Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von NIH/NIDCD intramuralen Forschung Mittel 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) unterstützt. Wir würden gerne Candy Wong für ihre Hilfe bei der Fidschi-Makro schreiben zu bestätigen. Wir möchten auch Danke Doris Wu und Candy Wong für ihre Anregungen mit dem Protokoll.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In-Vivo Bildgebung bei intakten Tieren ist grundsätzlich schwierig. Mehrere Schritte in dieser Methode sind entscheidend für die Erlangung zuverlässig in Vivo Calcium-Messungen von Seitenlinie Haarzellen. Zum Beispiel ist es sehr wichtig, dass die Larve angeheftet und richtig gelähmt vor imaging zu Bewegung während der Bildgebung zu minimieren. Überschüssige Bewegung während der Bildgebung kann führen zu Veränderungen im GCaMP6s Fluoreszenz, die keine wahren Signale und Veränderungen der Calciumspiegel nicht entsprechen (z.B. Figuren 4B1'-B1'' und 4 C 1' C1''). Tail-Pins können mehr anterior zu minimieren, Bewegung, obwohl dies mehr posterior Neuromasts unzugänglich machen kann platziert werden. Darüber hinaus kann nach Herz-Injektion, Kopfstifte gedreht werden, dass der horizontale Teil des Stiftes über das Eigelb liegt. Zusätzlich die Veränderung der Position der Pins, ist es auch möglich, eine Gehirn-Scheibe Harfe statt Nadeln verwenden, um Larven34zu immobilisieren. Wenn über die Larven richtig platziert, ist eine Harfe eine zusätzliche, möglicherweise weniger invasive Methode der Immobilisierung Larven. Während nennenswerte Bewegung dazu führen kann, von unzureichend anheften, kann Nichterfüllung richtig die Herz-Injektion für α-Bungarotoxin und Larven zu lähmen unvollständige Lähmung, Bewegung, führen und letztlich Bewegung Artefakte. Obwohl häufig verwendeten Anästhetika gezeigt worden, um die Erregbarkeit der Zebrafisch Haarzellen beeinflussen, hat den letzten Arbeit gezeigt, dass die Betäubungsmittel Benzocain viele Aspekte des Haar-Zell-Aktivität nicht stört. In ähnlicher Weise verwendete mehr häufig Anästhetikum, die MS-222 nur mit bestimmten Aspekten der Haarzelle Aktivität15eingreift. Daher, aufgrund der anspruchsvollen Art der α-Bungarotoxin Injektion, Benzocain oder MS-222 Anwendung erweisen sich eine nützliche alternative Methode der Lähmung, Bewegung in die Larve während der funktionalen Kalzium-Aufnahme zu verhindern.
Neben den technischen Herausforderungen in diesem Protokoll ist auch eine perfekt montierte Probe nutzlos, wenn die Larve und Haarzellen nicht gesund vor und während jeder imaging Experiment sind. Um sicherzustellen, dass die Larven und Haarzellen gesund sind, ist es wichtig, dass Larven in E3 Puffer verwaltet werden, die frei von Verschmutzungen wie Chorions (Eierschalen), Abfall und Mikroorganismen ist. Obwohl die oberflächliche Lage der Seitenlinie Haarzellen vorteilhaft für die Bildgebung ist, macht diese Lage sie anfälliger für zelluläre Schäden bei der E3-Puffer verschmutzt ist. Eine saubere, wässrige Umgebung ist besonders wichtig für junge Larven (2-4 Dpf) oder Mutanten, die eine aufrechte schwimmen können nicht behaupten, zu positionieren und vor allem liegen auf dem Boden der Petrischale. In diesen Situationen können Seitenlinie Haarzellen und schützende Cupula, die rund um die Bündel Haare leicht beschädigt werden. Auch beim Starten mit gesunden Larven und Haarzellen im Laufe jedes Experiment ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Larve Herzschlag und schnelle Durchblutung hat. Wenn der Blutfluss verlangsamt oder stoppt, kann die Gesundheit der Haarzellen beschädigt werden. In gefährdeten Vorbereitungen mit ungesunden Larven oder Verlust des Blutflusses, sterben Haarzellen identifiziert werden mehrere Möglichkeiten: Erstens durch das Auftreten von Karyopyknosis oder nuklearen Kondensation, was als eine Blase innerhalb der Zelle unter DIC Optik; Zweitens durch Schrumpfung der Zelle und das Vorhandensein von sich schnell bewegenden Partikel im Zytoplasma; und drittens, wenn Kinocilia Tipps in verschiedene Richtungen35, heraus spreizen. Wenn Haare Bündel gestört sind, die gespreizten Kinocilia bewegen sich nicht zusammenhängend zusammen während der Stimulation.
