Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/NIDCD البحوث الداخلية الأموال 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). نود أن نعترف وونغ حلوى لمساعدتها في كتابة الماكرو فيجي. كما نود أن نشكر وو دوريس والحلوى وونغ لاقتراحاتهم مفيدة مع البروتوكول.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في فيفو التصوير في الحيوانات سليمة أصلاً صعبة. العديد من الخطوات في هذا الأسلوب حاسمة للحصول على موثوقية في فيفو القياسات الكالسيوم من خلايا الشعر الخط الجانبي. على سبيل المثال، من المهم جداً أن اليرقة معلقة وشلت بشكل صحيح قبل التصوير لتقليل حركة أثناء التصوير. الحركة الزائدة أثناء التصوير يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الأسفار GCaMP6s ليست إشارات حقيقية ولا تتوافق مع التغييرات في مستويات الكالسيوم (مثلاً، 4B1 الأرقام '-B1 '' و 4 ج 1'-C1 ''). يمكن وضع دبابيس الذيل أكثر من الأسفل للمساعدة في تقليل الحركة، على الرغم من أن هذا قد يجعل نيوروماستس الخلفي أكثر غير قابل للوصول. وعلاوة على ذلك، بعد حقن القلب، يمكن تدويرها دبابيس الرأس حيث أن الجزء الأفقي من pin يكمن عبر صفار البيض. بالإضافة إلى تغيير موقف دبابيس، من الممكن أيضا استخدام قيثارة شريحة الدماغ بدلاً من دبابيس لشل اليرقات34. عند وضعها فوق اليرقات بشكل صحيح، قيثارة إضافية، يحتمل أن تكون أقل أسلوب الغازية لشل حركة اليرقات. بينما يمكن أن تؤدي حركة كبيرة من التثبيت غير كافية، يمكن أن يؤدي إلى الشلل غير مكتملة، الحركة، عدم القيام بشكل صحيح بحقن القلب تسليم α-بونجاروتوكسين ويشل اليرقات والحركة في نهاية المطاف التحف. على الرغم من أن المسكنات الشائعة الاستخدام قد ثبت أن تؤثر على استثارة خلايا الشعر الزرد، قد أظهرت الأعمال الأخيرة أن البنزوكائين مخدر لا تتداخل مع كثير من جوانب نشاط خلايا الشعر. وبالمثل، استخداماً الأكثر مخدر MS-222 إلا يتداخل مع جوانب معينة من نشاط خلايا الشعر15. ولذلك، نظراً للطبيعة الصعبة لحقن α-بونجاروتوكسين، البنزوكائين أو مرض التصلب العصبي المتعدد-222 التطبيق يمكن أن تكون طريقة بديلة مفيدة للشلل لمنع الحركة في اليرقة أثناء تصوير الكالسيوم الوظيفية.
وبالإضافة إلى التحديات التقنية التي ينطوي عليها هذا البروتوكول، عينة محملة تماما حتى عديمة الفائدة إذا لم صحية قبل وأثناء كل تجربة التصوير اليرقة وخلايا الشعر. للتأكد من أن خلايا الشعر واليرقات يتمتعون بصحة جيدة، من المهم الإبقاء على اليرقات في المخزن المؤقت E3 خالية من الحطام مثل تشوريونس (قشرة البيض)، والنفايات، والكائنات الحية الدقيقة. على الرغم من أن موقع سطحية لخلايا الشعر الخط الجانبي مفيد للتصوير، هذا الموقع يجعلها أكثر عرضه للأضرار الخلوية عند المخزن المؤقت E3 عرقلة. بيئة نظيفة ومائي مهم بشكل خاص للشباب اليرقات (2-4 إدارة الشرطة الاتحادية) أو طفرات لا يمكن الاحتفاظ حوض تستقيم الموقف وتكمن أساسا في الجزء السفلي من صحن بيتري. وفي هذه الحالات، خلايا الشعر الخط الجانبي وكبولا الواقية المحيطة بحزم الشعر يمكن بسهولة تصبح الشبهة. حتى عند بدء تشغيل مع يرقات سليمة وخلايا الشعر، طوال كل تجربة، أنها حاسمة لضمان أن اليرقة ضربات القلب وتدفق الدم السريع. إذا كان يؤدي إلى إبطاء تدفق الدم أو توقف، يمكن أن تصبح الشبهة صحة خلايا الشعر. الاستعدادات الشبهة التي تنطوي على اليرقات غير صحية أو فقدان تدفق الدم، موت خلايا الشعر يمكن تحديد عدة طرق: الأولى، بظهور كاريوبيكنوسيس أو التكثيف النووية، الذي يظهر كفقاعة داخل الخلية تحت DIC البصريات؛ وثانيا، بانكماش الخلية ووجود سرعة نقل الجزيئات داخل السيتوبلازم؛ وثالثاً، عندما تباعد نصائح كينوسيليا في اتجاهات مختلفة35. عندما تتعطل حزم الشعر، لا تنتقل كينوسيليا مفلطح متماسك معا خلال التحفيز.
