Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de NIH/NIDCD intramurale onderzoek middelen 1ZIADC000085-01 (KSK). Wij willen erkennen Candy Wong voor haar hulp bij het schrijven van de Fiji-macro. Wij zouden ook graag Doris Wu en Candy Wong bedanken voor hun nuttige suggesties met het protocol.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In vivo imaging in intact dieren is inherent uitdagend. Verschillende stappen in deze methode zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare in-vivo calcium metingen vanaf de zijlijn haarcellen. Bijvoorbeeld, is het zeer belangrijk dat de larve is gespeld en verlamd goed voor imaging om te minimaliseren van verkeer tijdens imaging. Overtollige beweging gedurende de beeldvorming kan leiden tot veranderingen in GCaMP6s fluorescentie die geen echte signalen en komen niet overeen met de veranderingen in calciumgehalte (b.v. cijfers 4B1'-B1'' en 4 C 1'-C1''). Staart pennen kunnen meer anteriorly te helpen minimaliseren van beweging, maar dit meer posterieure neuromasten ontoegankelijk renderen kan worden geplaatst. Bovendien, na injectie van hart, hoofd pinnen kan worden gedraaid zodat het horizontale gedeelte van de pin over de dooier ligt. Naast het wijzigen van de positie van de pinnen, is het ook mogelijk met een hersenen-delige harp in plaats van de pinnen te immobiliseren larven34. Wanneer geplaatst over de larven goed, is een harp een extra, potentieel minder invasieve methode van de immobilizing van de larven. Terwijl belangrijke beweging voortvloeien kan uit de ontoereikende vastzetten, kan niet naar behoren uitvoeren van de hart-injectie verlammen van larven te leveren van α-bungarotoxin leiden tot onvolledige verlamming, verkeer, en uiteindelijk bewegings-artefacten. Hoewel gebruikte verdoving is aangetoond dat ze invloed op de prikkelbaarheid van de zebravis haarcellen, heeft recente onderzoek aangetoond dat de verdoving benzocaïne niet met vele aspecten van Haarcel activiteit interfereert. Ook gebruikte de meer verdoving die MS-222 alleen met bepaalde aspecten van Haarcel activiteit15 interfereert. Daarom, vanwege de moeilijke aard van α-bungarotoxin injectie, benzocaïne of MS-222 toepassing kan blijken te zijn een handige alternatieve methode van verlamming om beweging te voorkomen in de larve tijdens functionele calcium imaging.
Naast de technische uitdagingen die betrokken zijn bij dit protocol is zelfs een perfect gemonteerd monster nutteloos als de larve en de haarcellen niet gezond voorafgaand aan en tijdens elk imaging experiment zijn. Om ervoor te zorgen dat de larven en haarcellen gezond zijn, is het belangrijk dat de larven in E3-buffer die is vrij van vuil zoals chorions (eierschalen), afval en micro-organismen worden gehandhaafd. Hoewel de oppervlakkige locatie van dwarslijn haarcellen gunstig voor de beeldvorming is, maakt deze locatie ze kwetsbaarder zijn voor cellulaire schade wanneer de E3-buffer is vervuild. Een schone, waterige omgeving is bijzonder belangrijk voor de jonge larven (2-4 dpf) of mutanten dat kan toch niet een rechtop zwemmen blijven plaats en vooral liggen op de bodem van de petrischaal. In deze situaties, kunnen dwarslijn haarcellen en de beschermende cupula rondom de haar bundels gemakkelijk worden aangetast. Zelfs bij het starten met gezonde larven en haarcellen, in de loop van elk experiment, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de larve een hartslag en snelle bloedstroom heeft. Als de bloedstroom vertraagt of reageert, kan de gezondheid van de haarcellen worden aangetast. Gecompromitteerde voorbereidingen met betrekking tot ongezonde larven of verlies van bloedstroom, sterven haarcellen kan worden geïdentificeerd op verschillende manieren: ten eerste, door de verschijning van karyopyknosis of nucleaire condensatie, wat zich als een zeepbel in de cel onder DIC optica manifesteert; Ten tweede, door de krimp van de cel en de aanwezigheid van snel bewegende deeltjes binnen het cytoplasma; en ten derde, wanneer kinocilia tips splay uit in verschillende richtingen35. Wanneer haar bundels worden verstoord, de gespreide kinocilia niet alleen samen verplaatst tijdens stimulatie.
Deze voorbereiding heeft verschillende kleine beperkingen, namelijk dat de voorbereiding alleen blijft robuust voor 1-3 uur nadat het is ingesteld. Wijzigingen zoals het gebruik van kleinere jumperpennen of een hersenen-delige harp te immobiliseren van larven en het toevoegen van een perfusie-systeem kan verlengt u de levensduur van deze voorbereiding in vivo . Een andere beperking is dat photobleaching en fototoxiciteit kan optreden na herhaalde proeven imaging. Een spannende manier naar het overwinnen van deze uitdaging is te passen dit protocol voor licht vel microscopie. Licht vel microscopie is een krachtige manier om uit focus licht, wat leidt tot minder photobleaching en fototoxiciteit36. Samen, kunnen zachter immobilisatie en minder foto-blootstelling helpen verlengen elke imaging sessie. Meer imaging sessies kunnen worden gebruikt om te onderzoeken van de volledige duur van functionele veranderingen begeleidende ontwikkeling en de processen die ten grondslag liggen aan de Haarcel ontruiming en herstel na blessure. Het is belangrijk erop te wijzen dat, naast licht vel microscopie, dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten confocal systemen (punt-scannen, 2-foton en draaiende schijf) en relatief eenvoudige widefield systemen28,34 . Over het algemeen maakt zijn veelzijdigheid dit protocol een waardevol instrument dat kan worden aangepast en gebruikt met meerdere beeldvormende systemen.
Terwijl dit protocol kan worden aangepast en met veel beeldvormingssystemen gebruikt, kunnen delen van dit protocol ook worden aangepast en gebruikt (1) met andere indicatoren naast GCaMP6s en (2) afbeelding activiteit in andere sensorische cellen en neuronen binnen larvale zebrafish. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie gebruikten we dit protocol afbeelding activiteit met behulp van meerdere genetisch gecodeerde indicatoren binnen dwarslijn haarcellen cytosolische calcium (RGECO1), blaasje fusion (SypHy), membraan spanning (Bongwoori) en membraan calcium (jRCaMP1a-caax en GCaMP6s-caax), en binnen de dwarslijn afferent processen te detecteren membraan calcium (GCaMP6s-caax)5. De transgene lijn die TG(myo6b:gcamp6s-caax) in dit protocol beschreven is gebaseerd op onze ervaring met behulp van deze indicatoren, en biedt een uitstekende start voor imaging-activiteit in zijlijn neuromasten. Van alle bovengenoemde indicatoren, hebben we gevonden dat GCaMP6s de meest gevoelige en photostable is. Naast deze functies, markeren we de transgene lijn van Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) omdat het kan worden gebruikt om twee afzonderlijke metingen: Haarcel mechanosensation en presynaptische calcium binnen een transgene streep.
De techniek die in dit artikel beschreven toont aan hoe calcium beeldvorming in de zijlijn zebrafish kan zijn een krachtige methode om te bestuderen hoe de haarcellen in hun eigen omgeving functioneren. Deze aanpak vormt een aanvulling op de studies van zoogdieren in welke haar-cel functie momenteel bestudeerd wordt in ex vivo explantaten. Bovendien, kunt de zebravis model blijven om te worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van genetisch gecodeerde indicatoren die vervolgens kunnen worden toegepast om te controleren van activiteit in zoogdieren haarcellen.

Functionele calcium imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het controleren van de activiteit van veel cellen tegelijk1. In het bijzonder heeft calcium geschikt zijn met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) aangetoond dat het nuttig zijn, omdat de GECIs kan worden uitgedrukt in specifieke celtypen en gelokaliseerde subcellularly2. In onderzoek neurowetenschap hebben deze functies calcium geschikt zijn met behulp van GECIs een krachtige methode om zowel activiteit patronen binnen neuronale netwerken definiëren en meten van calcium toestroom op individuele synapsen3,4. Profiteren van deze functies, een recente studie gebruikt confocale microscopie en GECIs om subcellular activiteit binnen collecties van sensorische haarcellen5te controleren.
