Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH/NIDCD murene forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi vil gerne anerkende Candy Wong for hendes hjælp i at skrive makroen Fiji. Vi vil også gerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres hjælpsomme forslag med protokollen.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

In vivo billeddannelse i intakte dyr er i sagens natur udfordrende. Flere trin i denne metode er afgørende for at indhente pålidelige i vivo målinger af calcium fra laterale-line hårceller. For eksempel, er det meget vigtigt, at larve er fastgjort og lammet ordentligt før imaging for at minimere bevægelse under imaging. Overskydende bevægelse under imaging kan føre til ændringer i GCaMP6s fluorescens, der er ikke rigtigt signaler og svarer ikke til ændringer i calcium niveauer (f.eks. tal 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1''). Hale pins kan placeres flere anteriorly til at hjælpe med at minimere bevægelse, selvom det kan gøre mere posterior neuromasts utilgængelige. Efter injektion af hjertet, kan der desuden drejes et hoved pins, således at den vandrette del af pin ligger på tværs af blommesækken. Ud over at ændre placeringen af pins, er det også muligt at bruge en hjerne-skive harpe i stedet for nåle til at immobilisere larver34. Når det placeres over larverne korrekt, er en harpe et supplerende, potentielt mindre invasiv metode til at immobilisere larver. Mens betydelig bevægelse kan skyldes utilstrækkelig fastgørelse, kan manglende korrekt udføre hjerte injektion for at levere α-bungarotoxin og lamme larver resultere i ufuldstændig lammelse, bevægelse, og i sidste ende bevægelse artefakter. Selv om anvendte anæstetika har vist sig at påvirke ophidselse af zebrafisk hårceller, har seneste arbejde vist, at den bedøvende benzocain ikke forstyrrer mange aspekter af hår-celle aktivitet. På samme måde, mere almindeligt anvendte bedøvelsesmiddel MS-222 kun griber ind i visse aspekter af hår-celle aktivitet15. Derfor, på grund af de udfordrende karakter af α-bungarotoxin injektion, benzocain eller MS-222 ansøgning kan vise sig for at være et nyttigt alternativ metode til lammelse at forhindre bevægelse i larve under funktionelle calcium imaging.
Ud over de tekniske udfordringer i denne protokol er selv en perfekt monteret prøve ubrugelige, hvis larve og hår celler ikke er sundt, før og under hver tænkelig eksperiment. For at sikre, at larver og hårceller er sundt, er det vigtigt, at larver er fastholdt i E3 buffer, der er fri for snavs som chorions (æggeskaller), affald og mikroorganismer. Selv om den overfladiske placering af laterale-line hårcellerne er fordelagtige for billedbehandling, denne beliggenhed gør dem mere sårbare over for cellulære skader når E3 buffer er forurenet. En ren, vandige miljø er særlig vigtigt for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter, der ikke kan opretholde en opretstående svømning position og primært ligge på bunden af petriskålen. I disse situationer, kan laterale-line hårceller og beskyttende cupula omkring hår bundter nemt blive kompromitteret. Selv når du starter med sunde larver og hårceller, i løbet af hvert forsøg, er det afgørende at sikre, at larve har et hjerteslag og hurtige blodgennemstrømning. Hvis blodgennemstrømningen bremser eller stopper, kan blive kompromitteret af hårcellerne sundhed. I kompromitteret forberedelserne involverer usunde larver eller tab af blodgennemstrømningen, døende hårceller kan identificeres på flere måder: første, ved udseendet af karyopyknosis eller nukleare kondens, som manifesterer sig som en boble i cellen under DIC optik; for det andet af celle svind og forekomst af hurtigt flytte partikler i cytoplasmaet; og tredjedel, når kinocilia tips splay i forskellige retninger35. Når hår bundter er afbrudt, den spredte kinocilia ikke flytte fasthed sammen under stimulation.
Dette præparat har flere mindre begrænsninger, nemlig at præparatet kun forbliver robust for 1-3 timer efter det er etableret. Ændringer som ved hjælp af mindre stifter eller en hjerne-skive harpe til at immobilisere larver og tilføje en perfusion system kan forlænge levetiden for denne i vivo forberedelse. En anden begrænsning er, at photobleaching og fototoksicitet kan forekomme efter gentagen imaging forsøg. En spændende måde at overvinde denne udfordring er at tilpasse denne protokol til lys-ark mikroskopi. Lys-ark mikroskopi er en kraftfuld måde at reducere ud af fokus lys, hvilket fører til mindre photobleaching og fototoksicitet36. Sammen, kan blidere immobilisering og mindre foto-eksponering hjælpe forlænge hver tænkelig session. Længere imaging sessioner kan bruges til at undersøge den fulde varighed af funktionelle ændringer ledsager udvikling og processer underliggende hår-celle clearance og regeneration efter skade. Det er vigtigt at påpege, at, ud over lys-ark mikroskopi, denne protokol kan tilpasses andre typer Konfokal systemer (punkt-scanning, 2-foton og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Samlet set gør sin alsidighed denne protokol et værdifuldt redskab, der kan tilpasses og bruges med flere Billeddannende systemer.