هذا الإعداد قد العديد من القيود البسيطة، أحدها أن الإعداد فقط لا تزال قوية لمدة 1-3 ساعات بعد إنشائه. التعديلات مثل استخدام دبابيس صغيرة أو شريحة الدماغ الإصرار على شل اليرقات وإضافة نظام التروية يجوز تمديد مدة بقاء هذا الإعداد في فيفو . قيد آخر هو أن فوتوبليتشينج ويمكن أن تحدث لالضيائيه بعد تكرار تصوير المحاكمات. طريقة مثيرة للتغلب على هذا التحدي تكييف هذا البروتوكول للضوء--ورقة الفحص المجهري. الضوء-ورقة الفحص المجهري وسيلة قوية للحد من تركيز الضوء، مما يؤدي إلى أقل فوتوبليتشينج ولالضيائيه36. معا، قد يساعد التثبيت الطف وتعرض صور أقل إطالة كل دورة التصوير. دورات التصوير لم يعد يمكن استخدامها لفحص كامل مدة التغييرات الفنية المصاحبة للتنمية والعمليات الأساسية لإزالة الشعر-الخلية وتجديدها بعد الإصابة. من المهم أن نشير إلى أنه، بالإضافة إلى الفحص المجهري ورقة الضوء، هذا البروتوكول يمكن تكييفها مع سائر أنواع نظم [كنفوكل] (القرص مسح نقطة، 2-فوتون، والغزل) فضلا عن أنظمة بسيطة نسبيا ويديفيلد28،34 . وعموما، براعة يجعل هذا البروتوكول أداة قيمة التي يمكن تكييفها واستخدامها مع أنظمة التصوير متعددة.
وفي حين يمكن تكييفها واستخدامها مع العديد من أنظمة التصوير هذا البروتوكول، يمكن تكييفها أجزاء من هذا البروتوكول واستخدامها (1) مع مؤشرات أخرى إلى جانب GCaMP6s و (2) إلى صورة النشاط في الخلايا الحسية والخلايا العصبية داخل الزرد اليرقات الأخرى. على سبيل المثال، في دراسة سابقة، استخدمنا هذا البروتوكول إلى نشاط الصورة باستخدام عدة مؤشرات المرمزة وراثيا داخل خلايا الشعر الخط الجانبي لكشف حويصلة الانصهار (سيفي) والغشاء الجهد (بونجووري)، سيتوسوليك الكالسيوم (RGECO1) والغشاء الكالسيوم (كا jRCaMP1a و GCaMP6s-كا)، وفي إطار عمليات الزبائ الخط الجانبي للكشف عن غشاء الكالسيوم (GCaMP6s-كا)5. استناداً إلى خبرتنا في استخدام هذه المؤشرات، السطر المعدلة وراثيا Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر بداية ممتازة للتصوير النشاط في نيوروماستس الخط الجانبي. جميع المؤشرات المذكورة أعلاه، وقد وجدنا أن GCaMP6s هو الأكثر حساسية وفوتوستابل. وبالإضافة إلى هذه الميزات، نسلط الضوء على خط Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) المعدلة وراثيا لأنه يمكن استخدامه لإجراء قياسات منفصلة اثنين: ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والكالسيوم presynaptic ضمن سطر واحد محوره وراثيا.
تقنية الموضحة في هذه المقالة يوضح كيف يمكن تصوير الكالسيوم في الخط الجانبي الزرد وسيلة قوية لدراسة الكيفية التي تعمل بها خلايا الشعر في بيئتها الأصلية. وهذا النهج مكمل لدراسات ثدييات في الشعر-الخلية التي يجري حاليا دراسة الدالة في explants فيفو السابقين . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مواصلة النموذج الزرد لاستخدامها كمنصة لاختبار فعالية مؤشرات وراثيا المرمزة التي يمكن تطبيقها بعد ذلك دراسة النشاط في خلايا الثدييات الشعر.

