Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

这项工作得到了 nih/nidcd 校内研究基金 1ZIADC000085-01 (k. s. k.) 的支持。我们要感谢 c迪 wong 在编写斐济宏方面提供的协助。我们还要感谢吴多丽丝和黄坎迪对协议提出的有益建议。

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作者没有什么可透露的。

在完整的动物体内成像本质上是具有挑战性的。这种方法的几个步骤对于从侧系毛细胞中获得可靠的体内钙测量至关重要。例如, 在成像之前正确地固定和麻痹幼虫, 以最大限度地减少成像过程中的运动, 这一点非常重要。成像过程中的过度运动会导致 gcmp6 荧光的变化, 这些变化不是真实的信号, 也不符合钙水平的变化 (例如,图 4b1 '-b1 ' 和 4c1 '-c1 ')。尾针可以放置更多的前部, 以帮助尽量减少运动, 虽然这可能会导致更多的后神经瘤无法进入。此外, 心脏注射后, 头针可以旋转, 使针的水平部分位于整个蛋黄。除了改变别针的位置外, 还可以用脑片竖琴代替别针固定幼虫 34。当正确地放置在幼虫上时, 竖琴是一种额外的、可能不太侵入性的固定幼虫方法。虽然明显的运动可能是由于固定不足, 未能正确地进行心脏注射, 以提供α-本藻毒素和麻痹幼虫可以导致不完全瘫痪, 运动, 并最终运动伪影。虽然常用的麻醉剂已被证明会影响斑马鱼毛细胞的兴奋性, 但最近的研究表明, 麻醉苯并不能干扰毛细胞活性的许多方面。同样, 更常用的麻醉 ms-222 只干扰毛细胞活性的某些方面15。因此, 由于α-本加洛辛注射液的挑战性, 苯并卡因或 ms-222 的应用可能被证明是一种有用的替代方法麻痹, 以防止在功能性钙成像过程中在幼虫中的运动。
除了该协议所涉及的技术挑战外, 如果在每次成像实验之前和期间幼虫和毛细胞都不健康, 即使是完全安装的样品也是无用的。为了确保幼虫和毛细胞的健康, 重要的是幼虫应保存在 e3 缓冲液中, 而 e3 缓冲液中没有碎屑, 如绒毛膜 (蛋壳)、废物和微生物。虽然侧系毛细胞的表面位置有利于成像, 但当 e3 缓冲液被污染时, 这种位置使它们更容易受到细胞损伤。一个干净的, 水的环境是特别重要的年轻幼虫 (2-4 dpf) 或突变体, 不能保持直立游泳的位置, 主要位于皮特里菜的底部。在这些情况下, 侧系毛细胞和护皮束周围的保护杯很容易被破坏。即使从健康的幼虫和毛细胞开始, 在每个实验的整个过程中, 确保幼虫有心跳和快速的血液流动也是至关重要的。如果血液流动减慢或停止, 毛细胞的健康可能会受到损害。在涉及不健康幼虫或失血过多的受损制剂中, 可以通过几种方式确定垂死的毛细胞: 第一, 通过核死瘤或核冷凝的出现, 表现为 dic 光学下细胞内的气泡;第二, 细胞收缩和细胞质内存在快速移动的颗粒;第三, 当动感小贴在不同的方向上突出时.当头发束被破坏时, 在刺激过程中, 被打结的阴群不会在一起协调运动。
这种准备有几个小的局限性, 一个是准备工作在建立后的1-3小时内保持稳健。使用较小的针脚或脑片竖琴固定幼虫和添加灌注系统等修改可能会延长这种在体内制剂的寿命。另一个限制是, 在重复成像试验后, 可能会发生光漂白和光毒性。克服这一挑战的一个令人兴奋的方法是调整光片显微镜的这一协议。光片显微镜是减少聚焦光的一种强大方法, 可减少光漂白和光毒性36。在一起, 温和的固定化和较少的照片曝光可能有助于延长每个成像周期。更长时间的成像课程可用于检查伴随发育而来的功能变化的整个持续时间, 以及损伤后头发细胞清除和再生的过程。重要的是要指出, 除了光片显微镜, 该协议可以适应其他类型的共聚焦系统 (点扫描, 2 光子和旋转磁盘), 以及相对简单的宽场系统28,34.总体而言, 它的多功能性使这一协议成为一个有价值的工具, 可以适应和使用多个成像系统。
虽然该协议可以适应和使用的许多成像系统, 该协议的部分也可以调整和使用 (1) 除 gcmp6 以外的其他指标和 (2) 图像活动的其他感觉神经和神经元在幼虫斑马鱼。例如, 在前面的一项研究中, 我们使用该协议在侧向毛细胞内使用多个基因编码指标来检测细胞质钙 (rgecon1)、囊泡融合 (SypHy)、膜电压 (bongwoori) 和膜的图像活动钙 (jRCaMP1a-caax 和 gcmp6s-caax), 并在侧向传入过程中检测膜钙 (gcmp6s-caax)5。根据我们使用这些指标的经验, 本协议中描述的转基因线 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 为侧线神经母细胞的成像活动提供了一个很好的开端。在上面列出的所有指标中, 我们发现 gcmp6 是最敏感和最光稳的。除了这些功能, 我们突出了 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 转基因线, 因为它可以用来进行两个不同的测量: 头发细胞机械和突触前钙在一个单一的转基因线。
本文概述的技术演示了斑马鱼侧线中的钙成像如何成为研究毛细胞在其本地环境中如何发挥作用的有力方法。这种方法是对哺乳动物研究的补充, 在哺乳动物体内外植体中目前正在研究毛细胞功能。此外, 斑马鱼模型可以继续作为一个平台, 以测试基因编码指标的有效性, 然后可以用于检查在哺乳动物毛细胞的活性。

