Name: generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

CIBIO Trento Üniversitesi, gelişmiş görüntüleme tesis ve Viyana BioOptics ışık mikroskobu tesiste Max F. Perutz Laboratuvarları (MFPL), personel için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma Mahlke-Obermann Vakfı ve Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı araştırma, teknolojik gelişim ve gösteri için hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 609431 EC için fon aldı EC bir Rita Levi Montalcini bursu Eğitim Üniversite ve araştırma (MIUR) İtalyanca Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

1. Paromisin dayanıklı klonlar yelpazesi
<ol><li>%10 Fetal sığır Serum (FBS) 2 mM L-glutamin, penisilin (orta mL başına 0.5 birim) ve streptomisin (orta mL başına 0.2 µg) 37 ° C ve % 5 CO2ile takıma Ham'ın F-12_K (Kaighn'ın) orta AGS hücreleri büyümek. Vektör ve MS2 Kaset 1:10, ifade sgRNA/Cas9 ile % 50-60 izdiham hücreleri transfect molar oranı21. Not: paralel bir deneyde, GFP ifade vektör (Yani, Cas9-GFP vektör) transfecting tarafından transfection...

<ol>
	<li>Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+repeat+containing+RNA+and+RNA+surveillance+factors+at+mammalian+chromosome+ends.">Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.</a> Science. 318 (5851), 798-801 (2007).</li><li>Schoeftner, S., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+transcription+of+mammalian+telomeres+by+DNA-dependent+RNA+polymerase+II.">Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).</li><li>Diman, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+origin+and+nuclear+localization+of+TERRA+telomeric+repeat-containing+RNA:+from+Darkness+to+Dawn.">Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn.</a> FEBS Journal. , (2017).</li><li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha.">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li><li>Montero, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+recruitment+of+polycomb+to+telomeres+is+essential+for+histone+trymethylation+marks+at+telomeric+heterochromatin.">TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin.</a> Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).</li><li>Beishline, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+driven+TERRA+transcription+facilitates+completion+of+telomere+DNA+replication.">CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication.</a> Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells.">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220 (2014).</li><li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence.">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li><li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle.">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li><li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops.">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li><li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres.">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li><li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smc5/6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE.">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).</li><li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres.">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li><li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH.">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li><li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells.">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li><li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells.">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li><li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+noncoding+RNA:+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology.">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li><li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast.">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li><li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells.">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres.">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910 (2016).</li><li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+(TERRA)+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma.">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li><li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast.">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li><li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres.">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li><li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres.">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379 (2014).</li><li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells.">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).</li><li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors.">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li><li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators.">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li><li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes.">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation.">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li></ol>

Bu makalede biz insan kanser hücre klonlar subtelomere 15q içinde entegre MS2 dizileri içeren oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu klonlar kullanma, subtelomere 15q transkripsiyonu MS2 öğesini TERRA molekülleri floresans mikroskobu tarafından MS2 GFP füzyon protein ortak ifade tarafından tespit edilir. Bu yaklaşım tek bir ifade TERRA dinamiklerini incelemek araştırmacılar sağlar telomer yaşayan hücreleri21. Bu protokol için TERRA-MS2 klonlar TERRA, TERRA ifade upregulated ins...

Uzun kodlamayan RNA TERRA kromozomlar subtelomeric bölgesinden sentezlenir ve onun transkripsiyon içinde telomeric tekrar yolu1,2sonlandırma kromozom uçları doğru devam eder. Bu nedenle, TERRA transkript vasıl onların son 5' subtelomeric kaynaklı sıralarının oluşur ve telomeric tekrarlar (omurgalılarda UUAGGG)3ile bitirmek. Önemli rolleri önerdi TERRA için telomerlerin4,5, DNA çoğaltma6kromozom arasında Homolog rekombinasyon teşvik, heterochromatin formasyonu da dahil olmak üzere7,8 biter , telomer yapısını10ve telomer uzunluğu homeostazı2,11,12,13düzenleyen 9. Ayrıca, TERRA transkript yaygın gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücreleri14düzenleyen sayısız extratelomeric siteleri ile etkileşim. Bunlar doğrultusunda (RNA-balık) analizleri yalnızca alt küme küme küme kümesini TERRA transkript göstermiştir kanıt, RNA floresans in situ hibridizasyon yerelleştirmek telomerlerin1,2,15' de. Buna ek olarak, TERRA formu nükleer toplamları fare hücreleri2,16X ve Y kromozomu, yerelleştirme bildirilmiştir. Bu bulgular TERRA transkript çekirdek içinde karmaşık dynamics geçmesi göstermektedir. TERRA molekülleri dinamiklerini anlamak, işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olacaktır.
MS2 GFP sistem, canlı hücreler çeşitli organizmalar17,18RNA molekülleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu sistem daha önce etiket ve tek-telomer TERRA molekülleri S. cerevisiae12,19görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu sistemi kullanarak, bu son zamanlarda Maya TERRA tutanaklar içinde sitoplazma post-diauxic shift aşamasında TERRA extranuclear işlevleri20uygulamayın düşündüren yerelleştirmek gösterilmiştir. Son zamanlarda tek-telomer TERRA transkript kanser hücreleri21çalışmaya MS2 GFP sistemi kullandık. Bu amaç için MS2 dizileri tek telomer (telomer 15q, bundan sonra Tel15q), entegre etmek için CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı istihdam ve klonlar MS2 öğesini endojen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonları) ifade elde. Tanıyan ve yaşam MS2 RNA sıralarını etkinleştirir görselleştirme tek-telomer TERRA transkript bağlar GFP erimiş MS2 RNA-bağlayıcı protein (MS2-GFP) ortak ifade21hücreleri. TERRA-MS2 klonlar üretimi için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklamak için burada resimli Protokolü amacı budur.
TERRA-MS2 klonlar üretmek için MS2 kaset telomer 15q, bölgenin subtelomeric tümleşiktir, TERRA organizatörü bölge ve transkripsiyon başlangıç sitesi aşağı akım. Füme balığı-p siteleri tarafından çevrili bir paromisin direnç gen MS2 kaset içerir ve onun entegrasyon subtelomere 15q, CRISPR/Cas9 sistem22kullanılarak gerçekleştirilir. Kaset, tek klonlar MS2 transfection seçilir ve subtelomeric entegrasyon-in kaset PCR tarafından doğrulandıktan sonra DNA sekanslama ve Güney leke. Pozitif klonlar Cre ifade adenovirus ile sadece MS2 dizileri ve subtelomere 15q tek somon balığı-p sitesinde bırakarak kasete, seçim işaretçisi kaldırmak için bulaşmış. TERRA MS2 öğesini transkript Tel15q üzerinden ifade RT-qPCR tarafından doğrulanır. Son olarak, MS2 GFP füzyon protein ifade edilir MS2-TERRA transkript floresans mikroskobu tarafından görselleştirmek için retroviral enfeksiyon via TERRA-MS2 klonlar içinde. TERRA transkript RNA-balık tarafından kolayca tespit edilebilir ve1,2,15,23telomeric tekrar özel kullanarak canlı hücre görüntüleme sondalar. Bu yaklaşımlar TERRA molekülleri tek hücre çözünürlükte toplam nüfusu lokalizasyonu üzerinde önemli bilgiler sağlar. Klonlar MS2 dizileri, tek bir subtelomere içeren nesil araştırmacılar tek-telomer TERRA transkript işlevi ve mekanizmaları TERRA eylem tanımlamak yardımcı olacaktır canlı hücrelerdeki dinamikleri çalışmaya olanak sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1177px;" width="1178">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">AGS cells</td>
			<td style="width:246px;">-</td>
			<td style="width:105px;">-</td>
			<td style="width:583px;">Gift from Christian Baron (Universit&#233; de Montr&#233;al).</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">F12K Nut Mix 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21127022</td>
			<td>Culturing medium for AGS cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Component of cell culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21068028</td>
			<td>culturing medium for phoenix cell</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>used in phoenix cell transfection</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>used in phoenix cell transfection (HBS solution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>59430C</td>
			<td>used in cell split</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS 1X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:245px;">G-418 Disulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>G4185</td>
			<td>selection drug for&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gelatin solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10376743</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71729</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">RNAse A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12091021</td>
			<td>RNA degradation during DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>DNA gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Atlas ClearSight</td>
			<td>Bioatlas</td>
			<td>BH40501</td>
			<td>Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP28184</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td>Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wizard SV Gel and PCR clean-Up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trizol</td>
			<td>AMBION</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Organic solvent used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dnase I</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>89836</td>
			<td>degradation of genomic DNA from RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">dNTPs mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>used in RT and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>707265ML</td>
			<td>used in RT reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9381</td>
			<td>preparation of RNA gel</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Superscript III Reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>Retrotranscription reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pfu DNA polymerase (recombinant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0501</td>
			<td>PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td>
			<td>PCR BIOSYSTEMS</td>
			<td>PB 20.14</td>
			<td>qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cre-GFP adenovirus</td>
			<td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td>
			<td>1174-HT</td>
			<td>used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>used to promote retrovirus particles production in phoenix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEG8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Precipitation of retrovirus partcles</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35&#181;-Dish Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td>used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of cancer cell clones to visualize telomeric repeat-containing rna terra expressed from a single telomere in living cells

Telomer, sebebiyet veren telomeric için tekrar içeren-uzun kodlamayan RNA'ların (TERRA), hangi heterochromatin oluşumu ve telomer uzunluğu homeostasis gibi telomer biyolojide önemli rol oynarlar önerilen transkripsiyonu. Son bulgular TERRA molekülleri Ayrıca gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücre içinde düzenlemek için iç kromozom bölgeleri ile etkileşim ortaya koydu. Bu kanıtlar doğrultusunda sadece bir alt RNA floresans in situ hibridizasyon (RNA-balık) analizleri göstermiştir TERRA tutanaklar kromozom uçlarında yerelleştirilmesine. TERRA molekülleri dinamiklerini daha iyi anlaşılmasını işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olur. Burada, etiket ve tek-telomer TERRA transkript kanser hücrelerinde MS2 GFP sistemini kullanarak görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu amaçla, biz AGS insan mide kanseri hücre kültürünü tek bir subtelomere entegre MS2 dizileri içeren kullanarak istikrarlı klonlar, oluşturmak için bir protokol mevcut. TERRA transkripsiyon MS2 öğesini telomer üzerinden canlı hücre floresans mikroskobu GFP (MS2-GFP) erimiş MS2 RNA-bağlayıcı proteinin ortak ifade üzerine tarafından görüntülenmiştir MS2 öğesini TERRA molekülleri ifade sonuçlanır. Tek-telomer TERRA molekülleri kanser hücrelerinin dinamiklerini incelemek araştırmacılar bu yaklaşım sağlar ve diğer hücre hatları için uygulanabilir.

Şekil 1 deneysel stratejisi genel bir bakış temsil eder. Protokol ve TERRA-MS2 klonlar AGS hücrelerdeki nesil için Gösterge niteliğindeki bir zaman çizelgesi ana adımları (Şekil 1A) gösterilir. Gün 1, 6 iyi tabakta birden çok kuyu MS2 kaset ve sgRNA/Cas9 ( Şekil 1'Bgösterilen) vektörel çizimler ifade ile transfected. İki farklı subte...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells at JoVE.com

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Bu yöntem Telomerler hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, maya telomerik olmayan kodlama RNA TERRA lokalizasyonu gibi, ve ben kökenli telomer veya trans ısrar edebilirsiniz, farklı bir cromes-mants Bu tekniğin ana avantajı araştırmacılar yaşam hücrelerinde tek bir telomer ifade TERRA molekülleri ifade görselleştirmek için izin verir. Prosedürü gösteren Claudio Oss Pegorar ve Nicole Bettin, benim laboratuvar iki lisansüstü öğrencileri olacaktır. Metin protokolüne göre AGS hücrelerini büyütmeye başlamak için.Daha sonra hücreler %50-60'a ulaştığında sgRNA Cas9 ile transpect ve MS2 kaseti ile onları dönüştürün. Ertesi gün neomisin içeren orta ile culturing orta değiştirin. Bu 96 iyi plaka her kuyuya% 0.25 Tripsyn 10 mikrolitre ekleyin.Bir mikroskop ve bir işaretleyici kullanarak, çanakgörünür her klonun konumunu işaretleyin. Klonlar üzerinde sıvı ince bir film oluşturmak için yeterli PBS ile Neomisin kültür ortamı değiştirin. Trypsin beş mikrolitre içeren 10 mikrolitrelik pipet kullanarak, yavaş yavaş koloni üzerine Tripsin bırakın.Trypsin'in hücreleri bir dakika lığına ayırmasına izin verin. Ucu ile koloni kazıyın ve ucu içine emmek. Bundan sonra, koloniden hücreleri 96 kuyunun bir kuyuya aktarın.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca tabağı kuluçkaya yatırın. Daha sonra 150 mikrolitre seçici ortam ile kuyuyu doldurun. Daha sonra, üç 96 kuyu plakası her kuyuya 100 mikrolitre jelatin ekleyin.Tabakları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve plakaları iki kez PBS ile yıkayın. Klonlar %90 birleştiğinde, tabağın her kuyudan orta yıkın ve Plakayı PBS ile yıkayın. Sonra her kuyuya 30 mikrolitre Trypsin ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Daha sonra, kuyuların her birine 70 mikrolitre seçici ortam ekleyin. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak hücreleri bozun. Karışımın 30 mikrolitresini 120 mikrolitre seçici ortam içeren jelatinize EDILMIŞ DNA plakasının kuyuya aktarın.Daha sonra karışımın 30 mikrolitresini 50 mikrolitre orta içeren jelatinize dondurma plakasına aktarın. DNA'yı kuvöze yerleştirin ve hücrelerin %90'lık bir araya gelene kadar 37 derecede büyümesine izin verin. Bundan sonra, dondurucu plaka her kuyuya buz gibi donma ortamı 80 mikrolitre ekleyin.Plakayı parafilmle kapatın, kapağı değiştirin ve plakayı alüminyum folyoya sarın. O zaman dondurucu plakaları 80 derecede saklayın. DNA plakasındaki klonlar %90 birleştiğinde plakayı iki kez PBS ile yıkayın.Daha sonra hücreleri 50 mikrolitre Lysis tamponu ile lyse. Plakayı parafilm ile kaplayın, kapağı nı değiştirin ve plakayı saran sargınla sarın. Bundan sonra, bir gecede 37 santigrat derece plaka kuluçka.Ertesi gün her kuyuya 100 mikrolitre etanol sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca DNA yağışına izin verin. Sonra plaka ters ve iyi başına% 70 etanol 200 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Plakanın her bir kuyusuna 20 mikrolitre RNase Bir çözelti saekleyin ve plakayı bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, PCR amplifikasyon için genomik DNA üç mikrolitre kullanın ve PCR makine kurulum. PCR pozitif klonları metin protokolüne göre altı kuyu plakasında büyütün. Klonlar %90 birleştiğinde hücreleri PBS ile yıkayın ve her kuyuya Proteinaz K ile 250 mikrolitre Lysis tamponu ekleyin.Hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 1.5 mililitrelik bir tüp için Lysate aktarın. Lysate'yi 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Lysate etanol bir mililitre ekleyin ve şiddetle sallayın.Klonların metin protokolüne göre F-12K ortamda büyümesine izin verin. Sonra hücrelere Cre-expressing adenovirüs ekleyin bir kez onlar% 70 birleştiğinde. Enfeksiyondan 48 saat sonra hücreleri 10 santimetrelik üç alana böl.Sonra kültür hücre dondurma ve RNA çıkarma için üçüncü yemekleri. İlk olarak, terra-MS2 klonları ve cam alt tabaklarda yabani tip AGS hücreleri plaka. Sonra polibrene ve MS2-GFP orta retrovirüs ifade ekleyin.24 saat sonra retrovirüs içeren orta atın ve hücrelere fenol kırmızı olmadan taze orta ekleyin. Son olarak, ters bir mikroskop ve hassas bir kamera görüntüsü kullanarak uygun amaç ve diyafram ile hücreleri. Bu protokolde tek bir subtelomerde MS2 dizi etiketi içeren kanser hücresi klonları oluşturuldu ve görüntülendi.Neomisin dirençli klonlar PCR kullanılarak tarandı. Pozitif klonlar genomik DNA ekstraksiyonu ve Güney leke analizi için lysed olarak kültürlendi. PCR ve Güney leke analizi pozitif klonlar MS2 kasetmevcut Neomisin geni kaldırmak için Adenovirüs ifade CRE-GFP ile enfekte edildi.Neomisin direnç geninin ortadan kaldırılması onaylandıktan sonra, klonlardan çıkarılan RNA TERRA-MS2 transkriptlerinin ekspresyonu için test edildi. Canlı hücrelerde TERRA-MS2 transkriptlerini konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için seçilen klonlara MS2-GFP füzyon proteinini ifade eden retrovirüs bünyesine biçildi. TERRA-MS2 transkriptleri ve telomerler eşzamanlı olarak konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde MS2-GFP füzyon proteini ve seçilen klonlarda bir mCherry erimiş telomer bağlayıcı protein, TRF2 ile görselleştirildi.Bu yordamı denerken, karma bir klon popülasyonu yerine tek bir klon seçmek için her türlü çabayı göstermen önemlidir. Bu işlemden sonra, kromozom yayılımı ndaki DNA FISH gibi diğer yöntemler, MS2 kasetinin sabit hücrelere entegrasyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, gelişiminden sonra telomerler alanında araştırmacıların yaşayan insan hücrelerindeki tek telomer TERRA moleküllerinin hücresel lokalizasyonunu keşfetmelerinin önünü açabilir.Viral vektörler ve radyoaktif maddeler ile çalışan son derece belirsiz olabileceğini unutmayın. Ve bu işlemi yaparken, laboratuvar önlükleri, eldivenler ve radyasyonu en aza indirmek için pleksiglas kalkanlar kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...