تصوير الكالسيوم الفنية هو أداة قوية يمكن استخدامها لمراقبة نشاط العديد من الخلايا في وقت واحد1. على وجه الخصوص، قد ثبت التصوير الكالسيوم باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يكون مفيداً لأنه جيسيس يمكن التعبير عنها في أنواع محددة من الخلايا ومترجمة سوبسيلولارلي2. في أبحاث علم الأعصاب، جعلت هذه الميزات تصوير الكالسيوم جيسيس باستخدام وسيلة قوية كل تعريف أنماط النشاط داخل الشبكات العصبية وقياس تدفق الكالسيوم في نهايات الفردية3،4. الاستفادة من هذه الميزات، دراسة أجريت مؤخرا استخدام [كنفوكل] مجهرية وجيسيس لمراقبة نشاط سوبسيلولار ضمن مجموعات من خلايا حسية الشعر5.
خلايا الشعر هي ميتشانوريسيبتورس التي تكشف عن المحفزات سليمة والدهليزيه في الإذن الداخلية وحركة المياه المحلية في نظام الخط الجانبي في6،فيتيبراتيس المائية7. خلايا الشعر غالباً ما تكون هدفا لضرر أو طفرات وراثية تؤدي إلى الشكل الأكثر شيوعاً لفقدان السمع في البشر المعروفة باسم فقدان السمع الحسي8،9. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف أن هذه وظيفة الخلايا من أجل فهم كيفية علاج ومنع فقدان السمع. لتعمل بشكل صحيح، استخدام خلايا الشعر اثنان هياكل متخصصة تسمى حزم ميتشانوسينسوري الشعر وشرائط متشابك لكشف ويحيل المحفزات، على التوالي. باقات الشعر تقع على قمة خلايا الشعر، وتتكون أساسا من نتوءات الجميلة، مثل الشعر المعروف باسم ستيريوسيليا (الشكل 1أ). في خلايا الشعر الدهليزية والخط الجانبي، يحتوي كل حزمة الشعر أيضا كينوسيليوم طويلة واحدة (هدب الحقيقي الوحيد للخلية)، التي يمكن أن تمتد أعلى بكثير من ستيريوسيليا (الشكل 1أ). المحفزات ميتشانوسينسوري يصرف حزم الشعر، ويضع انحراف التوتر على الروابط التي تسمى "نصيحة-ارتباطات" التي تربط بين ستيريوسيليا10. هذا التوتر يفتح قنوات ميتشانوترانسدوكشن (MET) يقع في ستيريوسيليا، أدى إلى تدفق الاتصالات، بما في ذلك11،الكالسيوم12قمي. في نهاية المطاف هذا النشاط قمي ديبولاريزيس الخلية الشعر ويفتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة (Cav1.3) في قاعدة الخلية. وتوجد قنواتv1.3 Ca المتاخمة لشرائط متشابك، بنية presynaptic الحبال حويصلات في المناطق النشطة. تدفق الكالسيوم القاعدية من خلال قنواتv1.3 Ca مطلوب للانصهار حويصلة، كبيرة، وتنشيط الخلايا العصبية الزبائ13،14.
لسنوات عديدة، استخدمت تقنيات الكهربية مثل تصحيح كامل الخلية لقط لسبر الخصائص الوظيفية لخلايا الشعر في كثير من الأنواع، بما في ذلك الزرد15،،من1617، 1819،،20. وكانت هذه التسجيلات الكهربية قيمة خاصة في مجالات السمع والتوازن لأنه يمكن استخدامها للحصول على قياسات بالغة الحساسية من الخلايا الحسية الفردية، الذي يهدف إلى ترميز المحفزات سريع للغاية على مدى الحصول على مجموعة واسعة من الترددات وكثافات21،22. ولسوء الحظ، لا يمكن قياس كامل الخلية تسجيلات نشاط سكان خلايا الشعر. دراسة نشاط سكان خلايا في السطر الأفقي الزرد، إمكانيات ميكروفونيك وإمكانات العمل الزبائ قد استخدمت لقياس ميتشانوسينسيتيفي summed واستجابة بوستسينابتيك خصائص فردية نيوروماستس23 ،24. ولسوء الحظ، لا من تسجيلات كامل الخلية لا القياسات الميدانية المحلية المحتملة لها القرار المكانية لتحديد أين النشاط هي التي تحدث داخل خلايا فردية أو قياس نشاط كل خلية داخل مجموعة من سكان. في الآونة الأخيرة، استخدمت الأصباغ الكالسيوم وجيسيس لتجاوز هذه التحديات25،26.