功能性钙成像是一个强大的工具, 可用于监测许多细胞的活动同时 1。特别是, 使用基因编码钙指标 (gecis) 进行钙成像已被证明是有利的, 因为 gecis 可以在特定的细胞类型和局部细胞2中表达。在神经科学研究中, 这些特征使使用 geci 的钙成像成为一种强有力的方法, 既可以定义神经元网络中的活动模式, 也可以测量单个突触 3,4处的钙流入.利用这些特征, 最近的一项研究使用共聚焦显微镜和 gecis 来监测感觉毛细胞集合中的亚细胞活动5。
毛细胞是在水生佐中检测内耳的声音和前庭刺激以及水生佐中侧线系统中的局部水运动的机械感受器.头发细胞往往是损伤或基因突变的目标, 导致人类最常见的听力损失形式, 即所谓的感音神经性听力损失8,9。因此, 了解这些细胞是如何运作的, 以了解如何治疗和预防听力损失是至关重要的。为了正常运作, 毛细胞利用两个特殊的结构, 称为机械传感器束和突触丝带, 分别检测和传输刺激。发束位于毛细胞的顶端, 主要由被称为立体纤毛的细发状突起组成 (图 1a)。在前庭和侧腰状毛细胞中, 每个发束也有一个长的质纤毛 (细胞唯一真正的纤毛), 它可以远远延伸到立体纤毛之上 (图 1a)。机械感官刺激会使头发束偏转, 偏转会使张力放在连接立体声10 的"提示链接" 上。这种张力打开了位于立体纤毛的机械传导 (met) 通道, 导致了包括钙 11,12在内的阳离子的顶端流入。这种顶端的活动最终会使毛细胞去极化, 并在细胞的底部打开电压门控钙通道 (cav 1.3)。cav 1.3通道与突触带相邻, 突触前结构在活动区系上囊泡。通过 cav1.3 通道的基底钙流入是需要的囊泡融合, 神经传递, 和激活传入神经元13,14.
多年来, 电生理技术, 如全细胞贴片夹紧, 一直被用来探测许多物种的毛细胞的功能特性, 包括斑马鱼15,16,17, 18,19,20。这些电生理记录在听力和平衡领域特别有价值, 因为它们可以用来从单个感觉细胞中获得极其敏感的测量结果, 其目的是编码非常快速的刺激。频率和强度范围广 21,22。不幸的是, 全细胞记录不能测量毛细胞的数量。为了研究斑马鱼侧系细胞的活性, 利用微音电位和传入动作电位测量了单个神经瘤的机械敏感和突触后反应特性的总和23 ,24岁.不幸的是, 整个细胞记录和局部场电位测量都没有空间分辨率来精确定位单个细胞内发生活动的位置或测量种群内每个细胞的活动。最近, 钙染料和 geci 被用来绕过这些挑战 25,26。
在斑马鱼中, geci 已被证明是一个强有力的方法来检查毛细胞功能, 由于相对容易创建转基因斑马鱼和光学清晰度的幼虫27。在斑马鱼幼虫中, 毛细胞存在于内耳以及侧线系统中。侧线是由类似玫瑰的毛细胞簇组成的, 称为神经母细胞, 用于检测水运动的局部变化 (图 1)。侧线特别有用, 因为它位于鱼的表面的外部。这种接触使得刺激毛细胞和在完整的幼虫中光学测量钙信号成为可能。总体而言, 容易发生的转基因, 透明的幼虫, 以及无与伦比的进入侧向毛细胞, 使斑马鱼成为一个宝贵的模型, 研究在体内的毛细胞的活性。这是一个显著的优势相比, 哺乳动物的系统, 其中毛细胞被骨结构的内耳包围。由于缺乏接触, 很难在体内获得哺乳动物毛细胞的功能测量。
这里概述的协议描述了如何监测 met 通道和突触前的变化, 钙在单个毛细胞内和细胞之间的单个斑马鱼。该协议利用已建立的转基因斑马鱼系, 表达膜本地化的 gcmp6 控制下的毛细胞特异性肌球蛋白6b启动子 28.这种膜定位定位 gcmp6, 以检测钙通过离子通道在质膜, 这是至关重要的发细胞功能。例如, 膜局部 gcmp6 可以检测钙的流入通过 met 通道在顶端的发束和通过 cav1.3 通道附近的突触丝带在细胞的基础。这与使用细胞溶胶中的 geci 形成鲜明对比, 因为细胞质 geci 检测到的钙信号是 met 和 cav1.3 通道活性的组合, 以及来自其他来源的钙贡献 (例如,商店释放)。该协议概述了如何固定和麻痹 gcamp6 的转基因幼虫之前成像。然后, 它描述了如何准备和使用流体喷射器, 以偏转的头发束, 以控制和可复制的方式刺激侧系毛细胞。介绍了使用该协议可以实现的代表性数据。还提供了表示运动工件的数据示例。描述了用于验证结果和排除工件的控制实验。最后, 介绍了斐济软件中空间钙信号的可视化方法。本斐济分析是根据以前使用 matlab5开发的可视化方法进行调整的。总体而言, 该协议概述了一种强大的制备技术, 该技术利用幼虫斑马鱼中的 geci 来测量和可视化体内的毛细胞钙动态。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