Dieses Präparat hat mehrere kleinere Einschränkungen, ein Wesen, dass die Vorbereitung bleibt nur für 1-3 Stunden nach seiner Gründung ist robust. Änderungen wie die Verwendung kleiner Stifte oder eine Gehirn-Scheibe Harfe, um Larven zu immobilisieren und Hinzufügen einer Perfusion System kann die Lebensdauer dieses Präparats in Vivo verlängern. Eine weitere Einschränkung ist, dass Immunofluoreszenz und Phototoxizität kann auftreten, nachdem bildgebende Studien wiederholt. Eine spannende Möglichkeit, diese Herausforderung zu meistern ist, dieses Protokoll für die Licht-Blatt Mikroskopie anzupassen. Licht-Blatt Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, aus Licht fokussieren, was zu weniger Immunofluoreszenz und Phototoxizität36zu reduzieren. Zusammen, helfe sanfter Immobilisierung und weniger Foto-Exposition jeder bildgebenden Sitzung zu verlängern. Mehr bildgebende Sitzungen können verwendet werden, um die gesamte Dauer der funktionalen Veränderungen begleiten die Entwicklung und den Prozessen zugrunde liegenden Haarzellen Clearance und Regeneration nach Verletzungen zu untersuchen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass neben Licht-Blatt-Mikroskopie, dieses Protokoll auf andere Arten konfokale Systeme (Punkt-Scan 2-Photonen und Spinnerei Disk) sowie relativ einfach Weitfeld Systeme28,34 angepasst werden kann . Alles in allem macht seine Vielseitigkeit ein wertvolles Werkzeug-Protokoll, das angepasst und mit mehreren bildgebenden Systemen verwendet werden können.
Während dieses Protokoll angepasst und mit vielen bildgebenden Systemen verwendet werden kann, können Teile dieses Protokolls auch angepasst und verwendet (1) mit anderen Indikatoren neben GCaMP6s und (2) Bild Tätigkeit in anderen Sinneszellen und Neuronen im Larvenstadium Zebrafisch. Z. B. in einer früheren Studie, wir dieses Protokoll zum Bild Aktivität mit mehrere genetisch codierte Indikatoren innerhalb des Seitenlinie Haarzellen zytosolischen Kalzium (RGECO1), Vesikel Fusion (SypHy), Membran-Spannung (Bongwoori) und Membran erkennen Kalzium (jRCaMP1a-Caax und GCaMP6s-Caax), und innerhalb der Seitenlinie afferenten Prozesse, Membran Kalzium (GCaMP6s-Caax)5zu erkennen. Basierend auf unserer Erfahrung im Umgang mit diesen Indikatoren, bietet die transgene Linie, die Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) in diesem Protokoll beschrieben einen hervorragenden Start für imaging-Aktivität in Seitenlinie Neuromasts. Alle oben aufgeführten Indikatoren haben wir festgestellt, dass GCaMP6s der sensibelsten und photostabil. Zusätzlich zu diesen Funktionen markieren wir die Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene Linie weil es verwendet werden kann, um zwei unterschiedliche Messungen vorzunehmen: Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Calcium innerhalb einer einzigen transgene Linie.
Die Technik, die in diesem Artikel beschriebenen zeigt wie Kalzium Bildgebung in der Zebrafisch Seitenlinie sein kann eine leistungsfähige Methode zur Funktionsweise von Haarzellen in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Dieser Ansatz ist komplementär zum Studium der Säugetiere, die in die Haarzellen in Ex Vivo Explantaten Funktion derzeit untersucht wird. Darüber hinaus kann das Zebrafisch-Modell weiterhin als Plattform verwendet werden, um die Wirksamkeit der genetisch codierten Indikatoren zu testen, die dann angewendet werden kann, um Aktivität in Säugetierzellen Haar zu untersuchen.

Funktionale Kalzium Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Aktivität von vielen überwachen gleichzeitig1Zellen. Insbesondere Kalzium Bildgebung mittels genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) nachweislich vorteilhaft sein, weil GECIs können, in bestimmten Zelltypen ausgedrückt werden und subcellularly2 lokalisiert. In der neurowissenschaftlichen Forschung haben diese Eigenschaften gemacht Kalzium Bildgebung mit GECIs eine leistungsfähige Methode, um sowohl Aktivitätsmuster innerhalb neuronaler Netzwerke definieren und Messen Kalzium Zustrom an einzelne Synapsen3,4. Unter Ausnutzung dieser Funktionen, eine aktuelle Studie konfokalen Mikroskopie und GECIs zur subzellulären Aktivität in Sammlungen von sensorischen Haarzellen5Überwachung eingesetzt.
Haarzellen sind Mechanorezeptoren, die Ton- und vestibuläre Reize im Innenohr und lokalen Wasserbewegung zu, in der Seitenlinie System in aquatischen Vetebrates6,7 erkennen. Haarzellen sind häufig das Ziel von Schäden oder genetische Mutationen, die die häufigste Form des Verlusts der Hörfähigkeit in den Menschen bekannt als Anhörung sensorineuralem Verlust8,9führen. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie diese Zellen-Funktion um zu verstehen wie die Behandlung und Prävention von Hörverlust. Um richtig zu funktionieren, nutzen die Haarzellen zwei spezialisierte Strukturen, so genannte Mechanosensory-Haar-Bundles und synaptischen Bändern zu erkennen und zu reizen, bzw. zu übertragen. Haar-Bundles befinden sich an der Spitze der Haarzellen und bestehen hauptsächlich aus feinen, haarähnlichen Vorsprünge, bekannt als Stereocilia (Abb. 1A). Im vestibulären und Seitenlinie Haarzellen hat jedes Haarbündel auch eine einzelne lange Kinocilium (die Zelle einzig wahre Zilie), die weit über die Stereocilia (Abb. 1A) verlängern kann. Mechanosensory Reize abzulenken Haare bündeln, und Ablenkung legt Spannung auf Verbindungen genannt "Tipp-Links", die Stereocilia10miteinander zu verbinden. Diese Spannung öffnet Mechanotransduktion (MET) Kanäle befindet sich in der Stereocilia, wodurch eine apikale Zustrom von kationen, darunter Kalzium11,12. Diese apikale Aktivität letztlich erschüttert die Haarzellen und Spannung-gated Calciumkanäle (CaV1.3) an der Basis der Zelle öffnet. CaV1.3 Kanäle werden angrenzend an synaptischen Bändern, einer präsynaptischen Struktur gefunden, die Vesikel an aktiven Zonen begrenzt. Basalen Kalzium Zustrom durch CaV1.3 Kanäle ist erforderlich für Vesicle Fusion, Neurotransmission und Aktivierung der afferenten Neuronen13,14.
Seit vielen Jahren elektrophysiologische Techniken wie die gesamte Zelle Patch spannen wurden verwendet, um die funktionellen Eigenschaften der Haarzellen in vielen Arten, darunter Zebrafisch15,16,17, Sonde 18,19,20. Diese elektrophysiologischen Aufnahmen wurden besonders wertvoll im Bereich hören und Gleichgewicht, weil sie verwendet werden können, zu extrem empfindliche Messungen aus einzelnen Sinneszellen, deren Zweck es ist, extrem schnelle Reize über kodieren ein breites Spektrum an Frequenzen und Intensitäten21,22. Leider messen nicht ganz-Zell-Aufnahmen die Aktivität der Bevölkerung von Haarzellen. Um die Aktivität der Bevölkerungen der Zellen in der Zebrafisch Seitenlinie zu untersuchen, wurden Mikrofonie Potenziale und afferenten Aktionspotentiale zur Messung der summierten Mechanosensitive und postsynaptischen Antworteigenschaften der einzelnen Neuromasts23 ,24. Leider haben weder ganze Zelle Aufnahmen noch lokales Feld möglicher Messungen die räumliche Auflösung zu lokalisieren, wo Tätigkeit vollzieht sich in den einzelnen Zellen oder die Aktivität der einzelnen Zellen innerhalb einer Population zu messen. Vor kurzem haben Kalzium Farbstoffe und GECIs eingesetzt worden, um diesen Herausforderungen25,26zu umgehen.
Im Zebrafisch erwiesen GECIs sich ein leistungsfähiger Ansatz zu prüfen, Haar-Zellfunktion aufgrund der relativen Leichtigkeit der transgenen Zebrafisch und die optische Klarheit der Larven27zu schaffen. Im Zebrafischlarven sind Haarzellen im Innenohr sowie die Seitenlinie System vorhanden. Die Seitenlinie ist bestehend aus Rosette-wie Cluster von Haarzellen genannt Neuromasts, die verwendet werden, um lokale Änderungen in Bewegung des Wassers (Abbildung 1) zu erkennen. Die Seitenlinie ist besonders nützlich, weil es nach außen entlang der Oberfläche des Fisches befindet. Dieser Zugang hat es ermöglicht, zu stimulieren Haarzellen und Kalziumsignale optisch in intakten Larven zu messen. Insgesamt, die Leichtigkeit der Transgenese, Transparenz der Larven und der beispiellosen Zugang der Seitenlinie Haarzellen haben Zebrafisch eine unschätzbare Modell, die Aktivität der Haarzellen in vivo zu studieren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil im Vergleich zu Säugetieren Systemen in die knöchernen Strukturen des Innenohrs Haarzellen umgeben sind. Dieser Mangel an Zugang machte es sehr schwierig, in-vivo Funktionsmessungen von Säugerzellen Haar zu erwerben.
Das Protokoll hier skizzierten beschreibt das MET Kanal und Presynapse-abhängige Änderungen an Kalzium in einzelnen Haarzellen und zwischen den Zellen in Neuromasts im Larvenstadium Zebrafisch zu überwachen. Dieses Protokoll nutzt eine etablierten transgenen Zebrafisch-Linie, die eine Membran lokalisiert GCaMP6s unter der Kontrolle der Haarzelle spezifischen myosin6b Promotor28drückt. Diese Membran Lokalisierung Positionen GCaMP6s um Kalzium Zustrom durch Ionenkanäle befindet sich in der Plasmamembran zu erkennen, die für Haar-Zellfunktion wichtig sind. Beispielsweise erkennt Membran lokalisiert GCaMP6s Kalzium Zustrom durch MET Kanälen in apikalen Haare bündeln und durch CaV1,3 in der Nähe von synaptischen Bändern an der Basis der Zelle. Im Gegensatz dazu mit GECIs in das Zytosol lokalisiert wie cytosolischen GECIs Kalziumsignale erkennen, die eine Kombination von MET und CaV1.3 Kanal Aktivität sowie Kalzium Beiträge aus anderen Quellen (z. B., Speicher freizugeben). Dieses Protokoll wird beschrieben, wie immobilisieren und GCaMP6s transgenen Larven vor Bildgebung zu lähmen. Es beschreibt dann vorbereiten und einen Fluid-Jet verwenden, um die Haare-Bündel zur Seitenlinie Haarzellen in einer kontrollierten und reproduzierbaren Weise stimulieren abzuwenden. Repräsentative Daten, die mithilfe dieses Protokolls erreicht werden kann, werden vorgestellt. Beispiele für Daten, die Bewegungsartefakte darstellen werden ebenfalls vorgestellt. Experimente, die verwendet werden, um Ergebnisse zu überprüfen und auszuschließen Artefakte werden beschrieben. Zu guter Letzt bezeichnet man eine Methode, um räumliche Kalziumsignale in der Fidschi-Software zu visualisieren. Diese Fidschi-Analyse ist von vorher festgelegten Visualisierungsmethoden entwickelt mit MATLAB5angepasst. Dieses Protokoll beschreibt insgesamt eine starke Vorbereitung Technik, die verwendet GECIs im Larvenstadium Zebrafisch zu messen und visualisieren Haarzelle Kalzium Dynamik in-vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensorische Haarzellen sind Mechanorezeptoren gefunden im Innenohr, die für das hören und Gleichgewicht erforderlich sind. Haarzellen sind als Reaktion auf sensorische Reize aktiviert, die mechanisch apikalen Vorsprünge genannt Haar Bündel abzulenken. Durchbiegung öffnet Mechanotransduktion (MET) Kanäle in Haar bündeln, führt zu einem Zustrom von kationen, einschließlich Kalzium. Dieser Zustrom kation erschüttert die Zelle und öffnet Voltage-gated Calciumkanäle basal an der Haarzelle Presynapse gelegen. Bei Säugetieren Haarzellen sind eingehüllt in Knochen, und es ist schwierig, um diese Tätigkeiten in-vivo funktionell zu beurteilen. Im Gegensatz dazu Larven Zebrafisch sind transparent und besitzen eine extern befindet sich Seitenlinienorgan, die Haarzellen enthält. Diese Haarzellen sind funktionell und strukturell ähnlich wie Haare Säugerzellen und können funktionell in-vivo bewertet werden. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die einen genetisch codierte Kalzium-Indikator (GECI) nutzt, Signale GCaMP6s Reiz-evozierten Kalzium Messen in Zebrafisch-Seitenlinie Haarzellen. GCaMP6s kann verwendet werden zusammen mit confocal imaging, in-vivo Calcium-Signale an der Spitze und Basis der Seitenlinie Haarzellen messen. Diese Signale liefern eine in Echtzeit, quantifizierbare Auslesen der beiden Mechanosensation und Presynapse-abhängige Kalzium Tätigkeiten innerhalb diese Haarzellen. Diese Kalziumsignale bieten auch wichtige funktionelle Informationen über wie Haarzellen erkennen und sensorische Reize zu übertragen. Insgesamt erzeugt diese Technik nützliche Daten über relative Änderungen in Kalzium Aktivität in-vivo. Es eignet sich weniger für die Quantifizierung der Absolutwert des Kalzium-Änderungen. Diese in-vivo Technik reagiert empfindlich auf Bewegungsartefakte. Eine angemessene Menge an Übung und Geschick sind erforderlich für die richtige Positionierung, Immobilisierung und Stimulation der Larven. Letztlich, wenn richtig ausgeführt, das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen bietet eine leistungsfähige Methode, wertvolle Informationen über die Aktivität der Haarzellen in ihre natürliche, voll integrierten Bundesstaaten ein lebendes Tier zu sammeln.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Der Zebrabärbling ist ein Modell, das hat viele wertvolle Eigenschaften einschließlich optischen Klarheit, schnelle externe Entwicklung und von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der Gehör und Gleichgewicht befindet sich extern sensorischen Haarzellen. Dieser Artikel beschreibt wie transgene Zebrafisch Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Funktion in toto assay genutzt werden.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen im Bereich des Hörens und der Ausgewogenheit zu beantworten. Es beschreibt, wie man zwei wichtige Aspekte der sensorischen Haarzellen Funktion zu erkennen, mechanotransduktion und präsynaptische Aktivität. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie es uns ermöglicht, die Funktion von Haarzellen in einem lebenden Tier zu visualisieren und zu untersuchen, wie Sammlungen von Haarzellen sensorische Informationen erkennen und übertragen.Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie feine Zangen und Wolframdraht, um die Stifte zu gestalten, um die Larve durch den Kopf und Schwanz zu immobilisieren, auf dem gehärteten Verkapselung. Um Kopfstifte zu machen, halten Sie ein Stück 0,035 Millimeter Wolframdraht in einer Hand. Mit feinen Zangen in der anderen Hand, biegen Sie den Draht einen Millimeter vom Ende, bei 90 Grad.Tauschen Sie die Zange gegen eine feine Schere aus, und schneiden Sie einen Millimeter nach der Biegung, um den Stift zu erstellen. Verwenden Sie dann Zangen, um die Stifte in die gehärtete Kapselung auf der Kammer einzufügen. Positionieren Sie die Larve in der Mitte der Perfusionskammer so, dass sie seitlich gegenüber dem Silikonverkapselungsmittel flach liegt.Mit feinen Zangen, bringen Sie die 0,035 Millimeter Kopf pin senkrecht zur Larve. Setzen Sie den Kopfstift zwischen das Auge und das otische Vesikel und nach unten in das Verkapselungsmittel. Verwenden Sie einen zweiten Satz