في الزرد، أثبتت جيسيس نهج قوية لدراسة وظيفة خلايا الشعر بسبب السهولة النسبية لخلق الزرد المعدلة وراثيا والوضوح البصري لليرقات27. يرقات الزرد، يوجد خلايا الشعر في الإذن الداخلية، فضلا عن نظام الخط الجانبي. الخط الجانبي تتكون من مجموعات روزيت مثل خلايا الشعر تسمى نيوروماستس التي تستخدم للكشف عن التغييرات المحلية في حركة المياه (الشكل 1). الخط الجانبي مفيد بشكل خاص لأنه يقع خارجياً على طول سطح السمك. مكن هذا الوصول تحفيز خلايا الشعر وقياس إشارات الكالسيوم بصريا في يرقات سليمة. وعموما، جعلت سهولة ترانسجينيسيس، الشفافية لليرقات، والوصول لا مثيل لها من خلايا الشعر الخط الجانبي الزرد نموذجا لا تقدر بثمن لدراسة نشاط الشعر الخلايا الحية. هذا هو ميزة كبيرة بالمقارنة مع نظم الثدييات فيها خلايا الشعر محاطة بالهياكل العظمية للإذن الداخلية. وهذا الافتقار إلى الوصول إلى جعلت من الصعب جداً الحصول على القياسات المجراة في الوظيفية لخلايا الثدييات الشعر.
البروتوكول الواردة هنا وصف كيفية رصد التغيرات تعتمد على القناة وبريسينابسي MET في الكالسيوم داخل خلايا فردية في الشعر وبين الخلايا داخل نيوروماستس في الزرد اليرقات. هذا البروتوكول يستخدم خط الزرد المعدلة وراثيا الراسخة التي تعرب عن GCaMP6s المترجمة بغشاء تحت سيطرة المروج محددة myosin6b خلايا الشعر28. مواقع هذا التعريب غشاء GCaMP6s للكشف عن تدفق الكالسيوم من خلال قنوات أيون يقع في غشاء البلازما التي تعتبر حاسمة بالنسبة لوظيفة خلايا الشعر. على سبيل المثال، يمكن الكشف عن المترجمة بغشاء GCaMP6s الكالسيوم التدفق من خلال MET القنوات في حزم قمي الشعر وعن طريق كاليفورنياالخامسقنوات 1.3 قرب شرائط متشابك في قاعدة الخلية. وهذا يتناقض مع استخدام جيسيس المترجمة في سيتوسول، كما كشف جيسيس سيتوسوليك الإشارات الكالسيوم التي مزيج من نشاط القناة 1.3VMET وكاليفورنيا، فضلا عن مساهمات الكالسيوم من مصادر أخرى (مثل الإصدار المخزن، ). هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية شل ويشل اليرقات GCaMP6s المعدلة وراثيا قبل التصوير. ثم توضح هذه المقالة كيفية إعداد واستخدام طائرة سائل لتحويل حزم الشعر لتحفيز خلايا الشعر الخط الجانبي بطريقة الخاضعة للرقابة واستنساخه. وترد البيانات التمثيلية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول. وترد أيضا أمثلة للبيانات التي تمثل حركة القطع الأثرية. ويرد وصف تجارب التحكم التي يتم استخدامها للتحقق من النتائج واستبعاد القطع الأثرية. أخيرا، يتم وصف طريقة لتصور إشارات الكالسيوم المكانية في البرنامج فيجي. هذا التحليل فيجي مقتبس من أساليب التصور المحددة سابقا تم تطويرها باستخدام MATLAB5. عموما، هذا البروتوكول يحدد أسلوب إعداد قوية يستخدم جيسيس في الزرد اليرقات لقياس ووضع تصور لخلايا الشعر الكالسيوم ديناميات المجراة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