Mens denne protokol kan tilpasses og bruges med mange Billeddannende systemer, kan dele af denne protokol også tilpasses og anvendes (1) med andre indikatorer ud over GCaMP6s og (2) til billedet aktivitet i andre sensoriske celler og neuroner i larve zebrafisk. For eksempel, i en tidligere undersøgelse brugte vi denne protokol til billede aktivitet af flere genetisk kodet indikatorer inden for laterale-line hårceller til påvisning af cytosole calcium (RGECO1), vesikel fusion (SypHy), membran spænding (Bongwoori) og membran calcium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og inden for laterale-line afferente processer til at opdage membran calcium (GCaMP6s-caax)5. Baseret på vores erfaring med at bruge disse indikatorer, tilbyder den transgene linje Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokol en fremragende start for imaging aktivitet i laterale-line neuromasts. Af alle de indikatorer, der er anført ovenfor, har vi fundet, at GCaMP6s er den mest følsomme og photostable. Ud over disse funktioner, vi fremhæve Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linje, fordi det kan bruges til at lave to forskellige målinger: hår-celle mechanosensation og præsynaptiske calcium inden for en enkelt transgene linje.
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel viser, hvordan calcium imaging i sidelinjen zebrafisk kan være en kraftfuld metode til at studere, hvordan hårceller fungere i deres oprindelige miljø. Denne tilgang er et supplement til studier af pattedyr i hvilken hår-celle funktion er i øjeblikket undersøgt i ex vivo explants. Desuden kan zebrafisk model fortsat anvendes som en platform til at afprøve effekten af genetisk kodet indikatorer, der kan derefter anvendes til at undersøge aktivitet i pattedyrceller hår.

Funktionelle calcium imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at overvåge aktiviteten på mange celler samtidigt1. Især har calcium imaging ved hjælp af genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) vist sig at være fordelagtig, fordi GECIs kan udtrykkes i specifikke celletyper og lokaliseret subcellularly2. I neurovidenskab forskning, har disse funktioner gjort calcium imaging ved hjælp af GECIs en kraftfuld metode til både definere aktivitet mønstre inden for neuronal netværk og måle calcium tilstrømning på individuelle synapser3,4. Drage fordel af disse funktioner, en nylig undersøgelse bruges Konfokal mikroskopi og GECIs til at overvåge subcellulært aktivitet inden for samlinger af sensoriske hårceller5.
Hår celler er de mechanoreceptors, der registrerer lyd og vestibulære stimuli i det indre øre og lokale vandbevægelse i det laterale-line system i akvatiske vetebrates6,7. Hår celler er ofte mål for skader eller genetiske mutationer, der resulterer i den mest almindelige form for hørenedsættelse hos mennesker kendt som sensorineural hearing tab8,9. Derfor er det vigtigt at forstå, hvordan disse celler funktion for at forstå hvordan man kan behandle og forebygge høretab. For at fungere ordentligt, udnytte hårceller to specialiserede strukturer, der kaldes mechanosensory-hår bundter og synaptic bånd til at registrere og transmittere stimuli, henholdsvis. Hår bundter er placeret på toppen af hårcellerne og består primært af fine, hår-lignende fremspring kaldes stereocilia (fig. 1A). I vestibulære og laterale-line hårceller har hver hår bundle også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sande cilium), som kan udvide langt over stereocilia (fig. 1A). Mechanosensory stimuli aflede hår bundter, og afbøjning sætter spændingen på forbindelser kaldet "tip-links" at sammenkoble stereocilia10. Denne spænding åbner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, hvilket resulterer i en apikale tilstrømning af kationer, herunder calcium11,12. Denne apikale aktivitet i sidste ende depolarizes håret cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler (Cav1.3) i bunden af cellen. Cav1.3 kanaler findes ved siden af synaptic bånd, en præsynaptiske struktur, der bindsler vesikler på aktive zoner. Basal calcium tilstrømning gennem Cav1.3 kanaler er nødvendig for vesikel fusion, neurotransmission og aktivering af afferente neuroner13,14.
I mange år, elektrofysiologiske teknikker som helhed-celle patch fastspænding har været brugt til sonde de funktionelle egenskaber af hårcellerne i mange arter, herunder zebrafisk15,16,17, 18,19,20. Disse elektrofysiologiske optagelser har været særligt værdifulde i felterne hørelse og balance, fordi de kan bruges til at opnå yderst følsomme målinger fra individuelle sensoriske celler, hvis formål er at indkode ekstremt hurtig stimuli over en bred vifte af frekvenser og intensiteter21,22. Desværre, hele-celle optagelser kan ikke måle aktivitet af populationer af hårceller. For at studere aktivitet af populationer af celler i zebrafisk laterale-line, er microphonic potentialer og afferente handling potentialer blevet brugt til at måle den summerede mechanosensitive og postsynaptiske respons egenskaber af individuelle neuromasts23 ,24. Desværre har hverken hele-celle optagelser eller lokale potentielle feltmålinger den rumlige opløsning at lokalisere hvor aktivitet foregår inden for enkelte celler eller måler aktiviteten af hver celle i en befolkning. Mere nylig, calcium farvestoffer og GECIs har været ansat til at omgå disse udfordringer25,26.