Zangen, um die Larve entlang ihrer dorsalen und ventralen Seite zu stabilisieren, während Sie anheften.Stellen Sie sicher, dass der horizontale Teil des Stifts die Larve kontaktiert und nicht ganz in das Verkapselungsmittel drückt. Winkeln Sie den Stift ventral oder leicht in Richtung des vorderen Derva, um zu vermeiden, dass die nachfolgende Herzinjektion und Haarzellenbildgebung stören. Mit den Zangen einen 0,025 Millimeter langen Schwanzstift in den Notochord einstecken, so nah wie möglich am Ende des Schwanzes.Um Alpha-Bungarotoxin in die Larve zu injizieren, füllen Sie drei Mikroliter der Lösung in die Injektionsnadel, indem Sie eine Gel-Ladepipettenspitze verwenden. Laden Sie die Lösung gleichmäßig auf die Spitze, ohne Blasen. Dann setzen Sie die Herzinjektionsnadel in einen Pipettenhalter, der an einem manuellen Mikromanipulator befestigt ist.Positionieren Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop so, dass sie senkrecht zur AP-Achse der anästhesierten Larve ausgerichtet ist und in einem Winkel von 30 Grad nach unten zeigt. Schließen Sie als Nächstes den Pipettenhalter an den Druckinjektor an. Injizieren Sie einen Bolus alpha Bungarotoxin in die Lösung, um zu testen, ob die Nadelspitze klar ist.Wenn keine rote Farbe zu sehen ist, kratzen Sie sehr sanft die Nadelspitze gegen den Rand eines Stifts, und versuchen Sie es erneut, bis die Nadel klar ist. Anschließend, bewegen Sie die Nadel in Richtung des Herzens, bis es die Haut außerhalb des Herzens berührt. Drücken Sie die Nadel in die Larve, und suchen Sie nach Einbuchtung der Pigmentzelle auf der Haut vor dem Herzen, um sicherzustellen, dass die Nadel in der richtigen Ebene positioniert ist, relativ zur Larve.Dann rücken Sie die Nadel weiter voran, bis sie die Haut durchbohrt und in die Herzhöhle gelangt. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück und injizieren Sie einen Bolus alpha Bungarotoxin in die Herzhöhle. Achten Sie auf die Inflation der Herzhöhle oder auf roten Farbstoff, der in die Höhle eintritt.Spülen Sie die Larve dreimal vorsichtig ab, mit einem Milliliter neuronalen Puffer, um den Rest MS222 zu entfernen. Entfernen Sie niemals die gesamte Flüssigkeit. Larven in ca. 1 Millileter neuronalen Puffer in der Perfusionskammer aufbewahren.In diesem Verfahren vertueren Sie 10 Mikroliter Neronalpuffer in eine ordnungsgemäß gebrochene Fluid-Jet-Nadel mit einer Gel-Ladespitze. Laden Sie die Lösung gleichmäßig auf die Spitze ohne Blasen. Stecken Sie dann die Nadel in den Pipettenhalter, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist.Legen Sie die Perfusionskammer in einen kreisförmigen Kammeradapter auf der Mikroskopstufe. Bewegen Sie die motorisierte Stufe so, dass sich die Larve in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Anschließend drehen Sie den kreisförmigen Kammeradapter so, dass der AP-Zugang zur Larve grob an der Flugbahn der Fluid-Jet-Nadel ausgerichtet ist.Mit Durchlicht und Differentialinterferenzkontrast, bringen Sie die Larve in den Fokus und zentrieren Sie sie unter dem 10-fachen Objektiv. Heben Sie dann das 10-fache Ziel an. Mit dem motorisierten Mikromanipulator bringen Sie die Fluid-Jet-Nadel in die Mitte des Sichtfeldes, so dass sie durch das übertragene Licht beleuchtet wird und den neuronalen Puffer kaum berührt.Senken Sie das 10x Ziel, sich auf die Larve zu konzentrieren, um ihre Lage zu bestätigen. Das Ziel auf der Fluid-Jet-Nadel. Bewegen Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator in der x- und y-Achse, bis sie sich in einer Position parallel zur dorsalen Seite der Larve befindet.Danach konzentrieren Sie sich wieder auf die Larve. Bringen Sie die Nadel in der Z-Achse nach unten und positionieren Sie die Nadel entlang der Rückenseite des Fisches, 1 Millimeter vom Körper entfernt. Bewegen Sie den kreisförmigen Kammeradapter vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Fluidstrahlnadel entlang der AP-Mittellinie der Larve ausgerichtet ist.Wechseln Sie als Nächstes zum 60x Wasserobjektiv. Stellen Sie sicher, dass das Ziel im neuronalen Puffer emersiert wird. Verwenden Sie den feinen Fokus, um einen Neuromast zu lokalisieren.Anschließend bewegen Sie die motarisierte Bühne, um den Neuromast von Interesse in der Mitte des Sichtfeldes zu platzieren. Halten Sie die Flüssigkeitsstrahlnadelspitze entlang der rückenden Seite des Fisches. Berühren Sie die Fluid-Jet-Nadelspitze nicht an der Larve oder der Kammeroberfläche.Positionieren Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator so, dass sie 100 Mikrometer vom äußeren Rand des Neuromastes entfernt ist. Konzentrieren Sie sich dann auf die Spitzen der apikalen Haarbündel. Der Boden der Fluid-Jet-Nadel sollte in dieser Ebene im Fokus stehen.Stellen Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme vom manuellen in den externen Modus ein, um ein Eingaben von der Bildverarbeitungssoftware zu erhalten. Null die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme durch Drücken der Nulltaste, und verwenden Sie den Sollwertknopf, um den Ruhedruck leicht positiv einzustellen. Bestätigen Sie den Ruheausgang der Hochgeschwindigkeits-Druckklemme mit einem PSI-Manometer, das an der Kopfstufenausgabe befestigt ist.Um den Druck zu bestimmen, der erforderlich ist, um die Haarbündel zu stimulieren, wenden Sie einen Testreiz mit einem 0,125 und 0,25 Volt Ausgang für 200-500 Millisekunden an. Für jeden Testreiz messen Sie den Abstand der Durchbiegung der Spitzen der Haarbündel, der Kinocilia. Wählen Sie einen Druck, der die Bündel in einem Abstand von etwa 5 Mikrometern bewegt.Stellen Sie sicher, dass die Tipps der Kinocilia die ganze Zeit im Fokus bleiben. Um Einzelebenenbilder zu erfassen, wählen Sie einen Stimulus aus, der während der 80-Frame-Erfassung nach Frame 30 in 3 Sekunden geliefert werden soll. Um mechanosensitive Kalziumreaktionen zu messen, konzentrieren Sie sich auf die Basis der apikalen Haarbündel und starten Sie die Bildaufnahme.Um präsynaptische Kalziumreaktionen zu messen, konzentrieren Sie sich auf die Basis der Haarzellen und starten Sie die Bildaufnahme. Die Schritte zur Visualisierung der räumlich-zeitlichen Veränderungen der GCaMP6S-Intensität innerhalb eines Neuromasts während der Simulation werden hier beschrieben. Die Zeit wird von links nach rechts entsprechend dem Zeitstempel dargestellt.Die obere Zeile zeigt fünf der vierzehn zeitlichen Abschnitte aus einer 70-Frame-GCaMP6S F-Bildsequenz. In der zweiten Zeile wurde die Baseline aus jedem GCaMP6S F-Binned-Bild entfernt, um Delta-F-Bilder zu erstellen. In der dritten Zeile wurden Delta-F-Bilder von Graustufen in eine rote Hot-Lookup-Tabelle konvertiert.In der unteren Zeile wurde die dritte Zeile auf die F-Bilder in der oberen Zeile überlagert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sicherzustellen, dass die Larve korrekt angeheftet ist, und geeignete Kontrollen zu verwenden, wie im Manuskript beschrieben, um Bewegungsartefakte aus Ihren Daten auszuschließen. Die Arbeit mit Alpha-Bungarotoxin kann gefährlich sein.Es ist wichtig, Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wie das Tragen von Handschuhen während der Handhabung.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay als assoziatives Lernwerkzeug zur kognitiven Beurteilung in Lern- und Gedächtnisstudien mit erwachsenen Zebrafischen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...