Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

이 작품은 NIH/NIDCD 교내 연구 자금 1ZIADC000085-01 (K.S.K.)에 의해 지원 되었다. 우리는 피지 매크로 작성에 그녀의 원조에 대 한 사탕 웡을 인정 하 고 싶습니다. 우리 또한 도리스 우와 사탕 웡 프로토콜 도움이 그들의 제안에 감사 하 고 싶습니다.

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	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Vivo에서 화상 진 찰 그대로 동물에 본질적으로 도전 이다. 이 방법에서는 여러 단계는 신뢰할 수 있는 비보에 옆 선 세포에서 칼슘 측정을 얻기에 중요 합니다. 예를 들어 유 충은 고정 하 고 이미징 동안 움직임을 최소화 하기 위해 이미징 하기 전에 제대로 마비 매우 중요 하다. 이미징 동안 초과 운동입니다 진정한 신호 변화 칼슘 수준에 일치 하지 않는 GCaMP6s 형광에서 변화에 지도할 수 있다 (예를 들어, 인물 4B1'-B1 ' 및 4 C 1'-c 1 '). 꼬리 핀 anteriorly 위해 운동,이 더 많은 후부 neuromasts 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다 하지만 더 배치할 수 있습니다. 또한, 심장 주입 후 머리 핀 회전할 수 있습니다 있도록 핀의 수평 부분 노 른 자에서 속 인 다. 핀의 위치를 변경 하는 것 이외에 애벌레34무력화를 핀 대신 뇌-슬라이스 하프를 사용 하 여 가능 하다. 위에 놓으면 애벌레 제대로, 하프를 추가, 잠재적으로 immobilizing 애벌레의 침입 방법은 더 적은 이다. 중요 한 운동 부족 고정에서 발생할 수 있습니다, 하는 동안 제대로 수행 α-bungarotoxin를 제공 하 여 애벌레 마비 심장 주입 수 불완전 마비, 운동, 고 궁극적으로 모션 아티팩트. 일반적으로 사용된 마 취약 영향 zebrafish 세포의 흥분을 표시 되었습니다, 하지만 최근 작품 마 취 benzocaine 머리 세포 활동의 여러 측면으로 방해 하지 않는 보이고 있다. 마찬가지로, 더 일반적으로 MS-222만 머리 세포 활동15의 특정 측면을 방해 하는 마 취를 사용. 따라서, α-bungarotoxin 주입의 도전 특성상 benzocaine 또는 MS-222 응용 프로그램 기능 칼슘 이미징 동안 유 충에 움직임을 방지 하기 위해 마비의 유용한 다른 방법으로 증명할 수 있습니다.
이 프로토콜에 관련 된 기술적인 문제 이외에 완벽 하 게 탑재 된 샘플은 유 충 및 세포 이전 및 각 이미징 실험 동안 건강 하지 않은 경우 쓸모 없다. 되도록 애벌레 및 세포 건강, 애벌레 하 chorions (계란 껍질), 폐기물, 미생물 등 파편의 E3 버퍼에 유지 된다 중요 하다. 옆 선 세포의 표면 위치는 영상에 대 한 유리한,이 위치는을 그들 세포 손상에 더 취약 E3 버퍼 반 칙 때. 깨끗 하 고 수성 환경 특히 젊은 애벌레 (2-4 dpf)에 대 한 중요 한 또는 똑바로 수영을 유지할 수 없습니다 돌연변이 놓고 주로 페 트리 접시의 하단에 거짓말. 이러한 상황에서 옆 라인 세포 및 머리 번들을 둘러싼 보호 cupula 손상 수 있습니다 쉽게 될. 건강 한 애벌레와 각 실험의 과정을 통해 세포로 시작 하는 경우에 그것은 유 충에 심장 박동 및 급격 한 혈액의 흐름에 중요 한. 경우 혈 류 속도가 느려집니다 또는 중지, 머리 세포의 건강을 손상 될 수 있습니다. 손상 된 준비는 건강에 해로운 애벌레 또는 혈액 흐름의 손실, 죽어가는 세포 확인 될 수 있다 여러 가지 방법으로: 첫 번째, karyopyknosis 또는 셀 내에 DIC 광학; 아래 거품으로 명단 핵 응축의 모양으로 둘째, 세포 수축과 빠르게 이동 하는 세포질; 내 입자의 존재에 의해 그리고 세 번째 때 kinocilia 팁 다른 방향35에 밖으로 퍼짐. 머리 번들 중단 됩니다 때 자극 동안 splayed kinocilia 노드라고도 함 함께 이동 하지 않습니다.
