Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

この作品は、NIH/NIDCD 学内研究資金 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) によって支えられました。フィジー マクロを記述で彼女の援助のキャンディ ウォンを認識したいと思います。プロトコルとその有用な提案のドリス ・呉とキャンディ ・ ウォンに感謝したいと思いますも。

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そのまま動物の生体内イメージングは本質的に困難です。この方法のいくつかの手順は、信頼性の高い体内側線有毛細胞からのカルシウム測定値を得る重要なです。たとえば、幼虫を固定するか、イメージング画像中の動きを最小限にする前に適切に麻痺して、非常に重要です。真の信号ではなく、カルシウム レベルの変化に対応していない GCaMP6s 蛍光イメージング中に過剰な運動できます変更につながる (例えば、数字・ 4b1 型 '-B1'と4 C 1' C1 ')。これより後方のオイカワにアクセスできなく可能性があります、動きを最小限に抑えるために、前方から詳細尾ピンを配置できます。さらに、心臓注入後ピンを回転ピンの水平部分の向こう、卵黄、できます。ピンの位置の変更、に加えてそれはまた幼虫34を固定するピンの代わりに脳スライスのハープを使用することが可能。幼虫を適切に配置するハープが追加、潜在的に幼虫を固定の侵襲的な方法以下です。重要な動きは不十分な固定から発生する可能性、α-ブンガロトキシン部位を提供し幼虫を麻痺させる心注入を正しく実行する失敗が不完全な麻痺、運動で起因し、最終的に成果物を運動します。ゼブラフィッシュの有毛細胞の興奮性に影響を与える一般的に使用される麻酔薬が示されているが、最近の仕事は麻酔ベンゾカインが有毛細胞の活動の多くの側面に干渉しないを示しています。同様に、よく使われる麻酔薬 MS 222 有毛細胞活動15の特定の側面と干渉します。したがって、α-ブンガロトキシン部位注入の挑戦的な性質のためベンゾカインまたは MS 222 アプリケーションになるかもしれない機能カルシウム イメージング中に幼虫の動きを防ぐために麻痺の有用な代替方法です。
このプロトコルに関連する技術的な課題に加えても完全にマウントされたサンプルは幼虫と有毛細胞は、前に、各イメージング実験中に健康ではない場合は無意味です。幼虫と有毛細胞が正常であることを確認、絨毛 (卵の殻)、廃棄物、微生物などの破片の自由である E3 バッファーの幼虫が維持されていることが重要です。横ラインの有毛細胞の表面的な位置はイメージングのため有利であるが、この場所それらが細胞の損傷を受けやすい場合 E3 バッファーをファウルします。きれいな水環境が若齢幼虫 (2-4 dpf) にとって特に重要なまたは直立したスイミングを維持できない変異体を置き、主にペトリ皿の底に横たわる。これらの状況で、横ラインの有毛細胞と髪束を囲む保護クプラ簡単に妥協になることができます。健康的な幼虫と各実験の過程での有毛細胞で始まる場合でも、幼虫がハートビートおよび急速な血流であることを確認する重要です。血流が低下または停止する有毛細胞の健康が危険にさらさなっています。不健康な幼虫や血流の損失を含む妥協の準備、有毛細胞を死を識別するいくつかの方法: まず、病変が拡がったまたは DIC 光学素子の下のセル内のバブルとして現れる核凝縮の出現によって第二に、セルの縮小と高速移動; 細胞質内粒子の存在でそして第三に、kinocilia のヒントが異なる方向35で腰掛けるとき。、毛束が中断されたとき、スプレイ kinocilia が刺激の中にまとめて一緒に移動しません。
この準備は、1 つは、準備だけが堅調が確立された後の 1-3 時間のいくつかのマイナーな制限をしています。幼虫を動けなくハープの小さいピンまたは脳スライスを使用してなどの変更とこの体内準備の有効期限の延長が灌流システムを追加します。別の制限は、退色、光毒性は、イメージング試験を繰り返した後に発生する可能性が。このような課題を克服するために 1 つのエキサイティングな方法は、光シート顕微鏡のこのプロトコルを適応することです。光シート顕微鏡は、36以下の退色、光毒性につながる焦点光を軽減する強力な方法です。一緒に、穏やかな固定化と以下の写真の露出を助けるかもしれない各撮像セッションを延長します。もはやイメージング セッションを使用して、開発および基本的な有毛細胞のクリアランスと損傷後の再生プロセスに伴う機能変化の全期間を確認できます。それは、光シート顕微鏡に加えてこのプロトコルに適合できる他型共焦点システム (ポイントのスキャン、2 光子とスピニング ディスク) だけでなく、比較的簡単な広視野システム28,34 を指摘することが重要.全体的にみて、その多様性は、このプロトコルの適応および複数の撮像システムで使用できる貴重なツールになります。
このプロトコルの適応および多くのイメージング システムを使用できますが、このプロトコルの部分も適応し、(1) GCaMP6s のほか、(2) 他の感覚的な細胞およびゼブラフィッシュ稚魚内のニューロンのイメージ活動に、他のインジケーターと共に使用できます。たとえば、以前の研究では、膜、膜電位 (Bongwoori)、小胞の融合 (SypHy) ゾル性細胞質カルシウム (RGECO1) を検出する側線有毛細胞内複数の遺伝的コード化の指標を使用してイメージの活動にこのプロトコルが使用(jRCaMP1a ・ カァシュと GCaMP6s ・ カァシュ) カルシウムと膜カルシウム (GCaMP6s ・ カァシュ)5を検出する側線求心性プロセス内で。これらの指標を使用して我々 の経験に基づいて、Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) はこのプロトコルで記述されている形質転換線は側線オイカワのイメージングのための素晴らしいスタートをご利用いただけます。すべての指標は、上記の我々 は GCaMP6s が最も敏感なあることを発見しました。2 つの測定値に使用できるため、これらの機能に加えて、我々 は Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) トランスジェニック行を強調表示: 有毛細胞の形づくりとトランスジェニック一行内のシナプス前のカルシウム。
この資料に記載されているテクニックは、ゼブラフィッシュの側線でカルシウム イメージングがネイティブな環境で有毛細胞がどの機能を研究する強力な方法をすることができますどのようにについて説明します。このアプローチは、有毛細胞の機能がex vivo植で勉強現在の哺乳類の研究を補完するものです。さらに、ゼブラフィッシュ モデルは哺乳類の有毛細胞の活動を調べるに適用することができます遺伝的コード化の指標の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用する続行できます。

