var samtidigt visualiseras i levande celler via confocal mikroskopi genom att uttrycka MS2-GFP fusion protein och en mCherry smält telomer bindande protein, TRF2, i de valda klonerna.När du försöker detta förfarande är det viktigt att göra allt för att välja en enda klon i stället för en blandad population av kloner. Efter detta förfarande, andra metoder som en DNA FISH på kromosom sprider, kan användas i syfte att visualisera integrationen av MS2 kassetten i fasta celler. Efter dess utveckling, denna teknik kan bana väg för forskare inom telomerer att utforska cellulära lokalisering av enda telomer TERRA molekyler i levande mänskliga celler.Glöm inte att arbeta med virala vektorer och radioaktiva material kan vara extremt osäker. Och försiktighetsåtgärder, såsom bär labbrockar, handskar och använda plexiglas sköldar för att minimera strålning bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumör Organoider från genetiskt modifierade musmodeller av prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...