이 준비는 하나는 준비만 남아 강력한 1-3 시간 후에 설정에 대 한 몇 가지 사소한 제한이 있습니다. 작은 핀 이나 뇌 슬라이스를 사용 하 여 수정 하프 애벌레를 무력화 하 고 관류 시스템 추가이 비보에 준비의 수명을 연장할 수 있습니다. 또 다른 한계는 photobleaching 이며 phototoxicity 이미징 실험을 반복 후 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복 하기 위해 하나의 흥미로운 방법은 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한이 프로토콜에 맞게입니다. 빛-시트 현미경 초점 빛, 적은 photobleaching 및 phototoxicity36선도에서 줄일 수 있는 강력한 방법입니다. 함께, gentler immobilization와 적은 사진 노출 각 이미징 세션 연장 도울 수 있다. 더 이상 이미징 세션 검사 기능 변경 개발 및 머리 세포 클리어런스 및 부상 후 재생 기본 프로세스의 전체 기간을 사용할 수 있습니다. 빛 시트 현미경 검사 법, 뿐만 아니라이 프로토콜 적응 시킬 수 있다 다른 종류 confocal 시스템 (포인트 검색, 2-광자, 및 회전 디스크)에 상대적으로 간단한 widefield 시스템28,34 뿐만 아니라 다는 것을 지적 하는 것이 중요 하다 . 전반적으로, 그 다양성에 게 적응 하 고 여러 이미징 시스템에 사용 될 수 있는 유용한 도구를 프로토콜 합니다.
이 프로토콜 적응 수 고 많은 이미징 시스템을 사용 하는 동안이 프로토콜의 부분 또한 적응 고 (1) GCaMP6s 외 고 (2) 다른 감각 세포와 신경 애벌레 zebrafish 내 이미지 활동에 다른 지표와 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어 이전 연구에서 우리는이 프로토콜 cytosolic 칼슘 (RGECO1), 소포 융해 (SypHy), 막 전압 (Bongwoori), 고 막 검출 하 옆 라인 세포 내의 여러 유전자 인코딩된 지표를 사용 하 여 이미지 작업을 사용 칼슘 (jRCaMP1a-caax GCaMP6s caax), 측면 라인 입성 프로세스 감지 막 칼슘 (GCaMP6s-caax)5를 내. 이러한 표시기를 사용 하 여 우리의 경험을 바탕으로,이 프로토콜에서 설명 하는 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유전자 변형 라인 옆 라인 neuromasts에 활동을 이미징에 대 한 훌륭한 시작을 제공 합니다. 위에 나열 된 모든 지표, 우리 GCaMP6s은 가장 민감하고 photostable 것으로 나타났습니다. 이러한 기능 이외에 우리 강조 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유전자 변형 라인 두 가지 측정 하는 데 사용 될 수 있습니다 때문에: 머리-셀 mechanosensation 및 단일 유전자 변형 선 내 연 접 칼슘.
이 문서에 설명 된 기술을 어떻게 zebrafish 측면 라인에서 칼슘 이미징 세포 그들의 네이티브 환경에서 작동 하는 방법을 연구 하는 강력한 방법을 수 보여 줍니다. 이 방식은 어떤 머리 셀에 함수 현재 공부 하 고 전 비보 explants에 포유류의 연구를 보완 합니다. 또한, zebrafish 모델 포유류 세포에 활동을 검사에 적용할 수 있는 유전자 인코딩된 지표의 효능 테스트 플랫폼으로 사용할 수 계속 수 있습니다.

기능성 칼슘 이미징 많은 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구1동시에 세포 이다. 특히, 유전으로 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 칼슘 이미징 GECIs 특정 세포 유형으로 표현 될 수 있습니다 및 subcellularly2지역화 된 때문에 유리한 것으로 표시 되었습니다. 신경 과학 연구에서 이러한 기능은 만들었습니다 칼슘 이미징 GECIs를 사용 하 여 모두 신경 네트워크에서 활동 패턴을 정의 하 고 개별 시 냅 스3,4칼슘 유입 측정 하는 강력한 방법을. 이러한 기능을 이용 최근 연구 사용 confocal 현미경 검사 법 및 GECIs 감각 머리 세포5컬렉션 내의 subcellular 활동을 모니터링.
머리 세포는 몸의 수생 vetebrates6,7측면-라인 시스템에서 내가 운동과 지역 물에 소리와 vestibular 자극을 감지. 세포 손상이 나 유전자 변이 인간 감각 청각 손실8,9로 알려진 청력 손실의 가장 일반적인 형태로 결과의 대상 많습니다. 따라서, 그것은 치료 하 고 청력 손실을 방지 하는 방법을 이해 하려면 이러한 셀 함수를 이해 하는 중요 한입니다. 제대로 작동 하려면 세포 mechanosensory 머리 번들 및 감지 하 고 자극을 각각 전송 시 냅 스 리본 라는 두 개의 특수 구조를 사용 합니다. 머리 묶음 머리 세포의 정점에 위치 하 고 괜 찮 아 요, 털 같은 돌출 stereocilia (그림 1A)로 알려진의 주로 구성 되어. Vestibular와 옆 선 세포, 각 머리 번들 stereocilia (그림 1A) 위에 확장할 수 있는 단일 긴 kinocilium (셀의 유일 하 고 진정한 cilium), 또한 있다. Mechanosensory 자극 편향 머리 번들, 그리고 편향 "팁-링크 라고" stereocilia10를 상호 연결 하는 관계에 긴장을 둔다. 이 긴장 stereocilia, 칼슘11,12를 포함 하 여 양이온의 꼭대기 유입 결과에 있는 mechanotransduction (메트로) 채널을 엽니다. 이 꼭대기 궁극적으로 depolarizes 머리 세포 활동과 전압 개폐 칼슘 채널 (Cav1.3) 셀의 기지에서 열립니다. Cav1.3 채널 인접 한 시 냅 스 리본, 연 접 구조 tethers 활성 영역에 소포를 찾을 수 있습니다. Cav1.3 채널을 통해 기저 칼슘 유입은 소포 융해, neurotransmission, 및 구심 성 뉴런13,14의 활성화 필요 합니다.
몇 년 동안, 전체 셀 패치 클램핑 등 electrophysiological 기법은 많은 종에서 zebrafish15,,1617, 를 포함 하 여 세포의 기능 특성을 사용 되었습니다 18,,1920. 이상의 매우 빠른 자극을 부호화 하는 개별 감각 세포에서 매우 민감한 측정을 얻기 위해 사용할 수 있기 때문에 이러한 electrophysiological 녹음 청각과 균형 분야에서 특히 귀중 한 있다는 주파수 및 강렬21,22의 넓은 범위. 불행 하 게도, 전체 셀 녹음 세포의 활동을 측정할 수 없습니다. Zebrafish 옆 라인에 세포의 활동을 공부, microphonic 잠재력과 성의 활동 전위 사용 된 총계 mechanosensitive 및 개별 neuromasts23의 postsynaptic 응답 속성을 측정 하 ,24. 불행히도, 전체 셀 녹음도 로컬 필드 가능성 측정 활동 개별 셀 내에서 발생 또는 인구 내의 각 세포의 활동을 측정 정확 하 게 공간 해상도. 더 최근에, 칼슘 염료와 GECIs 이러한 과제25,26을 무시 하도록 고용 되었다.
Zebrafish에서 GECIs 만드는 애벌레27의 광학 선명도 유전자 변형 zebrafish의 상대적 용이성으로 인해 머리 세포 기능을 검사 하는 강력한 접근 방식을 입증 했습니다. Zebrafish 애벌레에서 세포는 옆 라인 시스템으로 내가 존재 한다. 측면 라인은 물 운동 (그림 1)에서 로컬 변경 내용을 검색 하는 데 사용 되는 neuromasts 라는 세포의 장미 같은 클러스터 구성 되어 있습니다. 측면 라인은 물고기의 표면을 따라 외부 위치 때문에 특히 유용 합니다. 이 액세스는 세포를 자극 하 여 칼슘 신호 그대로 애벌레에 광학 측정 가능 했다. 전반적으로, transgenesis, 애벌레의 투명도 옆 선 세포의 탁월한 액세스의 용이성이 만들었습니다 zebrafish vivo에서 세포의 활동을 연구 하는 귀중 한 모델을. 이것은 세포 내가 뼈 구조에 의해 포위 된다 포유류 시스템에 비해 상당한 이점을 이다. 접근의이 부족 포유류 세포의 기능 vivo에서 측정을 취득 하기 아주 곤란 했다.
여기에 설명 된 프로토콜 메트로 애벌레 zebrafish에 neuromasts 내에서 셀 간에 개별 세포 내 칼슘 채널 및 presynapse 종속 변화를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 머리 세포 특정 myosin6b 발기인28의 통제 막 지역화 GCaMP6s을 표현 하는 설립된 유전자 변형 제 브라 라인을 활용 합니다. 이 막 지역화 위치 머리 세포 기능에 대 한 중요 한 원형질 막에 있는 이온 채널을 통해 칼슘 유입 검색 GCaMP6s. 예를 들어 막 지역화 GCaMP6s 칼슘을 감지할 수 메트로 통해 유입 채널 꼭대기 머리 번들 및 CaV통해 셀의 기지에서 시 냅 스 리본 근처 1.3 채널. 이 cytosolic GECIs 메트로 CaV1.3 채널 활동 뿐만 아니라 다른 소스 로부터 칼슘 기부금의 조합 칼슘 신호 감지 GECIs cytosol, 지역화를 사용 하 여 대조 (예:, 저장소 해제). 이 프로토콜 무력화 이미징 이전 GCaMP6s 유전자 변형 애벌레 마비 하는 방법을 설명 합니다. 다음 준비 하 고 액체 제트를 사용 하 여 제어 되 고 재현 가능한 방식으로 옆 선 세포를 자극 하는 머리 번들을 빗 나가게 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있는 대표적인 데이터 표시 됩니다. 운동 아티팩트를 나타내는 데이터의 예제도 제공 됩니다. 제어 실험 결과 확인 하 고 유물을 제외 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 마지막으로, 피지 소프트웨어에서 공간 칼슘 신호를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 피지 분석은 이전 설립된 시각화 방법을 MATLAB5를 사용 하 여 개발에서 적응. 전반적으로,이 프로토콜 애벌레 zebrafish 측정 하 고 시각화 vivo에서 머리 세포 칼슘 역학 GECIs를 사용 하 여 강력한 준비 기술을 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

감각 세포는 청각과 균형에 필요한 내가 있는 몸의. 세포는 기계적으로 머리 번들 이라고 꼭대기 돌출을 빗 나가게 하는 감각 자극에 대 한 응답에서 활성화 됩니다. 편향 머리 묶음, 칼슘 등 양이온의 유입에 지도에 mechanotransduction (메트로) 채널을 엽니다. 이 양이온 유입 셀 depolarizes 하 고 basally 머리 셀 presynapse에 있는 전압 문을 단 칼슘 채널을 엽니다. 포유류에서 세포는 뼈, 쌌 다 고 기능 vivo에서 이러한 활동을 평가 하기 위해 도전입니다. 대조적으로, 애벌레 zebrafish 투명 하 고 세포를 포함 하는 외부에 위치한 측면 라인 기관 보유. 이 세포 기능 및 구조적으로 포유류 세포 유사 하 고 기능 vivo에서 평가 될 수 있다. 이 문서 설명 유전자 인코딩된 칼슘 표시기 (GECI)를 활용 하는 기술, GCaMP6s, 칼슘 자극 갖는 측정 하 zebrafish 옆 선 세포에서 신호 한다. GCaMP6s 사용할 수 있습니다, confocal 영상, 함께 꼭대기와 옆 선 세포의 기지에서 vivo에서 칼슘 신호 측정에. 이러한 신호는 두 mechanosensation 및 presynapse 종속 칼슘이 세포 내에서 실시간, 정량 판독을 제공합니다. 이러한 칼슘 신호 또한 세포 감지 하 고 감각 자극을 전달 하는 방법에 관한 중요 한 기능 정보를 제공 합니다. 전반적으로,이 기술은 상대 변경에 대 한 유용한 데이터 생성 칼슘 활동 vivo에서. 그것은 덜 잘 칼슘 변경의 절대 규모의 정량화에 적합 합니다. Vivo에서이 기술은 모션 아티팩트에 과민 하다. 적당 한 양의 연습과 기술은 적절 한 위치, immobilization, 그리고 애벌레의 자극에 대 한 필요 합니다. 궁극적으로, 제대로 실행 될 때이 문서에서 설명 하는 프로토콜에 라이브 동물 내에서 그들의 자연, 완전 통합 된 상태에서 세포의 활동에 대 한 귀중 한 정보를 수집 하는 강력한 방법을 제공 합니다.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish (Video) | JoVE

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

이 방법은 청력과 균형 분야의 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 감각 머리 세포 기능의 두 가지 중요 한 측면을 감지 하는 방법을 설명, mechanotransction 및 사전 시 냅 스 활동. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물에서 모발 세포의 기능을 시각화하고 모발 세포 수집이 감각 정보를 감지하고 전송하는 방법을 연구 할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 미세 한 집게와 텅스텐 와이어를 사용하여 단단한 캡슐화에 머리와 꼬리를 통해 유충을 고정하는 데 사용되는 핀을 패션합니다. 헤드 핀을 만들려면 0.035 mm 텅스텐 와이어를 한 손에 잡습니다. 반면에 미세 한 집게를 사용 하 여 와이어를 끝에서 1 밀리미터, 90도에서 구부립니다.포셉을 미세 한 가위로 교환하고 굽힘 후 1 밀리미터를 잘라 핀을 만듭니다. 그런 다음 집게를 사용하여 챔버의 강화 된 캡슐화에 핀을 삽입합니다. 유충을 관혈 챔버의 중앙에 배치하여 실리콘 캡슐화에 대해 측면에 평평하게 놓습니다.미세 한 집게를 사용 하 여, 0.035 밀리 미터 헤드 핀 애벌레에 수직으로 가져. 눈과 오틱 소포 사이에 헤드 핀을 삽입하고 캡슐화에 아래로 넣습니다. 두 번째 집게 세트를 사용하여 등쪽과 복부 쪽을 따라 유충을 안정화하고 고정합니다.핀의 수평 부분이 애벌레에 닿고 캡슐화에 모든 방법을 누르지 않도록합니다. 핀을 통풍구로 각도, 또는 유충의 전방을 향해 약간 가리키는, 후속 심장 주사 및 헤어 세포 이미징을 방해하지 않도록. 집게를 사용하여 0.025 밀리미터 꼬리 핀을 노토코드에 삽입하여 꼬리 끝에 최대한 가깝게 넣습니다.유충에 알파 bungarotoxin을 주입하려면 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 용액의 3 마이크로 리터를 주입 바늘에 백필하십시오. 거품없이 솔루션이 팁에 균일하게 로드됩니다. 그런 다음 수동 미세 조작기에 부착 된 파이펫 홀더에 심장 주입 바늘을 삽입합니다.스테레오 현미경하에서, 바늘을 마취 유충의 AP 축에 수직으로 정렬하여 30도 각도로 아래로 향하도록 배치합니다. 다음으로 파이펫 홀더를 압력 인젝터에 연결합니다. 용액에 알파 분가로톡신의 볼러스를 주입하여 바늘 팁이 명확한지 여부를 테스트합니다.적색이 보이지 않으면 바늘 끝을 핀 가장자리에 매우 부드럽게 긁어 내고 바늘이 맑아지 때까지 다시 시도하십시오. 그 후, 바늘을 심장쪽으로 전진시키고, 심장 바깥쪽에 피부에 닿을 때까지 진행합니다. 바늘을 애벌레에 넣고 심장 앞 피부에 안료 세포의 들여쓰기를 찾아서 바늘이 애벌레에 상대적인 올바른 평면에 위치하도록 하십시오.그런 다음 바늘이 피부를 관통하고 심장 구멍에 들어갈 때까지 바늘을 더 멀리 진행합니다. 바늘을 약간 뒤로 당기고 알파 분가로톡신의 볼러스를 심장 구멍에 주입합니다. 심장 구멍의 인플레이션을 찾거나 공동으로 들어가는 붉은 염료를 찾습니다.유충을 세 번 부드럽게 헹구고, 뉴런 버퍼 1밀리리터로 잔류 MS222를 제거합니다. 모든 유체를 제거하지 마십시오. 관혈 챔버에서 뉴런 버퍼의 약 1 밀리리터에서 애벌레를 유지합니다.이 절차에서 젤 로딩 팁을 사용하여 제대로 깨진 유체 제트 바늘로 네로날 버퍼의 10 마이크로 리터를 백필. 거품없이 끝에 솔루션을 균일하게 로드합니다. 그런 다음, 전동 마이크로 조작기에 부착 된 파이펫 홀더에 바늘을 삽입합니다.내혈 챔버를 현미경 스테이지의 원형 챔버 어댑터에 넣습니다. 유충이 시야의 중심에 있도록 전동 스테이지를 이동합니다. 이어서, 유충에 대한 AP의 접근이 유체 제트 바늘의 궤적과 대략 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 돌립니다.전달된 빛과 차동 간섭 대비를 사용하여 유충을 초점으로 가져와 10배 목표 아래에 중앙에 삽입합니다. 그런 다음 10배 목표를 높입니다. 전동 마이크로 조작기를 사용하여 유체 제트 바늘을 시야 중앙으로 가져와 서 전달된 빛에 의해 조명되고 뉴런 버퍼를 거의 만지지 않습니다.위치를 확인하기 위해 애벌레에 초점을 10배 목표를 낮춥니다. 유체 제트 바늘에 목표를 허덕. 유충의 등쪽과 평행한 위치에 도달할 때까지 x 및 y축의 미세 조작기로 유체 제트 바늘을 이동합니다.그 후, 애벌레에 다시 초점을 맞춥니다. 바늘을 z 축에 내려 놓고 바늘을 물고기의 등쪽 면을 따라 바늘을 몸에서 1밀리미터 떨어진 곳에 놓습니다. 조심스럽게 유체 제트 바늘이 애벌레의 AP 미드 라인을 따라 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 이동합니다.다음으로 60배의 물 목표로 전환합니다. 목표가 신경 완충제에 에머드되어 있는지 확인합니다. 신경마비를 찾기 위해 미세 한 초점을 사용합니다.그 후 방색 된 단계를 이동하여 시야의 중심에 관심있는 신경을 배치합니다. 물고기의 등쪽 을 따라 유체 제트 바늘 팁을 유지합니다. 유충이나 챔버 표면에 유체 제트 바늘 끝을 만지지 마십시오.신경종의 바깥쪽 가장자리에서 100 마이크로미터되도록 미세 조작기와 유체 제트 바늘을 배치합니다. 그런 다음, 정물 머리 번들의 끝에 초점을 맞춥니다. 유체 제트 바늘의 바닥은이 평면에 초점을 맞추어야합니다.수동에서 외부 모드로 고속 압력 클램프를 설정하여 이미징 소프트웨어의 입력을 수신합니다. 제로 버튼을 눌러 고속 압력 클램프를 0으로 설정하고 세트 포인트 노브를 사용하여 휴식 압력을 약간 긍정적으로 설정합니다. 헤드 스테이지 출력에 부착된 PSI 기마계를 사용하여 고속 압력 클램프의 휴식 출력을 확인합니다.모발 번들을 자극하는 데 필요한 압력을 결정하려면 200-500 밀리초 동안 0.125 및 0.25 볼트 출력으로 테스트 자극을 적용합니다. 각 테스트 자극에 대해, 헤어 번들의 끝, 키노실리아의 편향의 거리를 측정합니다. 번들을 약 5 마이크로미터의 거리를 이동하는 압력을 선택합니다.키노실리아의 팁이 전체 시간에 초점을 유지하도록 하십시오. 단일 평면 이미지를 획득하려면 프레임 30 후 3초 후에 80 프레임 획득 중에 전달할 자극을 선택합니다. 메카노감감하는 칼슘 반응을 측정하려면, 압정 모발 번들의 기초에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작합니다.사전 합성 칼슘 반응을 측정하려면, 모발 세포의 기초에 초점을 맞추고, 이미지 수집을 시작합니다. 시뮬레이션 중 신경종 내에서 GCaMP6S 강도의 현수성 변화를 시각화하는 단계는 여기에 설명되어 있습니다. 타임스탬프에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 시간이 표시됩니다.맨 위 행에는 70프레임 GCaMP6S F 이미지 시퀀스의 14개의 측두엽 중 5개가 표시됩니다. 두 번째 행에서는 각 GCaMP6S F 비닝 이미지에서 기준선이 제거되어 델타 F 이미지를 만듭니다. 세 번째 행에서 델타 F 이미지가 회색 눈금에서 빨간색 핫 조회 테이블로 변환되었습니다.맨 아래 행에서 세 번째 행은 맨 위 행의 F 이미지에 오버레이되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 유충이 올바르게 고정되어 있는지 확인하고 원고에 설명된 대로 적절한 컨트롤을 사용하여 데이터에서 모션 아티팩트를 제외하는 것이 중요합니다. 알파 분가로톡신으로 작업하는 것은 위험할 수 있습니다.그것을 취급하는 동안 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain (Video) | JoVE

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation (Video) | JoVE

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish (Video) | JoVE

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish (Video) | JoVE

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin (Video) | JoVE

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive (Video) | JoVE

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish (Video) | JoVE

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish (Video) | JoVE

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo (Video) | JoVE

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...