機能カルシウム イメージングは、多くの活動を監視するための強力なツール細胞同時に1です。特に、遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) を用いたカルシウム イメージング GECIs が特定の細胞型で表現できる、ローカライズ subcellularly2ので有利である示されています。神経科学研究では、これらの機能したカルシウム イメージング GECIs 両方神経回路網内の活動のパターンを定義し、個々 のシナプス3,4カルシウム流入を測定する強力な方法。これらの機能を活かし、最近の研究は感覚毛の細胞5のコレクション内で細胞の活動を監視する共焦点顕微鏡と GECIs が使用されます。
有毛細胞は、内耳とローカル水の動きで水生 vetebrates6、7の横ライン システムでサウンドと前庭刺激を検出するメカノレセプターです。有毛細胞の損傷や感音性難聴の損失8,9として知られている人間の難聴の最も一般的な形式は、遺伝子の突然変異のターゲットが多い。したがって、治療や難聴を予防する方法を理解するためにどのようにこれらの細胞の機能を理解する重要です。正しく機能するには、有毛細胞利用機械刺激受容髪束と検出し、それぞれの刺激を伝達するシナプス リボンと呼ばれる 2 つの特殊な構造です。髪束は有毛細胞の頂点にあり、不動 (図 1A) として知られている、毛のような突起から主に成っています。前庭と横ラインの有毛細胞の各毛束があります、単一長い運動毛 (セルの唯一の真の繊毛)、不動 (図 1A) 上記まで拡張することができます。機械刺激受容刺激髪束をそらすため、たわみが連携「先端リンク「不動10を相互接続すると呼ばれる緊張を置きます。この緊張感は、陽イオン、カルシウム11,12を含む腔流入の結果、不動である明らかでない (MET) チャンネルを開けます。この根尖部の活動は最終的に有毛細胞を脱分極し、電位依存性カルシウム チャネル (Cav1.3) セルの基地でを開きます。Cav1.3 チャネルがシナプス リボン、テザーにアクティブなゾーンで小胞シナプス構造に隣接してあります。Cav1.3 チャネルを介して基底のカルシウム流入は求心性ニューロン13,14の活性化、神経伝達、小胞融合に必要です。
長年にわたり全細胞パッチクなどの電気生理学的手法は、ゼブラフィッシュ15,16,17,を含む多くの種の有毛細胞の機能特性をプローブに使用されている18,,1920。これらの電気生理学的記録は聴力と平衡感覚のフィールドで特に貴重なされている上非常に高速の刺激をエンコードすることを目的、個々 の感覚的な細胞から非常に敏感な測定値を得ることができるため、周波数と強度21,22の広い範囲。残念ながら、全セルの録音は、有毛細胞の集団の活動を測定できません。ゼブラフィッシュの側線で細胞の集団の活動を研究するには、スペクトラムの電位と求心性活動電位を合計機械受容と個々 のオイカワ23 のシナプス応答特性を測定する使用されています。 ,24。残念ながら、全セルの録音もローカル フィールド電位測定は、特定活動が個々 の細胞内で発生する、または、人口内の各セルの活性を測定する空間解像度を持っています。最近では、カルシウム染料と GECIs これら課題25,26をバイパスするために採用されています。
ゼブラフィッシュ GECIs トランスジェニックゼブラフィッシュと幼虫27の光学的透明度を作成する相対的な容易さのための有毛細胞の機能を検査する強力なアプローチであると証明しました。ゼブラフィッシュ幼虫で横ライン システムと同様に、内耳の有毛細胞があります。側線はロゼットのようなクラスターの有毛細胞の水の動き (図 1) のローカルの変更を検出するために使用、オイカワと呼ばれる成っています。側線は魚の表面に沿って外部にあるため便利です。このアクセスは、有毛細胞を刺激し、そのまま幼虫における光学的カルシウム信号を計測可能になりました。全体的に、遺伝子導入、幼虫の透明性と横ラインの有毛細胞の比類のないアクセスの容易さが有毛細胞の生体内での活動を研究する非常に貴重なモデル ゼブラフィッシュを作った。これは、有毛細胞が内耳の骨構造に囲まれている哺乳類のシステムと比較して重要な利点です。アクセスのこの欠乏は、哺乳類の有毛細胞の機能の in vivo 測定を取得する非常に困難になっています。
ここで説明したプロトコルでは、MET ゼブラフィッシュ稚魚におけるオイカワ内のセルの間で個々 の有毛細胞内のカルシウム チャネル、シナプス依存変化を監視する方法について説明します。このプロトコルは、有毛細胞の特定のmyosin6bプロモーター28の制御の下で膜のローカライズされた GCaMP6s を表す確立したトランスジェニックゼブラフィッシュ線を利用しています。この膜のローカリゼーションは、有毛細胞機能にとって重要な細胞膜にあるイオン チャネルを介してカルシウム流入を検出する GCaMP6s を配置します。たとえば、GCaMP6s の膜局在がカルシウムを検出できます MET を通じて流入チャンネル頂髪束および CaVセルの基地でのシナプス リボン近く 1.3 チャンネル。これは細胞質に局在 GECIs を使用してゾル性細胞質 GECIs が他のソースからのカルシウムの貢献と同様、MET と Ca のV1.3 チャネル活動の組み合わせをしているカルシウム信号を検出と対照的 (例えば、ストアのリリース)。このプロトコルでは、固定し、イメージ作成前 GCaMP6s トランスジェニック幼虫を麻痺させる方法について説明します。その後、準備および制御で再現可能な方法で横ラインの有毛細胞を刺激するために髪の束をそらすために流体ジェットを使用する方法について説明します。このプロトコルを使用して達成することができる代表的なデータが掲載されています。運動の成果物を表すデータの紹介も。結果を確認し、成果物を除外する使用される制御実験を説明しています。最後に、フィジー ソフトウェアにおける空間カルシウム シグナルを可視化する方法を説明します。このフィジーの解析が MATLAB5を使用して以前に確立された可視化手法から適応です。全体的に、このプロトコルは、ゼブラフィッシュ稚魚の GECIs を使用して計測し、生体内の有毛細胞のカルシウム動態を可視化する強力な手法を説明します。