Haarcellen zijn de mechanoreceptors die geluid en vestibulaire prikkels in het binnenoor en lokale water beweging te in de zijlijn systeem in aquatische vetebrates6,7 detecteren. Haarcellen zijn vaak het doelwit van schade of genetische mutaties die leiden de meest voorkomende vorm van gehoorverlies in de mens bekend als perceptief hoorzitting verlies8,9 tot. Daarom is het essentieel om te begrijpen hoe deze functie van de cellen om te begrijpen hoe te behandelen en voorkomen van gehoorverlies. Haarcellen gebruiken om goed kan functioneren, twee gespecialiseerde structuren, genaamd mechanosensory-haar bundels en synaptische linten voor het detecteren en doorgeven van stimuli, respectievelijk. Haar bundels bevinden zich op de top van haarcellen en bestaan uit voornamelijk uit fijne, haar-achtige uitsteeksels bekend als stereocilia(Figuur 1). In vestibulaire en dwarslijn haarcellen heeft elke haar bundel ook een enkele lange kinocilium (van de cel enige echte cilium), die uitbreiden ver boven de stereocilia(Figuur 1 tot kan). Mechanosensory prikkels afbuigen haar bundels, en doorbuiging zet spanning op verbanden genaamd "tip-links", die stereocilia10interconnect. Deze spanning opent mechanotransduction (BMO) kanalen gelegen in de stereocilia, wat resulteert in een apicaal toestroom van kationen, zoals calcium11,12. Deze apicale activiteit uiteindelijk depolarizes de Haarcel en spanning-gated calcium kanalen (Cavvan 1.3) aan de voet van de cel opent. CAv1.3 kanalen worden grenzend aan synaptic linten, een presynaptische structuur die blaasjes op actieve zones aanbinden aangetroffen. Basale calcium toestroom via Cav1.3 kanalen is vereist voor het blaasje fusion, transmissie en activering van afferent neuronen13,14.
Voor vele jaren, elektrofysiologische technieken zoals geheel-cel patch klemmen zijn gebruikt om de sonde van de functionele eigenschappen van haarcellen in vele soorten, met inbegrip van de zebravis15,16,17, 18,19,20. Deze elektrofysiologische opnames geweest op het gehoor en evenwicht gebied bijzonder waardevol omdat ze kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van uiterst gevoelige metingen van individuele zintuigcellen, waarvan het doel is voor het coderen van extreem snelle prikkels een breed scala aan frequenties en intensiteiten21,22. Helaas meten niet geheel-cel opnamen de activiteit van de populaties van haarcellen. Om te bestuderen van de activiteit van de populaties van cellen in de zebravis-zijlijn, microphonic potentieel en afferent actie potentials zijn gebruikt voor het meten van de opgetelde mechanosensitive en postsynaptisch reactie eigenschappen van individuele neuromasten23 ,24. Helaas, noch lokale potentiële veldmetingen als geheel-cel opnames hebben de ruimtelijke resolutie te lokaliseren waar de activiteit plaatsvindt in afzonderlijke cellen of meten van de activiteit van elke cel binnen een populatie. Meer recentelijk, calcium kleurstoffen en GECIs zijn tewerkgesteld te omzeilen deze uitdagingen25,26.
In zebrafish, hebben GECIs bewezen een krachtige aanpak van de behandeling van haar-cel functie als gevolg van het relatieve gemak voor het creëren van transgene zebravis en de optische helderheid van larven27. In zebrafish larven zijn haarcellen in het binnenoor, alsmede de dwarslijn systeem aanwezig. De zijlijn bestaat uit rozet-achtige clusters van haarcellen genoemd neuromasten die worden gebruikt voor opsporing van lokale wijzigingen in water beweging (Figuur 1). De zijlijn is vooral handig omdat het extern is gelegen langs het oppervlak van de vis. Deze toegang heeft het mogelijk gemaakt te stimuleren van de haarcellen en meten van calcium signalen optisch in intact larven. Globaal, het gemak van Transgenese, transparantie van de larven en de ongeëvenaarde toegang van dwarslijn haarcellen heb zebrafish een onschatbare waarde model om te bestuderen van de activiteit van de haarcellen in vivo. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van zoogdieren systemen waarin haarcellen zijn omringd door benige structuren van het binnenoor. Dit gebrek aan toegang heeft het zeer moeilijk te verwerven van functionele in vivo metingen van zoogdieren haarcellen gemaakt.
Het protocol hier geschetst wordt beschreven hoe om te controleren MET kanaal - en presynapse-afhankelijk wijzigingen aan calcium binnen individuele haarcellen en tussen cellen binnen neuromasten in larvale zebrafish. Dit protocol maakt gebruik van een gevestigde transgene zebrafish lijn die een membraan-gelokaliseerde GCaMP6s onder de controle van de Haarcel specifieke myosin6b promotor28uitdrukt. Dit membraan lokalisatie posities GCaMP6s op te sporen van calcium toestroom via ionenkanalen gelegen in het plasma-membraan die essentieel zijn voor Haarcel functie. Bijvoorbeeld, membraan-gelokaliseerde GCaMP6s calcium kan detecteren toestroom via BMO kanalen in de apicale haar bundels en door CaV1.3 kanalen in de buurt van synaptic linten aan de voet van de cel. Dit staat in contrast met het gebruik van GECIs in het cytosol, gelokaliseerd als cytosolische GECIs detecteren signalen van de calcium die een combinatie van BMO en CaV1.3 kanaal activiteit evenals calcium bijdragen uit andere bronnen zijn (bijvoorbeeld, winkel release). Dit protocol beschrijft hoe te immobiliseren en te verlammen de transgene larven GCaMP6s voorafgaand aan de beeldvorming. Het beschrijft dan hoe te bereiden en een vloeistof-jet gebruiken om te doen afwijken van de bundels van de haar ter stimulering van de zijlijn haarcellen in een gecontroleerde en reproduceerbare manier. Representatieve gegevens die kan worden bereikt met behulp van dit protocol worden gepresenteerd. Voorbeelden van gegevens die bewegingsartefacten vertegenwoordigen worden ook gepresenteerd. Control-experimenten die worden gebruikt om te controleren van de resultaten en sluiten artefacten worden beschreven. Tot slot, een methode om ruimtelijke calcium signalen in de Fiji-software te visualiseren is beschreven. Deze analyse van Fiji is aangepast van tevoren vastgelegde visualisatie methoden ontwikkeld met behulp van MATLAB5. Over het geheel genomen schetst dit protocol een krachtige voorbereiding techniek die gebruikmaakt van GECIs in larvale zebrafish te meten en te visualiseren Haarcel calcium dynamiek in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensorische haarcellen zijn mechanoreceptors gevonden in het binnenoor die vereist voor het gehoor en evenwicht zijn. Haarcellen zijn geactiveerd in reactie op sensorische stimuli die mechanisch apicale uitsteeksels genaamd haar bundels afbuigen. Mechanotransduction (BMO) kanalen opent doorbuiging in haar bundels, wat leidt tot een toestroom van kationen, zoals calcium. Deze toevloed kation depolarizes van de cel en spanning-gated calcium kanalen basally gelegen aan de Haarcel presynapse opent. Haarcellen zijn ingekapseld in bot in zoogdieren, en het is uitdagend om functioneel beoordelen deze activiteiten in vivo. Daarentegen larvale zebrafish transparant zijn en beschikken over een extern gelegen dwarslijn orgaan waarin haarcellen. Deze haarcellen zijn functioneel en structureel vergelijkbaar met zoogdieren haarcellen en kan functioneel worden beoordeeld in vivo. Dit artikel schetst een techniek die gebruik maakt van een genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI), signalen GCaMP6s, voor het meten van stimulus-opgeroepen calcium in zebrafish dwarslijn haarcellen. GCaMP6s kan worden gebruikt, samen met confocal imaging, om te meten in vivo calcium in de apex en basis van haarcellen dwarslijn signalen. Deze signalen geven een real-time, kwantificeerbare uitlezing van beide mechanosensation - en presynapse-afhankelijke calcium activiteiten binnen deze haarcellen. Deze calcium signalen ook belangrijke functionele zij informatie verstrekken over hoe haarcellen detecteren en doorgeven van zintuiglijke prikkels. Over het algemeen deze techniek nuttige gegevens over relatieve wijzigingen in calcium activiteit genereert in vivo. Het is minder geschikt voor de kwantificering van de absolute magnitude van calcium veranderingen. Deze in vivo techniek is gevoelig voor beweging artefacten. Een redelijke hoeveelheid praktijk en vaardigheden zijn vereist voor de juiste positionering, immobilisatie en stimulatie van larven. Uiteindelijk, wanneer goed uitgevoerd, het protocol dat in dit artikel beschreven is een handige manier voor het verzamelen van de waardevolle informatie over de activiteit van de haarcellen in hun natuurlijke, volledig geïntegreerde Staten binnen een levende dieren.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen op het gebied van horen en evenwicht. Het beschrijft hoe twee belangrijke aspecten van sensorische haarcellen functie, mechanotransductie en presynaptische activiteit te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het ons in staat stelt om de functie van haarcellen in een levend dier te visualiseren en te bestuderen hoe collecties van haarcellen sensorische informatie detecteren en overbrengen.Om deze procedure te beginnen, gebruik maken van fijne tangen en wolfraam draad om de mode van de pinnen te worden gebruikt om de larve immobiliseren door de kop en staart, op de geharde inkapseling. Om hoofdpennen te maken, houdt u een stuk van 0,035 millimeter wolfraamdraad in één hand. Met behulp van fijne tangen in de andere hand, buig de draad een millimeter omhoog van het einde, op 90 graden.Ruil de tangen voor fijne schaar, en snijd een millimeter na de bocht, om de pin te maken. Gebruik vervolgens tangen om de pinnen in de geharde ingekapsel op de kamer te steken. Plaats de larve in het midden van de perfusiekamer, zodat deze plat op zijn kant tegen de siliconen inkapseling ligt.Breng met behulp van fijne tangen de 0,035 millimeter koppen loodrecht op de larve. Steek de hoofdspeld tussen het oog en de otische blaasjes en naar beneden in de inkapseling. Gebruik een tweede set tangen om de larve langs de rug- en ventrale kant te stabiliseren, terwijl u zich vastzet.Zorg ervoor dat het horizontale deel van de pin contact raakt met de larve en niet helemaal in de inkapsel drukt. Hoek de pin ventrally, of wijzen iets in de richting van de voorste van de larve, om te voorkomen dat interfereren met de daaropvolgende hartinjectie en haarcel beeldvorming. Steek met de tangen een staartspeld van 0,025 millimeter in de notochord, zo dicht mogelijk bij het einde van de staart.Om alfa bungarotoxine in de larve te injecteren, vult u drie microliters van de oplossing op in de injectienaald met behulp van een gelbelastingerende pipetpunt. Laad de oplossing gelijkmatig naar de punt, zonder bubbels. Steek vervolgens de hartinjectienaald in een pipethouder die aan een handmatige micromanipulator is bevestigd.Plaats de naald onder een stereomicroscoop zodat deze loodrecht op de AP-as van de verdoofde larve wordt uitgelijnd en onder een hoek van 30 graden naar beneden wijst. Sluit vervolgens de pipethouder aan op de drukinjector. Injecteer een bolus alfa bungarotoxine in de oplossing, om te testen of de naaldpunt duidelijk is.Als er geen rode kleur wordt gezien, schrapen zeer voorzichtig de naald tip tegen de rand van een pin, en probeer het opnieuw, totdat de naald duidelijk is. Ga vervolgens de naald naar het hart, totdat het de huid buiten het hart raakt. Druk de naald in de larve en zoek naar inkeping van de pigmentcel op de huid voor het hart om ervoor te zorgen dat de naald in het juiste vlak wordt geplaatst, ten opzichte van de larve.Ga vervolgens verder vooruit met de naald, totdat deze de huid doorboort en de hartholte binnengaat. Trek de naald iets naar achteren en injecteer een bolus alfa bungarotoxine in de hartholte. Kijk voor de inflatie van de hartholte, of voor rode kleurstof het invoeren van de holte.Spoel de larve voorzichtig drie keer af, met een milliliter neuronale buffer om de resterende MS222 te verwijderen. Verwijder nooit alle vloeistof. Houd larve in ongeveer 1 millileter van neuronale buffer in de perfusiekamer.In deze procedure backfill 10 microliter neronal buffer in een goed gebroken vloeistof-jet naald met behulp van een gel laden tip. Laad de oplossing gelijkmatig naar de punt zonder bubbels. Steek vervolgens de naald in de pipethouder die aan de gemotoriseerde micromanipulator is bevestigd.Plaats de perfusiekamer in een cirkelvormige kameradapter op het microscoopstadium. Verplaats het gemotoriseerde stadium zodat de larve zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Draai vervolgens de cirkelvormige kameradapter zodat de AP-toegang tot de larve ruwweg is afgestemd op de baan van de vloeistofstraalnaald.Met behulp van uitgezonden licht en differentiële interferentie contrast, breng de larve in focus en het centrum onder de 10x doelstelling. Verhoog vervolgens de 10x-doelstelling. Met behulp van de gemotoriseerde micromanipulator, breng de vloeistof-jet naald naar beneden in het midden van het gezichtsveld, zodat het wordt verlicht door het uitgezonden licht en nauwelijks aanraken van de neuronale buffer.Verlaag de 10x doelstelling om zich te concentreren op de larve om de locatie te bevestigen. Fuous het doel op de vloeistof-jet naald. Verplaats de vloeistof-straal naald met de micromanipulator in de x en y-as totdat deze zich in een positie bevindt die parallel loopt aan de rugzijde van de larve.Daarna, focus terug op de larve. Breng de naald naar beneden in de z-as en plaats de naald langs de rugzijde van de vis, 1 millimeter afstand van het lichaam. Beweeg de cirkelvormige kameradapter voorzichtig om ervoor te zorgen dat de vloeibare straalnaald langs de AP-middellijn van de larve wordt uitgelijnd.Schakel vervolgens over naar de 60x waterdoelstelling. Zorg ervoor dat het doel wordt emersed in de neuronale buffer. Gebruik de fijne focus om een neuromast te lokaliseren.Vervolgens verplaatsen van de gemomiseerde fase om de neuromast van belang in het centrum van het gezichtsveld te plaatsen. Houd de vloeibare straalnaalpunt langs de rugzijde van de vis. Raak de vloeistof-straalnaaldpunt niet aan de larve of het kameroppervlak aan.Plaats de vloeistof-straal naald met de micromanipulator, zodat het 100 micrometer van de buitenste rand van de neuromast. Dan, focus tot de uiteinden van de apical haar bundels. De bodem van de vloeistof-straal naald moet in focus in dit vliegtuig.Stel de hoge snelheidsdrukklem in van de handleiding naar de externe modus om input van de beeldsoftware te ontvangen. Nul de hoge snelheid drukklem door op de nulknop, en gebruik de set point knop om de rustdruk iets positief. Bevestig de rustoutput van de hoge snelheidsdrukklem met behulp van een PSI-manometer die aan de uitgang van het hoofdtrap is bevestigd.Om de druk te bepalen die nodig is om de haarbundels te stimuleren, past u een testprikkel toe met een uitgang van 0,125 en 0,25 volt voor 200-500 milliseconden. Meet voor elke testprikkel de afstand van afbuiging van de uiteinden van de haarbundels, de kinocilia. Kies een druk die de bundels beweegt een afstand van ongeveer 5 micrometer.Zorg ervoor dat de uiteinden van de kinocilia de hele tijd scherp blijven. Als u afbeeldingen met één vlak wilt verkrijgen, selecteert u een stimulans om te leveren tijdens de 80-frameverwerving, na frame 30, op 3 seconden. Om mechanosensitive calcium reacties te meten, focus op de basis van de apical haar bundels en start beeld verwerving.Om presynaptische calciumreacties te meten, focus je op de basis van de haarcellen en begin je met het verkrijgen van afbeeldingen. De stappen om de spatiotemporale veranderingen in de GCaMP6S-intensiteit te visualiseren, binnen een neuromast tijdens de simulatie, worden hier beschreven. De tijd wordt vertegenwoordigd van links naar rechts volgens de tijdstempel.De bovenste rij toont vijf van de veertien tijdelijke bakken uit een 70-frame GCaMP6S F-beeldreeks. In de tweede rij is de basislijn verwijderd uit elke in gerede opslag van GCaMP6S F binned om delta F-afbeeldingen te maken. In de derde rij zijn delta F-afbeeldingen omgezet van grijze schaal naar roodgloeiende opzoektafel.In de onderste rij is de derde rij overlayed op de F-afbeeldingen in de bovenste rij. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat de larve correct is vastgemaakt en om de juiste besturingselementen te gebruiken, zoals beschreven in het manuscript om bewegingsartefacten uit uw gegevens uit te sluiten. Werken met alfa bungarotoxine kan gevaarlijk zijn.Het is belangrijk om voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van handschoenen tijdens het hanteren ervan.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay als een associatief leermiddel voor cognitieve beoordeling bij leer- en geheugenstudies met behulp van volwassen zebravissen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...