感觉毛细胞是在内耳中发现的机械感受器, 是听力和平衡所必需的。头发细胞被激活的反应感官刺激机械偏转顶端突起称为头发束。偏转打开机械传导 (met) 通道在头发束, 导致大量的阳离子, 包括钙。这种阳离子汇集使细胞失去极化, 并打开位于发细胞前部基部的电压门控钙通道。在哺乳动物中, 毛细胞被包裹在骨骼中, 在体内评估这些活动的功能是很有挑战性的。相反, 幼虫斑马鱼是透明的, 并拥有一个外部定位的侧线器官, 其中包含毛细胞。这些毛细胞在功能和结构上类似于哺乳动物的毛细胞, 可以在体内进行功能评估。本文概述了一种技术, 利用基因编码的钙指标 (geci), gcmp6, 测量刺激诱发钙信号在斑马鱼侧系毛细胞。gcamp6 可与共聚焦成像一起用于测量侧系毛细胞的顶端和基部的体内钙信号。这些信号提供了这些毛细胞内机械和突触前依赖钙活性的实时、可量化的读数。这些钙信号还提供了有关毛细胞如何检测和传递感官刺激的重要功能信息。总的来说, 这项技术产生有用的数据有关钙活性在体内的相对变化。它不太适合对钙变化的绝对数量进行量化。这种体内技术对运动伪影很敏感。为了正确定位、固定和刺激幼虫, 需要合理的练习和技能。最终, 如果执行得当, 本文中概述的协议提供了一种强大的方法来收集有关头发细胞在活体动物体内的自然、完全整合状态中的活动的有价值的信息。