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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

有毛細胞の感覚は、内耳の聴力と平衡感覚に必要な受容です。有毛細胞は、機械的に髪束と呼ばれる根尖部の突起をそらす感覚刺激への応答でアクティブ化されます。たわみは、カルシウムを含む陽イオンの流入につながる髪束のメカノトランスダクション (MET) チャンネルを開けます。この陽イオンの流入はセルを脱分極し、有毛細胞のシナプスにおいて基肥に位置する電位依存性カルシウム チャネルを開きます。哺乳類で、有毛細胞、骨に収められて、機能的に生体内でこれらの活動を評価するために困難です。対照的に、ゼブラフィッシュ稚魚は透過的であり、有毛細胞を含む外部に配置されて - 側線器官を所有しています。これらの有毛細胞は哺乳類の有毛細胞に機能的、構造的に類似しているし、機能的生体内で評価することができます。ゼブラフィッシュ側線有毛細胞の信号刺激誘発カルシウムを測定する GCaMP6s の遺伝的コード化カルシウム インジケーター (GECI) を利用する方法を説明します。GCaMP6s 使用できます、共焦点イメージングと一緒に頂点で横ラインの有毛細胞の生体内でのカルシウム信号を測定します。これらの信号は、これらの有毛細胞内カルシウム活動を長らく謎とシナプスに依存両方リアルタイムで定量化可能な読み出しを提供します。これらのカルシウム信号も有毛細胞を検出し、感覚的な刺激を送信する方法に関する重要な機能情報を提供します。この手法がカルシウム活動の相対的変化について有用なデータを生成します全体的に、生体内で。カルシウム変化の絶対的な大きさの定量化はあまり適してです。この生体内の技法は、体動に敏感です。適度な練習と能力が必要適切な位置、固定、および幼虫の刺激です。最終的には、正しく実行されると、この資料で説明されているプロトコルは生きている動物内の自然な完全に統合された状態で有毛細胞の活動に関する貴重な情報を収集するために強力な方法を提供します。

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In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ トトで有毛細胞の形づくりとシナプス前機能の両方を試金するため使用することができます。