هي خلايا حسية الشعر mechanoreceptors الموجودة في الإذن الداخلية المطلوبة للسمع والتوازن. يتم تنشيط خلايا الشعر في الاستجابة للمحفزات الحسية التي يصرف ميكانيكيا قمي نتوءات تسمى حزم الشعر. انحراف يفتح قنوات ميتشانوترانسدوكشن (MET) في حزم الشعر، مما يؤدي إلى تدفق الاتصالات، بما في ذلك الكالسيوم. هذا التدفق الموجبة ديبولاريزيس الخلية ويفتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة الموقع بسالي على بريسينابسي خلايا الشعر. في الثدييات، وهي المغطى خلايا الشعر في العظام، وأنه يمثل تحديا لتقييم هذه الأنشطة المجراة في وظيفيا. وفي المقابل، اليرقات الزرد شفافة وتمتلك جهازا خارجياً يقع الخط الجانبي الذي يحتوي على خلايا الشعر. هذه الخلايا الشعر مماثلة وظيفيا وهيكليا لخلايا الثدييات الشعر ويمكن أن يكون تقييما وظيفيا المجراة. توضح هذه المقالة تقنية أن يستخدم مؤشر كالسيوم مشفرة جينياً (جيتشي)، إشارات GCaMP6s، لقياس آثار التحفيز الكالسيوم في خلايا الشعر الزرد الخط الجانبي. يمكن استخدام GCaMP6s، جنبا إلى جنب مع التصوير [كنفوكل]، لقياس إشارات الكالسيوم في المجراة في قمة وقاعدة لخلايا الشعر الخط الجانبي. وتوفر هذه الإشارات قراءات في الوقت الحقيقي، وقابلة للقياس لكل أنشطة تعتمد على ميتشانوسينسيشن وبريسينابسي الكالسيوم داخل هذه الخلايا الشعر. كما توفر هذه الإشارات الكالسيوم المعلومات الفنية الهامة فيما يتعلق بكيفية الكشف عن خلايا الشعر ويحيل المنبهات الحسية. عموما، هذا الأسلوب بإنشاء بيانات مفيدة عن التغيرات النسبية في نشاط الكالسيوم في الحية. أقل مناسبة تماما للتحديد الكمي لحجم التغييرات الكالسيوم المطلقة. هذا الأسلوب في الحية حساس للتحف الحركة. كمية معقولة من الممارسة والمهارة مطلوبة من أجل تحديد المواقع المناسبة والتثبيت، والتحفيز لليرقات. في نهاية المطاف، عند تنفيذ بشكل صحيح، ينص البروتوكول على الموضحة في هذه المقالة طريقة قوية لجمع معلومات قيمة عن النشاط خلايا الشعر في الدول الطبيعية، متكاملة تماما داخل الحيوانات حية.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

الزرد هو نظام نموذج العديد من الميزات القيمة بما في ذلك الوضوح البصري، التنمية الخارجية السريعة،، وأهمية خاصة في مجال السمع والتوازن، خارجياً يقع خلايا الشعر حسية. توضح هذه المقالة الزرد كيف المحورة وراثيا يمكن استخدامها للاعتداء ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والدالة بريسينابتيك بكاملها.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجال السمع والتوازن. وهو يصف كيفية الكشف عن جانبين هامين من وظائف خلايا الشعر الحسية، mechanotransduction والنشاط presynaptic. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتصور وظيفة خلايا الشعر في حي ، ودراسة كيفية اكتشاف مجموعات خلايا الشعر ونقل المعلومات الحسية.لبدء هذا الإجراء ، استخدم ملقط غرامة وسلك التنغستن لأزياء الدبابيس لاستخدامها لشل حركة اليرقة من خلال الرأس والذيل ، على انكبسولانت تصلب. لجعل دبابيس الرأس، عقد قطعة من 0.035 ملليمتر سلك التنغستن في يد واحدة. باستخدام ملقط غرامة في اليد الأخرى، ثني السلك ملليمتر واحد من نهاية، في 90 درجة.تبادل ملقط لمقص غرامة، وقطع ملليمتر واحد بعد الانحناء، لإنشاء دبوس. ثم استخدام ملقط لإدراج دبابيس في التغليف تصلب على الغرفة. ضع اليرقة في مركز غرفة الضخ بحيث تقع مسطحة على جانبها ضد السيليكون.باستخدام ملقط غرامة، وجلب دبوس الرأس 0.035 ملليمتر إلى أسفل عمودي على اليرقة. إدراج دبوس الرأس بين العين والزهية otic، وإلى أسفل في encapsulant. استخدام مجموعة ثانية من ملقط لتحقيق الاستقرار اليرقة على طول الجانب الظهري والبنتينتال، في حين تعلق.تأكد من أن الجزء الأفقي من دبوس اتصالات اليرقة ولا تضغط على طول الطريق إلى encapsulant. زاوية فيبطينا دبوس، أو مشيرا قليلا نحو الجزء الأمامي من اليرقة، لتجنب التدخل في حقن القلب اللاحقة وتصوير خلايا الشعر. باستخدام ملقط، إدراج دبوس ذيل 0.025 ملليمتر في نوتوكورد، أقرب ما يمكن إلى نهاية الذيل.لحقن البونغاروكسيون ألفا في اليرقة، الردم ثلاثة ميكرولترات من المحلل في إبرة الحقن، وذلك باستخدام تلميح ماصة هلام التحميل. تحميل الحل بالتساوي إلى طرف، مع عدم وجود فقاعات. ثم أدخل إبرة حقن القلب في حامل ماصة مرفقة بمترجم دقيق يدوي.تحت مجهر ستيريو، ضع الإبرة بحيث يتم محاذاتها عمودياً على محور AP لليرقة المُعامَدة، مع الإشارة إلى أسفل بزاوية 30 درجة. المقبل، ربط حامل ماصة إلى حاقن الضغط. حقن بولوس من بونغارotoxin ألفا في الحل، لاختبار ما إذا كان تلميح إبرة واضحة.إذا لم ينظر إلى اللون الأحمر، كشط بلطف جدا تلميح إبرة ضد حافة دبوس، وحاول مرة أخرى، حتى الإبرة واضحة. في وقت لاحق، تقدم الإبرة نحو القلب، حتى تلامس الجلد خارج القلب. اضغط الإبرة في اليرقة ، وابحث عن المسافة البادئة للخلية الصباغية على الجلد أمام القلب للتأكد من وضع الإبرة في الطائرة الصحيحة ، نسبة إلى اليرقة.ثم، تقدم الإبرة أبعد، حتى يخترق الجلد ويدخل تجويف القلب. سحب الإبرة إلى الوراء قليلا، وحقن بولوس من بونغاروكسيمين ألفا في تجويف القلب. ابحث عن تضخم تجويف القلب، أو للصبغة الحمراء التي تدخل التجويف.شطف اليرقة بلطف ثلاث مرات ، مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت العصبي لإزالة MS222 المتبقية. لا تقم بإزالة كل السائل. الحفاظ على اليرقة في ما يقرب من 1 ملليلتر من العازلة العصبية في غرفة الضخ.في هذا الإجراء الردم 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت نيرونال في إبرة مكسورة بشكل صحيح السائل النفاث باستخدام تلميح تحميل هلام. تحميل الحل بالتساوي إلى طرف دون فقاعات. ثم، أدخل الإبرة في حامل الماصات المرفقة بالمانوميبولات الآلية.ضع غرفة التسريب في محول غرفة دائرية على مرحلة المجهر. نقل المرحلة الآلية بحيث تكون اليرقة في وسط مجال الرؤية. في وقت لاحق ، قم بتشغيل محول الغرفة الدائرية بحيث يتم محاذاة وصول AP إلى اليرقة تقريبًا مع مسار إبرة السائل النفاث.باستخدام الضوء المنقول والتداخل التفاضلي النقيض، جعل اليرقة في التركيز ومركزها تحت الهدف 10x. ثم، رفع الهدف 10x. باستخدام micromanipulator الآلية، وجلب إبرة السائل النفاثة إلى أسفل إلى وسط مجال الرؤية، لذلك يتم مضيئة من قبل الضوء المنقول وبالكاد لمس العازلة العصبية.خفض الهدف 10x للتركيز على اليرقة من أجل تأكيد موقعها. فووس الهدف على إبرة السائل النفاثة. حرك إبرة السائل النفاثة مع المايكرومانيبولاتور في محور س و ص حتى تكون في وضع مواز للجانب الظهري من اليرقة.بعد ذلك ، ركز مرة أخرى على اليرقة. جلب الإبرة إلى أسفل في محور ض ووضع الإبرة على طول الجانب الظهري من الأسماك، 1 ملليمتر بعيدا عن الجسم. قم بتحريك محول الغرفة الدائري بعناية لضمان محاذاة إبرة السائل النفاثة على طول خط منتصف اليرقة AP.بعد ذلك، انتقل إلى الهدف 60x المياه. تأكد من أن الهدف هو emersed في المخزن المؤقت العصبي. استخدام التركيز غرامة لتحديد مكان العصبية.نقل مرحلة motarized في وقت لاحق لوضع العصبية من الفائدة في مركز مجال الرؤية. الحفاظ على تلميح إبرة نفاثة السوائل على طول الجانب الظهري من الأسماك. لا تلمس تلميح إبرة السائل النفاث إلى اليرقة أو سطح الغرفة.ضع إبرة السائل النفاثة مع ميكرومانبولاتور بحيث تكون 100 ميكرومتر من الحافة الخارجية للstmast. ثم، والتركيز على نصائح من حزم الشعر apical. يجب أن يكون الجزء السفلي من إبرة السائل النفاثة في التركيز في هذه الطائرة.قم بتعيين المشبك عالي السرعة من الدليل إلى الوضع الخارجي لتلقي مدخلات من برنامج التصوير. صفر المشبك الضغط عالية السرعة عن طريق الضغط على زر الصفر، واستخدام مقبض نقطة تعيين لضبط الضغط يستريح إيجابية قليلا. تأكد من إخراج الراحة من المشبك ضغط السرعة العالية باستخدام مانديوميتر PSI تعلق على إخراج مرحلة الرأس.لتحديد الضغط اللازم لتحفيز حزم الشعر، وتطبيق التحفيز اختبار مع 0.125 و 0.25 فولت الإخراج ل200-500 ميلي ثانية. لكل حافز اختبار، وقياس المسافة من انحراف من نصائح من hairbundles، و kinocilia. اختر الضغط الذي يحرك الحزم على مسافة 5 ميكرومتر تقريبًا.تأكد من أن نصائح kinocilia تبقى في التركيز طوال الوقت. للحصول على صور ذات مستوى واحد، حدد حافزًا لتقديمه أثناء عملية الاستحواذ على الإطارات 80، بعد الإطار 30، في 3 ثوانٍ. لقياس استجابات الكالسيوم الحساسية، والتركيز على قاعدة حزم الشعر apical والبدء في الحصول على صورة.لقياس استجابات الكالسيوم presynaptic، والتركيز على قاعدة خلايا الشعر، والبدء في الحصول على صورة. وترد هنا الخطوات اللازمة لتصور التغيرات الزمانية في كثافة GCaMP6S، داخل نطاق عصبي أثناء المحاكاة. يتم تمثيل الوقت من اليسار إلى اليمين وفقا للطابع الزمني.يظهر الصف العلوي خمسة من أربعة عشر صناديق الزمنية من تسلسل صورة GCaMP6S F 70 إطار. في الصف الثاني، تمت إزالة الخط الأساسي من كل صورة GCaMP6S F binned لإنشاء صور دلتا F. في الصف الثالث، تم تحويل الصور دلتا F من مقياس رمادي، إلى جدول بحث ساخن أحمر.في الصف السفلي، تم تراكب الصف الثالث على الصور F في الصف العلوي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التأكد من أن اليرقة مثبتة بشكل صحيح وأن تستخدم عناصر التحكم المناسبة، كما هو موضح في المخطوطة لاستبعاد الآثار المتحركة من بياناتك. يمكن أن يكون العمل مع البونغاروكسيسين ألفا خطرة.من المهم اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات أثناء التعامل معها.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

الدماغ الأمامي تسجيل الكهربية في الزرد اليرقات

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

نشاط الخلايا العصبية الجانبية الخلفية Afferent خلال السباحة في حمار وحشي

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

نموذج قابل للتطوير لدراسة آثار إصابة القوة الحادة في سمك الحمار الوحشي البالغ

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

المكوك مربع المقايسة كأداة التعلم النقابي للتقييم المعرفي في التعلم ودراسات الذاكرة باستخدام حمار وحشي الكبار

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...