在 myo6b: gcmp6s-caax 转基因鱼被正确固定化, 流体射流刺激被传递到侧线毛细胞后, 可以可视化和测量强的钙信号 (图 4和图 5, 在 2 x 分页时拍摄)。在流体喷射刺激过程中, 钙信号可以测量在顶端的发束, 其中 met 通道打开响应刺激, 或在发体细胞的基础上, 其中突触前钙通道 v1.3 钙通道触发神经传递.图 4a1-a2 '' ' 显示了这些区域的钙反应的一个代表性例子。在这个例子中, 2-s 5 hz 流体射流刺激被传递来激活代表性神经母细胞中的所有毛细胞。在刺激过程中, 可以在头发束中检测到强的钙信号 (图 4a1-a1 ' ',显示了8个发束的反应)。在这个系统中, 几乎所有成熟的毛细胞都显示出这种钙5的顶端流入。相反, 在同一神经瘤中, 基部有可检测到的钙信号, 只有一个子组 (~ 30%) 的突触平面上有可检测到的钙信号 (图 4a2-a2 ' ', 显示4个具有突触前反应的细胞)5。尽管有强大的顶端钙信号 (图 4a1-a1 ' '), 但4个绿色 roi 显示细胞没有明显的突触前钙信号 (图 4a2-a2 '')。在这个有代表性的例子中 (图 4a1-a2 ' ' '), 彩色 rois 将顶端 met 平面 (图 4a1) 中的发束与基部突触平面中的细胞体 (图 4a2)相匹配。本示例重点介绍了如何在单个毛细胞内和毛细胞群中测量 met 依赖性和突触前钙信号。
在发束和收吸前的钙信号可以图形地绘制为原始 (f) gcmp6 强度或 f/f o gcmp6 强度 (见步骤 12, 图 4a1-a1 ' 和 4A1'-a2 ')。(f) gmp6 的图表突出显示, 每个细胞的基线荧光强度可能不同 (图4a1 和 4A1 ')。在 fo gcmp6 图中, 每个单元被归化为其基线值, 并绘制了基线的相对强度变化 (图 4a1 ' 和 4A1 ' ')。在 (f) 和 f/o gcmp6 图中, 顶端发束和基部突触前平面中的钙信号随着刺激的开始 (灰色框) 而启动, 并在刺激结束后呈指数级下降. 在刺激过程中, 如果偏转强度不改变, 发束中的钙信号会迅速上升并饱和 (图 4a1-a1 ' ')。相反, 在突触平面上可检测到钙信号的毛细胞子集中, 钙信号逐渐增加, 不太容易饱和 (图 4a2-a2 ' ' ')。在没有突触前钙信号 (绿色 roi) 的毛细胞中, 钙信号保持在接近基线的水平。
除了这些图形表示 (图 4), 钙信号可以在整个神经场内的空间可视化在记录的过程中。图 5显示了一个时空表示的例子, 用于神经母细胞基平面上的突触前 gcmp6 信号。在图 5中, 为空间可视化处理图像序列的主要步骤概述了步骤13中所述。首先, 原始 (f) gcamp6 图像是临时绑定的 [图 5: 第1行 (14个垃圾桶中的 5个); 步骤 13.2.1]。然后, 从 (f) gcmp6 的荧光信号中减去从刺激前帧 (步骤 13.2) 计算的基线图像, 以获得 f 图像 (图 5: 第2行; 步骤 13.2.2)。接下来, f 灰度图像将转换为颜色 lut (图 5: 第3行, 红色热 lut; 步骤 13.3)。最后, 将具有 lut 转换的 f 图像叠加到时间绑定 (f) 图像上 (图 5, 第一行), 以揭示刺激期间神经母细胞内的时空信号 (图 5: 第4行; 步骤 13.4)。f gcmp6 信号的热图提供了宝贵的空间和时间信息, 不容易从单个 roi 和图 4中使用的图形中解析出来。热图可以帮助可视化关键的时空信息, 包括每个毛细胞内钙信号的发生和持续时间的亚细胞信息, 以及整个毛细胞之间的时间和强度差异神经母细胞。
重要的是要验证图形和空间热图是否代表真实的钙信号, 而不是由于运动而产生的人工制品。在这个协议中, 运动伪影可能是由于流体喷射刺激而导致幼虫过度漂移或运动或运动的结果。所有这些工件都具有挑战性, 在体内制剂中完全消除。虽然图像序列的注册 (步骤 12.1.3) 可以纠正 x 轴和 y 轴的大多数移动, 但必须识别 z 轴中运动过大的图像序列, 并将其从分析中删除。运动伪影是最容易通过绘制钙信号来识别的。在毛细胞的顶点 (图 4b1 '-b1 ' ' ' ') 和基部 (图 4 c1 '-c1 ')可以观察到 gcmp6 强度变化的例子, 这些变化是伪影, 而不是真正的gcamp6信号。
在顶端的发束中, 当流体射流刺激太强时, 运动伪影是常见的 (图 3a3 ' ' ')。在这些过强的刺激过程中, 顶端的发束平面可以在流体射流刺激过程中移出焦点, 然后在刺激结束后返回到原来的焦点平面 (图 4b1'-b ')。这使得它很难准确地测量顶端 met 依赖钙信号。在图 4b1 '-b1 ' ' ' 中可以看到发束运动伪影的一个例子。在这里, 图表显示 gcmp6 信号减少期间的刺激 (灰色框) 时, 头发束是不集中。刺激结束后, 随着发束恢复到原来的位置并重新进入焦点, gcmp6 的信号迅速增加。这与图 4a1-a1 "中的例子形成鲜明对比, 在该示例中, 根钙信号在刺激开始时增加, 在刺激结束时减少。
虽然由于过多的流体射流刺激而产生的运动也会使突触平面脱离焦点, 但这种类型的运动伪影在这种平面上并不常见。相反, 由于幼虫的运动或漂移而导致 z 轴焦距的变化是运动伪影最常见的原因。幼虫运动或漂移会影响 gcamp6 在毛细胞的先端和基部的测量。图 4c '-c ' ' 显示了在刺激过程中增加基部、突触平面 gcmp6的幼虫运动的一个例子。运动伪影 (图 4c1-c1 ' ')可以通过检查 gcamp6 信号的时间过程与真正的突触前信号区分开来 (图 4a2-a2 ' ')。gcmp6 信号的运动诱导的增加不是随着刺激而呈指数级增长和下降 (图 4a2-a2 ' '), 而是具有正方形, 并随着刺激的开始和偏移而突然上升和下降 (图 4c1 '-c1 ')。
除了仔细检查 gcmp6 信号的时间过程外, 还可以利用药理学进行控制实验, 将真正的 gcamp6 信号与运动伪影区分开来。例如, bapta (步骤 10) 可用于在发束中切割 met 通道功能所需的提示链接。bapta 应通过 ca v1.3 通道消除流化射流-诱发电位 met-t钻孔性钙的流入以及随后的基底、突触前钙的流入.在流体喷射刺激过程中真正的刺激诱发钙信号 (图 4a1-a2 ' ' ')的典型例子中, bapta 治疗后, 顶端和基面 gcmp6 荧光的所有变化都将被消除。相反, gcamp6 荧光的变化由于运动, 如图 4b1 '-b1 ' "和4c1 '-c1 ' ' ' 不会消除 bapta 处理。
除了使用 synaptic 来消除所有刺激引起的 gcmp6 信号外, 还可以应用 (步骤 11) 来特别阻止 ca v 1.3 依赖于突触平面的钙流入, 同时离开顶端的 mett 通道依赖钙流入原封不动 5.在没有运动伪影的单个神经体中应用异丙滨后, 在流体喷射刺激过程中, 在根毛束 (图 4a1-a1 ' ' ') 中gcmp6 荧光的变化将保持不变, 而所有突触 gcm6 s 都将发生改变。将消除基座上的荧光变化 (图 4a2-a2 ' ')。在异丙二醇应用后, 突触平面上 gcamp6 信号的任何变化 (例如, 图 4c1-c1') 很可能与运动伪影相对应。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig1.jpg"> 图 1: 侧线神经元和功能成像平面概述。(a)左边的图表描绘了一个神经体的侧面视图, 有四个毛细胞体 (黑色) 接触突触后传入神经元 (蓝色)。丝带 (绿色) 系绳泡在每个细胞内的突触前活动点。每个细胞体的顶端是一捆立体纤毛 (1 微米), 包含 met 通道。每个发束都有一个运动细胞, 将水运动的机械力传递到发束的底部。右侧的关系图在自上而下的视图中描述了相同的模型。在此自上而下的视图中, 黑色用于表示左侧图中描述的四个单元格, 而灰色用于表示神经母细胞中的其他单元格。在这个模型和这两个视图中, 突出了三个重要的平面: (1) 用于量化发束偏转大小的发束 (运动学) 的尖端, (2) 在毛束底部的顶端 met 平面, 其中钙进入细胞在刺激过程中, 和 (3) 突触平面在细胞的基部, 钙进入接近突触丝带。(b1-b1 ')dic 和 gcmp6 自上而下的图像的 met 平面在发束的基础上, 在那里机械相关的钙信号可以记录。(b2-b2 ')dic 和 gcmmp6 的自上而下的图像来自与 b1-b1 ' 相同的神经体, 但在突触平面的神经母细胞的底部, 在那里可以检测到突触前的钙信号。(c1-c2)表示 gcmp6 的神经体的图像, 其中幼虫安装不当。在本例中, 单元格底部的顶端 met 平面 (c1) 和突触平面 (c2) 被定位在一个次优角度。这个位置不允许所有的发束在一个平面上成像, 需要更多的成像平面来捕捉这个神经体内所有突触的活动, 而不是 b1-b2 '。图像为 5 dpf 的幼虫。c2 中的刻度条对应于 b1-c2 中的所有图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig2.jpg"> 图 2: 成像室、斑马鱼安装和心脏注射程序, 以及针头。(a)显示是一个成像室, 其幼虫 (由虚线矩形概述) 固定在硅胶封装的中心。(b1)显示的是一个 5 dpf 幼虫固定由两个引脚。一个大的头针被放置在垂直的身体只是后面的眼睛。这两只眼睛完全叠加在一起, 所以下眼完全被上眼遮挡。一个小的尾巴销与尾巴中的脊索相交。幼虫是平的, 没有扭曲。(b2)为了麻痹幼虫, 心脏注射针垂直于身体, 并带来了与心脏相邻。心脏注射针应接触心脏前的色素细胞。(b2 ')针的抑郁进入皮肤会导致心脏前面色素细胞的压痕。(c)针按顺序从左到右: 心脏注射针的例子, 开口约为3微米;一个好流体喷射针的例子以大约50微米的开头;一个坏坏的流体喷射针, 是大的和锯齿状的, 很可能会产生过度和不规则的刺激的例子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig3.jpg"> 图 3: 流体射流对准、定位和刺激校准。(a1)显示是一种幼虫定向与头部面向左, 尾巴向右, 和流体喷射针定向平行的甲鱼体的 a-p 轴。这种流体射流针对齐, 以刺激神经母细胞, 响应前 (推压) 和后 (拉普/真空) 定向流体流动。(a2)显示的是一个神经体 (由虚线概述) 和顶端束的提示 (运动性) 在左侧的面板和流体喷射针的右侧的面板。流体射流的位置约为100微米, 从神经母细胞的边缘。(a3-a3 ' ' ')根尖束 (运动性) 的尖端是偏转不同的距离, 由不同的流体射流刺激压力。单个运动枕尖端的轨迹为 1.5μm (a3 ') 和 5μm (a3 ' ') 偏转距离。黑色圆圈表示动感的休息位置。重要的是, 运动性不能偏出太远, 否则刺激强度无法可靠地量化, 并可能变得具有破坏性 (a3 ' ' ')。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig4.jpg"> 图 4: 在侧系毛细胞的流体射流刺激过程中, 顶端 met 和基部突触前 gcmp6 信号。(a1-a2 ' ')gcmp6 的强度在具有代表性的神经系统内的流体射流刺激过程中发生了变化。左边的图像显示了同一神经元内的顶端 met 平面 (a1) 和基部突触平面 (a2)。用 a1 和 a2 编码的 roi 颜色绘制了每个图像右侧的 (f) 和 fmf gcmp6 强度图的时间过程。(b1-b1 ' ')流体喷射刺激过程中运动过的顶端 met 图像序列的例子。左侧的图像 (b1) 显示了用于向右绘制 (f) 和 f·fcmp6 强度图的 roi。(c1-c1 ' ')在基部突触平面上显示运动伪影和 gcmp6 信号变化的图像序列的示例, 这些变化不是真正的钙信号。左侧 (c1) 上的图像显示了用于将 (f) 和 f/f gcmp6 强度图绘制到右侧的 roi。每个图形中的灰色框表示流体射流刺激在每个图像序列中的持续时间。a1-a2 ' ' ' 和 b1-b1 ' ' 的例子中使用了 2-s 5 hz 流体射流刺激。在 c1-c1 ' ' 中, 使用了2的前步刺激。(f) gcmp6 图的 y 轴描述了从斐济图像强度测量中获得的任意单位 (a. u.)。所有的例子都来自 4-5 dpf 的幼虫。所有图像的刻度条 = 5μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig5.jpg"> 图 5: 流体喷射刺激过程中突触前 gcmp6 信号的时空可视化.概述了在刺激过程中在神经系统内可视化 gcmp6 强度时空变化的步骤。时间根据图像顶部的时间戳从左到右表示。顶行显示了70帧 gcmp6 (f) 图像序列 (步骤 13.2.1) 中的14个时间箱中的5个。在第二行中, 基线 (步骤 13.2) 已从每个 (f) GCaMP6s 绑定图像中删除, 以创建 f 图像 (步骤 13.2.2)。在第三行中, f 图像已从灰度 (第二行) 转换为红色热 lut (步骤 13.3)。这些 lut 图像的最小值和最大值是根据右侧 (步骤 13.3.1) 的相对 f 强度 (a. u.) 的红色热 lut 热图设置的。在底部行中, 第三行已覆盖到顶行中的 (f) 图像 (步骤 13.4)。图顶部的灰色条表示 2-s 5 hz 流体射流刺激的时间。这个例子来自一个 5 dpf 幼虫。右侧显示了相对 f 强度 (a. u.) 的红色热 lut 热图的图例。所有图像的刻度条 = 5μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

幼虫斑马鱼外系头发细胞的活体钙成像

斑马鱼是一个模型系统, 具有许多有价值的功能, 包括光学清晰度, 快速的外部发展, 并特别重要的听力和平衡领域, 外部位于感觉毛细胞。本文概述了转基因斑马鱼如何被用来检测毛细胞机械和突触前功能。

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

这种方法可以帮助回答听力和平衡领域的基本问题。它描述了如何检测感觉毛细胞功能的两个重要方面，机械转移和预突触活动。这种技术的主要优点是，它使我们能够可视化活体动物中毛细胞的功能，并研究头发细胞的集合如何检测和传输感官信息。要开始此过程，请使用细钳子和钨丝来设计用于通过头部和尾部固定在硬化的封装剂上的幼虫的针脚。要制作头针，请单手握住一块0.035毫米钨丝。使用另一只手的细钳子，将导线从端弯曲一毫米，达到 90 度。将钳子更换为细剪刀，并在折弯后切割一毫米，以创建销。然后使用钳子将针脚插入腔室上的硬化封装中。将幼虫放在灌注室的中心，使幼虫平放在硅胶套部上。使用精细钳子，将 0.035 毫米头固定到垂直于幼虫。将头针插入眼睛和异色囊泡之间，向下插入封装剂。使用第二组钳子稳定幼虫沿着其后侧和腹侧，同时固定。确保针脚的水平部分接触幼虫，并且不会一直压入包盘。角度针通风口，或稍微指向幼虫的前部，以避免干扰随后的心脏注射和毛细胞成像。使用钳子，将 0.025 毫米尾销插入到尾部，尽可能靠近尾部的尾部。要将α bungarotoxin注射到幼虫中，使用凝胶加载移液器尖端将溶液的三微升回填到注射针中。将溶液均匀地加载到尖端，无气泡。然后将心脏注射针插入连接到手动微操纵器的移液器支架中。在立体显微镜下，定位针头，使针头垂直与麻醉幼虫的 AP 轴对齐，向下指向 30 度角。接下来，将移液器支架连接到压力喷油器。将一波α bungarotoxin注射到溶液中，以测试针尖是否清晰。如果没有看到红色，请非常轻轻地将针尖刮到针刃上，然后重试，直到针清晰。随后，将针头推进到心脏，直到它触及心脏外的皮肤。将针头压入幼虫，并查找心脏前皮肤上色素细胞的凹痕，以确保针头位于相对于幼虫的正确平面上。然后，将针头推进更远，直到它刺穿皮肤并进入心腔。稍微拉回针头，将α型邦加罗毒素注射到心腔中。寻找心腔的膨胀，或红色染料进入腔。用一毫升神经元缓冲液轻轻冲洗幼虫三次，以去除残留的MS222。切永远不要去除所有的液体。在灌注室中保持大约1毫微的神经元缓冲液中的幼虫。在此过程中，使用凝胶加载尖端将 10 微升的神经缓冲液回填到正确断裂的流体喷射针中。将溶液均匀地加载到没有气泡的尖端。然后，将针头插入连接到电动微操纵器的移液器支架中。将灌注室放入显微镜舞台上的圆形腔室适配器中。移动电动舞台，使幼虫位于视野的中心。随后，转动圆形腔室适配器，使AP进入幼虫与流体喷射针的轨迹大致对齐。使用透光和差分干扰对比度，将幼虫聚焦到10倍的目标下。然后，提高 10 倍的目标。使用电动微操纵器，将流体喷射针向下进入视场中心，因此被透光照亮，几乎不能接触神经元缓冲液。降低10倍目标，以专注于幼虫，以确认其位置。将目标放在流体喷射针上。在 x 轴和 y 轴中用微操纵器移动流体喷射针，直到其位置与幼虫的后侧平行。之后，重新关注幼虫。将针头在 z 轴中向下，将针头沿鱼的后侧放置，离身体 1 毫米远。小心地移动圆形腔室适配器，以确保流体喷射针沿幼虫的 AP 中线对齐。接下来，切换到60倍水目标。确保目标在神经元缓冲液中被处理。使用精细焦点定位神经瘤。随后移动motarized阶段，将感兴趣的神经瘤放在视场的中心。保持流体喷射针尖沿鱼的后侧。请勿触摸流体喷射针尖到幼虫或腔室表面。将流体喷射针与微操纵器一起放置，使其远离神经瘤外边缘 100 微米。然后，专注于尖发的毛发束。流体喷射针的底部应该在这个平面的焦点。将高速压力夹从手动模式设置为外部模式，以接收来自成像软件的输入。通过按下零按钮将高速压力夹归零，并使用设定点旋钮将静止压力稍微设置为正。使用连接到头级输出的 PSI 气压计确认高速压力夹的静止输出。要确定刺激发束所需的压力，请应用 0.125 和 0.25 伏输出的测试刺激，输出为 200-500 毫秒。对于每个测试刺激，测量毛束尖的偏转距离，基诺西利亚。选择将束距离移动约 5 微米的压力。确保基诺西利亚的尖端始终保持焦点。要获取单平面图像，请选择在帧 30 后 30 帧采集期间以 3 秒为单位交付的刺激。要测量机械敏钙反应，请关注毛发束的基座，并开始图像采集。要测量突触前钙反应，请聚焦在毛细胞底部，然后开始图像采集。此处概述了在模拟过程中，在神经瘤中可视化 GCaMP6S 强度中时空变化的步骤。时间根据时间戳从左到右表示。顶行显示 70 帧 GCaMP6S F 图像序列中的 14 个时态条中的 5 个。在第二行中，基线已从每个 GCaMP6S F 装箱图像中删除，以创建增量 F 图像。在第三行中，增量 F 图像已从灰度转换为红色热查找表。在底部行中，第三行已叠加到上行的 F 图像上。在尝试此过程时，请务必记住确保正确固定幼虫并使用适当的控制，如手稿中所述，从数据中排除运动伪影。使用α邦加毒素可能是危险的。采取预防措施非常重要，例如在处理时戴手套。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

科研

神经科学

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

膜片钳记录在内耳毛细胞的分离斑马鱼

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

斑马鱼幼虫的前脑的电生理记录

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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C.在体内神经元钙成像技术线虫

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

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在基于生物发光钙指标GFP的水母体内脑功能成像方法

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

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在体内 小鼠劣质橄榄中的钙成像

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

斑马鱼游泳期间后横向线阿弗伦特神经元的活动

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

研究钝力损伤对成年斑马鱼影响的可扩展模型

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

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活体转基因小鼠脑围产层钙和血液学成像

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

穿梭盒测定作为使用成人斑马鱼进行学习和记忆研究认知评估的关联学习工具

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...