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

この方法は、聴覚とバランスの分野での基本的な質問に答えることができます。それは、感覚性毛細胞機能の2つの重要な側面、メカノトランスダクションおよびシナプス前活性を検出する方法を説明する。この技術の主な利点は、生きている動物の毛細胞の機能を可視化し、毛細胞のコレクションが感覚情報を検出して送信する方法を研究できることです。この手順を開始するには、細かい鉗子とタングステンワイヤーを使用して、硬化したカプセル化剤に、頭と尾を通して幼虫を固定するために使用されるピンをファッション化します。ヘッドピンを作るためには、0.035ミリメートルタングステン線を片手に持ちます。もう一方の手で細かい鉗子を使用して、90度で端から1ミリメートル上にワイヤーを曲げます。鉗子を細かいはさみと交換し、曲がった1ミリメートル後に切断してピンを作成します。次に、鉗子を使用して、チャンバーの硬化カプセル化にピンを挿入します。幼虫を灌流チャンバの中央に置き、シリコーンカプセル化剤に対して横に平らに置きます。細かい鉗子を使用して、0.035ミリメートルのヘッドピンを幼虫に垂直に下ろします。眼と大蓋小胞の間にヘッドピンを挿入し、カプセル剤の中に下に挿入します。2番目の鉗子を使用して、後部および腹側に沿って幼虫を安定させ、ピン留めします。ピンの水平部分が幼虫に接触し、カプセル剤にずっと押し込まないようにしてください。後の心臓注入および毛髪細胞イメージングを妨げないように、ピンを腹腹腔内に角度付けしたり、幼虫の前部に向いたりする。鉗子を使用して、0.025ミリメートルの尾ピンを尾の端にできるだけ近い脊索に挿入します。幼虫にアルファブンガロトキシンを注入するには、ゲルローディングピペットチップを使用して、溶液の3マイクロリットルを注射針にバックフィルする。泡なしで、チップに均等にソリューションをロードします。次に、手動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに心臓注射針を挿入します。ステレオ顕微鏡の下で、麻酔幼虫のAP軸に垂直に整列し、30度の角度で指し示すように針を置きます。次に、ピペットホルダーを圧力インジェクタに接続します。αブンガロトキシンのボーラスを溶液に注入し、針先がはっきりしているかどうかをテストする。赤い色が見えない場合は、針先をピンの端に向けてゆっくりと削り、針がはっきりするまでもう一度試してください。続いて、心臓の外側の皮膚に触れるまで、針を心臓に向かって進める。針を幼虫に押し込み、心臓の前の皮膚の色素細胞のくぼみを探して、針が幼虫に対して正しい平面に配置されていることを確認します。次に、針を後に進め、皮膚を突き刺して心臓腔に入ります。針を少し引き戻し、アルファバンガロトキシンのボーラスを心臓腔に注入します。心臓腔の膨張、または空洞に入る赤い染料を探します。幼虫を3回軽くすすい、1ミリリットルの神経緩衝液を使用して残留MS222を除去する。流体をすべて除去しないでください。灌流チャンバ内のニューロンバッファーの約1ミリレターで幼虫を維持します。この手順では、ゲルローディングチップを使用して適切に壊れた流体ジェット針にネロナーバッファーの10マイクロリットルをバックフィルします。泡なしで先端に均等にソリューションをロードします。次に、電動マイクロマニピュレータに取り付けられたピペットホルダーに針を挿入します。輸液室を顕微鏡ステージの円形チャンバーアダプターに入れます。幼虫が視野の中心になるように電動ステージを動かします。続いて、円形チャンバーアダプタを回して、APが幼虫へのアクセスを流体ジェット針の軌道とほぼ一致するようにします。透過光と差動干渉コントラストを使用して、幼虫を焦点にして10倍の目標の下に中央に置く。次に、10 倍の目標を上げます。