I zebrafisk, har GECIs vist sig for at være en kraftfuld tilgang til behandlingen af hår-celle funktion på grund af den relativt let at skabe transgene zebrafisk og den optisk klarhed af larver27. På zebrafisk larver der hårcellerne i det indre øre samt laterale-line system. Sidelinjen består af roset-lignende klynger af hår celler kaldet neuromasts, der bruges til at registrere lokale ændringer i vandbevægelse (figur 1). Sidelinjen er især nyttigt, fordi det ligger eksternt langs overfladen af fisken. Denne adgang har gjort det muligt at stimulere hårcellerne og måle calciumsignaler optisk i intakt larver. Lethed, hvormed transgenese, gennemsigtighed af larver, og laterale-line hårceller uovertruffen adgang har generelt gjort zebrafisk en uvurderlig model til at studere aktiviteten af hår celler in vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer som hår celler er omgivet af benede strukturer i det indre øre. Denne manglende adgang har gjort det meget vanskeligt at erhverve funktionelle in vivo målinger af pattedyr hårceller.
Protokollen skitseret her beskriver hvordan man kan overvåge MET kanal - og presynapse-afhængige ændringer i calcium inden for enkelte hårceller og mellem celler inden for neuromasts i larve zebrafisk. Denne protokol udnytter en etableret transgene zebrafisk linje, der udtrykker en membran-lokaliseret GCaMP6s under kontrol af hår-celle specifikke myosin6b promotor28. Denne membran lokalisering holdninger GCaMP6s for at opdage calcium tilstrømning gennem Ionkanaler placeret i plasma membran, der er afgørende for hår-celle funktion. For eksempel, membran-lokaliseret GCaMP6s kan afsløre calcium tilstrømning gennem MET kanaler i apikale hår bundter og gennem CaV1,3 kanaler nær synaptic bånd i bunden af cellen. Dette er i kontrast med hjælp af GECIs lokaliseret i cytosol, som cytosole GECIs opdage calciumsignaler, der er en kombination af markedsøkonomisk behandling og CaV1,3 kanal aktivitet samt calcium bidrag fra andre kilder (f.eks., store udgivelse). Denne protokol beskriver, hvordan at immobilisere og lamme GCaMP6s transgene larver inden billeddannelse. Derefter beskrives det hvordan du forbereder og bruge en væske-jet til at aflede hår bundter for at stimulere laterale-line hårcellerne i en kontrolleret og reproducerbar måde. Præsenteres repræsentative data, der kan opnås ved hjælp af denne protokol. Eksempler på data, der repræsenterer bevægelsen artefakter er også præsenteret. Kontrol eksperimenter, der bruges til at kontrollere resultaterne og udelukke artefakter er beskrevet. Endelig, en metode til at visualisere rumlige calciumsignaler i Fiji software er beskrevet. Denne Fiji analyse er tilpasset fra tidligere etablerede visualisering metoder udviklet ved hjælp af MATLAB5. Samlet set skitserer denne protokol en kraftfuld forberedelse teknik, som anvender GECIs larve zebrafisk at måle og visualisere hår-celle calcium dynamics in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensoriske hårcellerne er mechanoreceptors fundet i det indre øre, der er nødvendige for hørelse og balance. Hår celler aktiveres i reaktion på sensoriske stimuli, der mekanisk aflede apikale fremspring kaldt hår bundter. Afbøjning åbner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bundter, fører til en tilstrømning af kationer, herunder calcium. Denne kation tilstrømning depolarizes cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler ligger basalt på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellerne er indkapslet i knoglen, og det er udfordrende at funktionelt vurdere disse aktiviteter in vivo. Derimod larve zebrafisk er gennemsigtige og besidder en eksternt placeret laterale-line orgel, der indeholder hårceller. Disse hårcellerne er funktionelt og strukturelt svarer til pattedyr hårceller og kan være funktionelt vurderet in vivo. I denne artikel beskrives en teknik, der udnytter en genetisk kodet calcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, til at måle stimulus-fremkaldte calcium i zebrafisk laterale-line hårceller. GCaMP6s kan sammen med Konfokal imaging, bruges til at måle in vivo calciumsignaler på apex og base af laterale-line hårceller. Disse signaler giver en real-time, kvantificerbare udlæsning af både mechanosensation - og presynapse-afhængige calcium aktiviteter inden for disse hårceller. Disse calciumsignaler også give vigtige funktionelle oplysninger om hvordan hårceller registrere og transmittere sensoriske stimuli. Samlet set denne teknik genererer nyttige data om relative ændringer i calcium aktivitet in vivo. Det er mindre velegnet til kvantificering af absolut størrelsesklasse af calcium ændringer. Denne in vivo teknik er følsomme over for bevægelse artefakter. Et rimeligt beløb af praksis og dygtighed er nødvendige for korrekt positionering, immobilisering og stimulation af larver. I sidste ende, når korrekt udført, den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver en kraftfuld måde at samle værdifulde oplysninger om aktiviteten af hårcellerne i deres naturlige, fuldt integreret stater inden for et levende dyr.

Efter myo6b:GCaMP6s-caax transgene fisk er korrekt immobiliserede og væske-jet stimulus er leveret til laterale-line hårceller, robust calciumsignaler kan visualiseres og målt (tal 4 og 5, taget på 2 X binning). Under væske-jet stimulation signalerer calcium, kan enten måles i de apikale hår bundter, hvor MET kanaler åbne som svar på stimuli, eller i bunden af hårcellerne, hvor præsynaptiske Cav1.3 calcium kanaler udløse neurotransmission. Et repræsentativt eksempel på calcium svar i disse regioner med en enkelt neuromast er vist i figur 4A1-A2''. I dette eksempel, blev en 2-s 5 Hz væske-jet stimulus leveret for at aktivere alle hår celler inden for den repræsentative neuromast. Under stimulus, robust calciumsignaler kan påvises i hår bundter (figur 4A1-A1'', svar fra 8 hår bundter er vist). I dette system vise næsten alle modne hårceller denne apikale tilstrømning af calcium5. Derimod inden for den samme neuromast, der er påviselig calciumsignaler i basal, synaptic flyet i kun en delmængde (~ 30%) af hårcellerne (figur 4A2-A2'', 4 celler med præsynaptiske svar er vist)5. 4 grønne ROIs Vis celler med ingen betydelig præsynaptiske calciumsignaler (figur 4A2-A2'') trods robust apikale calciumsignaler (figur 4A1-A1''). I denne repræsentativt eksempel (figur 4A1-A2''), farvet ROIs matche op hår bundter i det apikale markedsøkonomisk behandling plan (figur 4A1) med deres celle organer i basal synaptic flyet (figur 4A2). Dette eksempel fremhæver, hvordan begge MET afhængige - og præsynaptiske-calcium signaler kan måles inden for enkelte hårceller og blandt befolkningerne i hårceller.
Calciumsignaler i både hår bundterne og på presynapse kan afbildes grafisk som enten rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (Se trin 12, tal 4A1'-A1'' og 4A2'-A2''). (F) GaMP6s grafer fremhæve at baseline fluorescens intensitet for hver celle kan variere (tal 4A1' og 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, hver celle er normaliseret til sin oprindelige værdi og relative intensitet ændringen fra baseline er afbildet (tal 4A1'' og 4A2''). I begge (F) og ΔF/Fo GCaMP6s parceller, calciumsignaler i både apikale hår bundt og basal præsynaptiske plan indlede med udbruddet af stimulus (grå boks) og falde eksponentielt efter stimulus slutter. Under stimulus, calciumsignaler i hår bundter stige hurtigt og mætte Hvis styrken af indbøjningen ikke ændrer (figur 4A1-A1''). Derimod inden for delmængden af hårcellerne med påviselig calciumsignaler i synaptic flyet, calciumsignaler stiger mere gradvist og er mindre tilbøjelige til mætning (figur 4A2-A2''). I hårceller uden præsynaptiske calciumsignaler (grøn ROIs) forbliver calciumsignaler nær baseline.
Ud over disse grafiske repræsentationer (figur 4), kan calciumsignaler visualiseres rumligt inden for den hele neuromast tid i løbet af indspilningen. Et eksempel på en spatiotemporelle repræsentation er vist i figur 5 for præsynaptiske GCaMP6s signaler i basal flyet af en neuromast. I figur 5, er de vigtigste skridt til at behandle en billedsekvens til rumlig visualisering skitseret som beskrevet i trin 13. Først, de rå (F) GCaMP6s billeder er tidsligt arkiveret lodret [figur 5: række 1 (5 af de 14 placeringer er vist); trin 13.2.1]. Derefter, baseline billedet, beregnet fra før stimulus rammer (trin 13.2), trækkes fra (F) GCaMP6s fluorescens signaler til at opnå ΔF billeder (figur 5: række 2; trin 13.2.2). Næste, gråtonebilleder ΔF konverteres til en farve LUT (figur 5: række 3, Red Hot LUT; trin 13.3). Endelig, ΔF billeder med LUT konvertering er overlejret på de tidsligt binned (F) billeder (figur 5, første række) til at afsløre de spatiotemporelle signaler inden for neuromast under stimulation (figur 5: række 4; trin 13.4). Varme kort ΔF GCaMP6s signaler giver både værdifulde rumlige og tidsmæssige oplysninger, der ikke er let at parse ud fra enkelt ROIs og grafer i figur 4. Varme kort kan hjælpe med at visualisere kritiske spatiotemporelle oplysninger, herunder subcellulært oplysninger om indtræden og varighed af calciumsignaler inden for hvert hår celle samt timing og intensitet forskellene blandt hårceller inden for hele neuromast.
Det er vigtigt at kontrollere, at de grafer og rumlige varme kort repræsenterer sande calciumsignaler og er ikke artefakter som følge af bevægelse. I denne protokol, kan motion artefakter være et resultat af overdreven drift eller bevægelse af larve eller motion på grund af væske-jet stimulation. Alle disse artefakter er udfordrende for helt at eliminere i dette in vivo forberedelse. Mens registrering af billedsekvenser (trin 12.1.3) kan korrigere for skal størstedelen af bevægelse i x - og y-axes, billedsekvenser med overdreven bevægelse i z-aksen være identificeret og fjernet fra analyser. Motion artefakter er lettest at identificere ved graftegning calciumsignaler. Eksempler på GCaMP6s intensitet ændringer, der er artefakter ikke og sandt GCaMP6s signaler kan observeres på apex (fig. 4B1'-B1'') og base (figur 4C1'-C1'') af hårceller.
I de apikale hår bundter, motion artefakter er fælles, når væske-jet stimulus er for stærk (figur 3A3'' '). Under disse alt for stærke stimuli, apikale hår-pakken fly kan flytte ud af fokus under væske-jet stimulation og derefter vende tilbage til det oprindelige brændplanet efter stimulus ophører (figur 4B1'-B''). Dette gør det vanskeligt at præcist at måle apikale MET-afhængige calciumsignaler. Et eksempel på hår-bundle bevægelse artefakter kan ses i figur 4B1'-B1''. Her, grafer viser et fald i GCaMP6s signaler under stimulus (grå boks) når hår bundter er out-of-fokus. Efter stimulus slutter, øge GCaMP6s signalerne hurtigt som hår bundter vende tilbage til deres oprindelige holdning og komme tilbage i fokus. Dette er i kontrast med eksemplet i figur 4A1 «-A1'' hvor de apikale calciumsignaler øge ved starten af stimulus og mindske når stimulien slutter.
Mens bevægelsen på grund af overdreven væske-jet stimuli kan også flytte synaptic flyet ud af fokus, er denne type af motion artefakt mindre almindelige i denne plan. I stedet, ændringer i fokus i z-akse bevægelse eller drift af larve er de mest almindelige årsager til motion artefakter. Larve bevægelse eller drift kan påvirke GCaMP6s målinger på både apex og base af hårceller. I figur 4er vist et eksempel af larve bevægelse, der øger GCaMP6s i basal, synaptic flyet under stimulienC'-C''. Motion artefakter (figur 4C1'-C1'') kan skelnes fra sande præsynaptiske signaler (figur 4A2'-A2'') ved at undersøge tidsforløb af GCaMP6s signalerne. I stedet for at øge og mindske eksponentielt med stimulus (figur 4A2'-A2''), den motion-induceret stigning i GCaMP6s signal har en firkantet form og stiger og falder brat med debut og forskydningen af stimulus, henholdsvis () Figur 4 C1'-C1'').
Ud over omhyggelig undersøgelse naturligvis tid af GCaMP6s signaler, kan kontrol eksperimenter ved hjælp af farmakologi bruges til at skelne sande GCaMP6s signaler fra motion artefakter. For eksempel, kan BAPTA (trin 10) anvendes for at kløve tip-links, der er nødvendige for markedsøkonomisk behandling-kanals funktion i hår bundter. BAPTA skal fjerne både væske-jet-fremkaldte apikale MET-kanal-afhængige calcium tilstrømning samt den efterfølgende basal, præsynaptiske calcium tilstrømning gennem Cav1.3 kanaler. I den repræsentative eksempel på ægte stimulus-fremkaldte calciumsignaler (figur 4A1-A2'') under væske-jet stimulation, alle ændringer i GCaMP6s fluorescens i både de apikale og basal fly ville blive fjernet efter BAPTA behandling. Derimod ændres i GCaMP6s fluorescens på grund af motion som dem vist i tal 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1'' ville ikke blive elimineret af BAPTA behandling.
Ud over at bruge BAPTA til at fjerne alle stimulus-fremkaldte GCaMP6s signaler, der kan anvendes isradipine (trin 11) specifikt blokere Cav1.3-afhængige calcium tilstrømning i basal synaptic flyet mens apikale MET-kanal-afhængige calcium tilstrømning intakt5. Efter anvendelse af isradipine, i en individuel neuromast med ingen bevægelse artefakter, ændringer i GCaMP6s fluorescens i apikale hår bundter (figur 4A1 «-A1'') under væske-jet stimulation ville være uændret, mens alle synaptic GCaMP6s Fluorescens ændringer i bunden ville blive elimineret (figur 4A2'-A2''). Enhver ændring i GCaMP6s signal i synaptic flyet efter isradipine program (f.eks.,figur 4C1-C1'') ville højst sandsynligt svare til motion artefakter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig1.jpg"> Figur 1 : Oversigt over en laterale-line neuromast og funktionel billeddannelse fly. (A) i diagrammet til venstre viser en side-visning af en neuromast med fire hår-celle organer (sort) at kontakte postsynaptiske afferente neuroner (blå). Bånd (grøn) tether vesikler på præsynaptiske aktive websteder inden for hver celle. Apikale til hver celle organ er et bundt af stereocilia (1 µm), der indeholder MET kanaler. Hvert hår bundt har en kinocilium, der overfører den mekaniske styrke af vand bevægelse til bunden af hår bundle. I diagrammet til højre viser den samme model i en oppefra. I denne top-down se, sort bruges til at angive de fire celler afbildet i diagrammet til venstre, og grå bruges til at angive andre celler i neuromast. Inden for denne model, og disse 2 visninger tre vigtige fly er fremhævet: (1) tips af hår bundter (kinocilia) bruges til at opgøre omfanget af hår-bundle afbøjning, (2) den apikale MET plane i bunden af hår bundter hvor calcium ind i cellen under stimulation, og (3) den synaptic plane i bunden af den celle, hvor calcium ind i nærheden af synaptic bånd. (B1-B1') DIC og GCaMP6s top-down billeder af markedsøkonomisk plane i bunden af hår bundter, hvor mechanosensation-afhængige calciumsignaler kan registreres. (B2-B2 ") DIC og GCaMP6s top-down billeder fra den samme neuromast som B1-B1', men i bunden af neuromast i synaptic flyet, hvor præsynaptiske calciumsignaler kan påvises. (C1-C2) Billeder af en neuromast udtrykker GCaMP6s hvor larverne er forkert monteret. I dette eksempel, er apikale MET fly (C1) og synaptic fly (C2) i bunden af cellen placeret på en ikke-optimal vinkel. Denne holdning ikke tillader alle hår bundter til afbildning i et enkelt fly, og mange flere billeddannelse fly er nødvendig for at fange aktivitet på alle synapser inden for denne neuromast i forhold til B1-B2 ". Billeder er af larver på 5 dpf. Skalalinjen i C2 svarer til alle billeder i B1-C2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig2.jpg"> Figur 2 : Imaging kammer, zebrafisk montering og hjertet injektion procedurer og nåle. (A) vist er en billedbehandling kammer med en larve (skitseret af et stiplet rektangel) fastgjort til center på toppen af silikone encapsulant. (B1) Vist er en 5 dpf larve immobiliserede af to ben. En stor hoved pin er placeret vinkelret på kroppen lige posteriort for øjet. De to øjne er helt overlejret så bunden øjet er helt skjult af det øvre øje. En lille hale pin skærer notochord i halen. Larve er flad og ikke snoet. (B2) For at lamme larve, en hjerte injektion nål er orienteret vinkelret på kroppen og bragt støder op til hjertet. Hjertet injektion nålen skal kontakte pigment cellen foran hjertet. (B2 ") Depression af nålen ind i huden forårsager indrykningen af pigment cellen foran hjertet. (C) nåle i rækkefølge fra venstre mod højre: eksempel på en hjerte injektion nål med en åbning på ca 3 µm; eksempel på en god væske-jet nål med en åbning på ca. 50 µm; eksempel på et dårligt brudt væske-jet nål, som er store og takkede, og vil sandsynligvis producere overdreven og uregelmæssige stimuli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig3.jpg"> Figur 3 : Væske-jet justering, positionering og stimulus kalibrering. (A1) Vist er en larve orienteret med de hoved vendende mod venstre og hale til højre, og en væske-jet nål orienteret parallelt med A-P akse af zebrafisk kroppen. Denne væske-jet nål er justeret for at stimulere den neuromasts, der reagerer på forreste (push/pres) og posterior (pull/vakuum) instrueret væske-flow. (A2) Vist er en neuromast (beskrevet af stiplede hvid linje) og tips af apikale hår bundter (kinocilia) på venstre side panel og væske-jet nålen på højre side af panelet. Væske-jet er placeret cirka 100 µm fra kanten af neuromast. (A3-A3'' ') Skudspidserne af apikale hår bundter (kinocilia) er afrettet forskellige afstande af varierende væske-jet stimulus pres. Banen af en enkelt kinocilial tip er vist for 1,5 µm (A3') og 5 µm (A3'') afbøjning afstande. Den sorte cirkel angiver den hvilende placering af kinocilium. Det er vigtigt, at kinocilia ikke er afvige alt for langt, ellers stimulus intensitet ikke kan kvantificeres pålideligt og kan blive skadelig (A3'' '). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig4.jpg"> Figur 4 : Apikale MØDTE og basal præsynaptiske GCaMP6s signaler under væske-jet stimulation i laterale-line hårceller. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet ændringer i væske-jet stimulation i et repræsentativt neuromast. Billederne til venstre viser apikale MET fly (A1) og basal synaptic fly (A2) inden for den samme neuromast. ROIs farvekodede i A1 og A2 blev brugt til at afbilde tidsforløb (f) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre for hvert billede. (B1-B1'') Eksempel på en apikale MET billedsekvens med overskydende bevægelse under væske-jet stimulation. Billedet til venstre (B1) viser ROIs bruges til plot (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre. (C1-C1'') Eksempel på en billedsekvens i basal synaptic plan at viser bevægelse artefakter og GCaMP6s signalerer ændringer, ikke der rigtigt calcium signaler. Billedet til venstre (C1) viser ROIs bruges til plot (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til højre. Den grå boks i hver graf repræsenterer varigheden af væske-jet stimulus under hver enkelt billedsekvens. En 2-s 5 Hz væske-jet stimulus blev brugt for eksempel i A1-A2'' og B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s forreste trin stimulus blev brugt. Y-aksen for (F) GCaMP6s grafer skildrer arbitrære enheder (A.U.) fremstillet af Fiji billede intensitet målinger. Alle eksempler er fra larver på 4-5 dpf. Skalalinjen = 5 µm af alle billeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig5.jpg"> Figur 5 : Spatiotemporelle visualisering af præsynaptiske GCaMP6s signaler under væske-jet stimulation. De skridt til at visualisere de spatiotemporelle ændringer i GCaMP6s intensitet i en neuromast under stimulus er skitseret. Tid er repræsenteret fra venstre til højre efter tidsstempel på toppen af billeder. Den øverste række viser 5 af 14 tidsmæssige placeringerne fra en 70-frame GCaMP6s (F) billedsekvens (trin 13.2.1). I den anden række, er baseline (trin 13.2) blevet fjernet fra hver (F) GCaMP6s binned billede til at skabe ΔF billeder (trin 13.2.2). I den tredje række, ΔF billeder er blevet konverteret fra gråtoner (anden række) til Red Hot LUT (trin 13.3). Min og Maks i disse LUT billeder indstilles efter Red Hot LUT zonekort relative ΔF intensitet (A.U.) til højre (trin 13.3.1). I den nederste række, er den tredje række overlejret på (F) billeder i den øverste række (trin 13.4). Den grå linje øverst i figuren angiver timingen af 2-s 5 Hz væske-jet stimulus. For eksempel er fra en 5 dpf larver. En legende af Red Hot LUT zonekort relative ΔF intensitet (A.U.) er vist til højre. Skalalinjen = 5 µm af alle billeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

For zebrafisk er et modelsystem, der har mange værdifulde funktioner, herunder optisk klarhed, hurtige ekstern udvikling, og af særlig betydning for feltet af hørelse og balance, eksternt placeret sensoriske hårceller. Denne artikel beskriver hvordan transgene zebrafisk kan bruges til at analyse både hår-celle mechanosensation og præsynaptiske funktion i toto.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare grundlæggende spørgsmål inden for hørelse og balance. Det beskriver, hvordan man kan opdage to vigtige aspekter af sensoriske hårceller funktion, mechanotransduction og præsynaptisk aktivitet. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det giver os mulighed for at visualisere funktionen af hårceller i et levende dyr, og at studere, hvordan samlinger af hårceller opdage og overføre sensoriske oplysninger.For at begynde denne procedure, skal du bruge fine pincet og wolfram wire til mode de stifter, der skal bruges til at immobilisere larver gennem hoved og hale, på den hærdede opkapsulant. For at gøre hoved stifter, holde et stykke 0,035 millimeter wolfram wire i den ene hånd. Brug fine kraftæceser i den anden hånd, bøje wiren en millimeter op fra slutningen, ved 90 grader.Byt pincet til en saks, og skær en millimeter efter svinget, for at skabe stiften. Brug derefter pinp'er til at sætte stifterne i den hærdede indkapslet på kammeret. Placer larven i midten af perfusionskammeret, så den ligger fladt på sin side mod silikoneindkapslen.Brug fine pincet, bringe 0,035 millimeter hoved pin ned vinkelret på larverne. Sæt hovedstiften mellem øjet og otic vesicle, og ned i indkapslet. Brug et andet sæt pinp til at stabilisere larverne langs dens dorsale og ventrale side, mens pinning.Sørg for, at den vandrette del af stiften kontakter larven og ikke trykker helt ind i indkapslingen. Vinkl pin ventrally, eller peger lidt mod den forreste del af larv, for at undgå at forstyrre efterfølgende hjerteindsprøjtning og hårcelle billeddannelse. Brug pincet, indsætte en 0,025 millimeter hale pin i notochord, så tæt som muligt på enden af halen.For at indsprøjte alfa bungarotoxin i larven skal der fyldes tre mikroliter af opløsningen op i injektionsnålen ved hjælp af en gellæstepipettespids. Indlæs opløsningen jævnt til spidsen uden bobler. Sæt derefter hjerteinjektionsnålen i en pipetteholder fastgjort til en manuel mikromanipulator.Under et stereomikroskop skal du placere nålen, så den er vinkelret på AP-aksen på den bedøvede larve, der peger ned i en vinkel på 30 grader. Tilslut derefter pipetteholderen til trykinjektoren. Injicer en bolus alfa bungarotoxin i opløsningen for at teste, om nålespidsen er klar.Hvis der ikke ses nogen rød farve, skrabes nålespidsen meget forsigtigt mod kanten af en nål, og prøv igen, indtil nålen er klar. Derefter fremrykning nålen mod hjertet, indtil den rører huden uden for hjertet. Tryk nålen ind i larven, og se efter indrykning af pigmentcellen på huden foran hjertet for at sikre, at nålen er placeret i det korrekte plan i forhold til larverne.Derefter fremrykning nålen længere, indtil det gennemborer huden og ind i hjertet hulrum. Træk nålen lidt tilbage, og injicere en bolus af alpha bungarotoxin i hjertet hulrum. Kig efter oppustning af hjertehulen, eller for rødt farvestof ind i hulrummet.Skyl forsigtigt larverne tre gange med en milliliter neuronal buffer for at fjerne den resterende MS222. Fjern aldrig al væsken. Der vedligeholdes larver i ca. 1 millileter neuronal buffer i perfusionskammeret.I denne procedure opfyldning 10 mikroliter neronal buffer i en korrekt brudt væske-jet nål ved hjælp af en gel loading tip. Indlæs opløsningen jævnt på spidsen uden bobler. Sæt derefter nålen i pipettenholderen, der er fastgjort til den motoriserede mikromanipulator.Anstænke perfusionskammeret i en cirkulær kammeradapter på mikroskopstadiet. Flyt den motoriserede fase, så larverne er i midten af synsfeltet. Drej derefter den cirkulære kammeradapter, så AP-adgangen til larverne stort set flugter med væskestrålenålens bane.Brug transmitteret lys og differentialinterferens kontrast, bringe larverne i fokus og centrere den under 10x målet. Derefter hæve 10x mål. Brug den motoriserede mikromanipulator, bringe væske-jet nål ned i midten af synsfeltet, så det er belyst af det transmitterede lys og knap røre neuronal buffer.Sænk 10x målet at fokusere på larverne for at bekræfte dens placering. Fuous målet på væske-jet nål. Flyt væske-jetnålen med mikromanipulatoren i x- og y-aksen, indtil den er i en position parallelt med larvens dorsale side.Derefter fokusere tilbage på larverne. Bring nålen ned i z-aksen og placer nålen langs den dorsale side af fisken, 1 millimeter væk fra kroppen. Bevæg forsigtigt den cirkulære kammeradapter for at sikre, at væskejetnålen flugter langs lalens AP-midterlinje.Dernæst skifte til 60x vand mål. Sørg for, at målet er emersed i neuronal buffer. Brug den fine fokus til at finde en neuromast.Efterfølgende flytte motarized fase at placere neuromast af interesse i midten af synsfeltet. Hold væsken jet nål spids langs dorsale side af fisken. Rør ikke ved væskenålspidsen på larverne eller kammeroverfladen.Placer væske-jet nålen med mikromanipulatoren, så den er 100 mikrometer fra neuromastens yderkant. Derefter fokusere op til spidsen af apical hår bundter. Bunden af væske-jet nålen bør være i fokus i dette fly.Indstil højhastighedstrykklemmen fra manualen til ekstern tilstand for at modtage input fra billedbehandlingssoftwaren. Nul på højhastighedstrykklemmen ved at trykke på nulknappen, og brug indstillingsknappen til at indstille hviletrykket lidt positivt. Bekræft hvileeffekten af højhastighedstrykklemmen ved hjælp af en PSI-manometer, der er fastgjort til hovedtrinudgangen.For at bestemme det nødvendige tryk for at stimulere håret bundter, anvende en test stimulus med en 0,125 og 0,25 volt output for 200-500 millisekunder. For hver test stimulus, måle afstanden af afbøjning af spidsen af hårbundles, kinocilia. Vælg et tryk, der flytter bundterne en afstand på ca. 5 mikrometer.Sørg for, at spidsen af kinocilia forbliver i fokus hele tiden. Hvis du vil anskaffe billeder med et enkeltplan, skal du vælge en stimulans, der skal leveres under anskaffelsen af 80-rammen efter ramme 30 på 3 sekunder. For at måle mechanosensitive calcium reaktioner, fokusere på bunden af apical hår bundter og starte billedet erhvervelse.For at måle præsynaptiske calcium reaktioner, fokusere i bunden af hårceller, og begynde billedet erhvervelse. De skridt til at visualisere de spatiotemporale ændringer i GCaMP6S intensitet, inden for en neuromast under simulering, er skitseret her. Tiden repræsenteres fra venstre mod højre i henhold til tidsstemplet.Den øverste række viser fem af de fjorten tidsmæssige spande fra en 70-frame GCaMP6S F billedsekvens. I den anden række er grundlinjen blevet fjernet fra hvert GCaMP6S F-binneret billede for at oprette delta F-billeder. I tredje række er delta F-billeder blevet konverteret fra gråskala til rødglødende opslagstabel.I den nederste række er den tredje række blevet overlejret på F-billederne i den øverste række. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at sikre, at larverne er fastgjort korrekt, og at bruge passende kontroller, som beskrevet i manuskriptet for at udelukke bevægelsesartefakter fra dine data. Arbejde med alfa bungarotoxin kan være farligt.Det er vigtigt at tage forholdsregler, såsom at bære handsker, mens du håndterer det.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp optagelser i indre øre-hårceller isoleret fra zebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forhjerne Elektrofysiologiske Optagelse i Larvernes zebrafisk

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Aktivitet af Posterior Lateral Line Afferent Neuroner under svømning i zebrafisk

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalerbar model til at studere virkningerne af Blunt-Force Skade i voksen zebrafisk

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...