電動マイクロマニピュレータを使用して、流体ジェットニードルを視野の中央に下ろし、透過光で照らし、ニューロンバッファにほとんど触れないようにします。その位置を確認するために幼虫に焦点を当てるために10倍の目標を下げます。流体ジェット針の目的をフーラス。マイクロマニピュレーターを x 軸と y 軸に持つ流体ジェット針を、幼虫の後側に平行な位置に移動します。その後、幼虫に焦点を当てます。針をZ軸に下ろし、針を魚の裏側に沿って、体から1ミリメートル離れたところに置きます。円形のチャンバーアダプターを慎重に動かして、流体ジェットニードルが幼虫のAP正中線に沿って整列していることを確認します。次に、60倍の水の目的に切り替えます。目的がニューロンバッファーにエマースされていることを確認します。神経マストを見つけるために細かい焦点を使用してください。続いて、モタライズされたステージを移動し、対象となる神経マストを視野の中心に配置します。魚の裏側に沿って流体ジェット針の先端を保ちます。流体ジェット針先を幼虫やチャンバー表面に触れないでください。マイクロマニピュレーターで流体ジェット針を配置し、ニューロマストの外縁から 100 マイクロメートルになるようにします。次に、アペカルヘアバンドルの先端まで焦点を合わせます。流体ジェット針の底は、この平面に焦点を当てる必要があります。撮像ソフトウェアからの入力を受け取るために、マニュアルから外部モードへの高速圧力クランプを設定します。ゼロボタンを押して高速圧力クランプをゼロにし、設定点ノブを使用して安静圧をわずかに正に設定します。ヘッドステージ出力に取り付けられたPSI圧力計を使用して、高速圧力クランプの安静出力を確認します。毛束を刺激するために必要な圧力を決定するには、200〜500ミリ秒の0.125および0.25ボルト出力でテスト刺激を適用します。各試験刺激について、毛束の先端、キノビリアの偏向の距離を測定する。約5マイクロメートルの距離の束を移動する圧力を選択してください。キノ紀の先端がずっと焦点を合わせ続けていることを確認します。単一平面画像を取得するには、フレーム30の後、3秒で80フレームの取得中に提供する刺激を選択します。メカノイ感受性カルシウムの応答を測定するには、補助毛束の基部に焦点を当て、画像取得を開始します。シナプス前カルシウム応答を測定するには、毛細胞の基部に焦点を合わせ、画像取得を開始する。シミュレーション中にニューロマスト内でのGCaMP6S強度の時空間的変化を可視化する手順をここで概説する。時刻は、タイムスタンプに従って左から右に表示されます。一番上の行は、70 フレームの GCaMP6S F イメージ シーケンスから 14 個の時間ビンのうち 5 つを示しています。2 行目では、ベースラインが各 GCaMP6S F ビンイメージから削除され、デルタ F イメージが作成されます。3 行目では、デルタ F イメージがグレースケールから赤いホット ルックアップ テーブルに変換されています。一番下の行では、3 番目の行が一番上の行の F イメージに重ね付けされています。この手順を試みる際には、データからモーションアーティファクトを除外するために、原稿に記載されているように、幼虫が正しくピン留めされていることを確認し、適切なコントロールを使用することを忘れないでください。アルファブンガロトキシンを使用すると危険なことができます。手袋を取り扱うなど、注意を要します。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

成虫ゼブラフィッシュにおける鈍力損傷の影響を研究するスケーラブルモデル

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

成人ゼブラフィッシュを用いた学習・記憶研究における認知評価のための連想学習ツールとしてのシャトルボックスアッセイ

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウムイメージング