Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIDCD intramural forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi ønsker å erkjenne Candy Wong for henne hjelp i å skrive makroen Fiji. Vi vil også gjerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres forslag med protokollen.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

I vivo imaging i intakt dyr er iboende utfordrende. Flere trinn i denne metoden er avgjørende for å oppnå pålitelige i vivo kalsium målinger fra sidelinjen hårcellene. For eksempel er det svært viktig at larvene er låst og lammet riktig før å minimere bevegelse under bildebehandling. Overflødig bevegelse under bildebehandling kan føre til endringer i GCaMP6s fluorescens som ikke sant signaler og ikke samsvarer med endringer i kalsium nivåer (f.eks tall 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1''). Hale pinner kan plasseres mer peke for å minimere bevegelse, men dette kan gjøre mer bakre neuromasts utilgjengelig. Videre etter hjertet injeksjon, kan hodet pinner roteres slik at den vannrette delen av pin ligger over eggeplomme. I tillegg til å endre plasseringen av pinner, er det også mulig å bruke en hjerne-skive harpe i stedet for pinner for å nakkens Larvene34. Når det plasseres over Larvene riktig, er en harpe en ekstra, potensielt mindre invasiv metode for immobilizing larver. Mens betydelig bevegelse kan skyldes utilstrekkelig låsing, kan riktig utføre hjertet injeksjon å levere α-bungarotoxin og lamme Larvene resultere i ufullstendige lammelse, bevegelse, og til slutt bevegelse gjenstander. Selv om brukte bedøvelse har blitt vist å påvirke excitability av sebrafisk hårcellene, har siste arbeid vist at det anesthetic benzocaine ikke påvirke mange aspekter av hair celle aktivitet. Tilsvarende vanlig mer bedøvelse MS-222 bare forstyrrer visse aspekter av hair celle aktivitet15. Derfor grunn utfordrende av α-bungarotoxin injeksjon, benzocaine eller MS-222 program kan vise seg for å være en nyttig alternativ lammelse å forhindre bevegelse i Larven under funksjonelle kalsium bildebehandling.
De tekniske utfordringene involvert i denne protokollen er selv en perfekt montert prøven ubrukelig hvis den Larven og hårcellene ikke er sunt før og under hver tenkelig eksperiment. For å sikre at larvene og hårcellene er sunn, er det viktig at larvene er opprettholdt i E3 buffer som er fri for rusk som chorions (egg skall), avfall og mikroorganismer. Selv om overfladiske plasseringen av lateral linje hårcellene er fordelaktig for bildebehandling, gjør beliggenheten dem mer utsatt for cellular skade når E3 bufferen er fouled. Et rent miljø for vandige er spesielt viktig for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter som ikke kan opprettholde en oppreist svømming plasser og primært ligger på bunnen av Petriskål. I disse situasjonene kan sidelinjen hårcellene og beskyttende Cúpula rundt hår pakker lett bli svekket. Selv når starter med sunn larver og hårcellene i løpet av hver eksperimentet, er det viktig å sikre at larvene har hjerteslag og rask blod flyte. Hvis blodstrøm bremser eller stopper, kan helse hårcellene bli svekket. I utsatte preparater usunn larver eller tap av blodstrøm, døende hårcellene kan identifiseres på flere måter: først av utseendet på karyopyknosis eller kjernefysiske kondens, som manifesterer seg som en boble i cellen under DIC optikk; andre av cellen krymping og tilstedeværelsen av raskt flytte partikler i cytoplasma; og tredje, når kinocilia tips splay i forskjellige retninger35. Når håret bunt er forstyrret, flyttes ikke den sprikende kinocilia kontinuerlig sammen under stimulering.
Dette preparatet har flere mindre begrensninger, en er at forberedelsene bare forblir robust for 1-3 timer etter den er opprettet. Endringer som benytter mindre pinner eller en hjerne-bit terpe til nakkens larver og legge et perfusjon system kan forlenge levetiden til dette i vivo preparatet. En annen begrensning er at photobleaching Phototoksisitet kan oppstå etter at gjentatt imaging studier. En spennende måte å mestre denne utfordringen er å tilpasse denne protokollen for lys arks mikroskopi. Lys arks mikroskopi er en effektiv måte å redusere av fokus lys, fører til mindre photobleaching og Phototoksisitet36. Sammen kan mildere immobilisering og mindre Foto-eksponering hjelpe forlenge hver tenkelig økt. Lenger tenkelig økter kan brukes til å undersøke hele varigheten til funksjonelle endringer følger utviklingen og prosessene underliggende hår-celle klarering og regenerasjon etter skade. Det er viktig å påpeke at i tillegg til lys arks mikroskopi, denne protokollen kan tilpasses andre typer AC confocal systemer (punkt-skanning, 2-fotonet og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Total, dens allsidighet gjør dette protokollen et verdifullt verktøy som kan tilpasses og brukes med flere imaging-systemer.
Mens denne protokollen kan tilpasses og brukes med mange imaging-systemer, kan deler av denne protokollen også tilpasses og brukes (1) med andre indikatorer foruten GCaMP6s og (2) bildet aktivitet i andre sensoriske celler og nerveceller i larver sebrafisk. For eksempel i en tidligere studie brukte vi denne protokollen til bildet aktivitet bruker flere genetisk kodet indikatorer innenfor sidelinjen hårcellene for å oppdage cytosolic kalsium (RGECO1), vesicle fusion (SypHy), membran spenning (Bongwoori) og membran kalsium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og sidelinjen afferente prosesser å oppdage membran kalsium (GCaMP6s-caax)5. Basert på vår erfaring med disse indikatorene, gir transgene linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokollen en utmerket start på imaging aktivitet i sidelinjen neuromasts. Alle indikatorer ovenfor, har vi funnet at GCaMP6s er de mest sensitive og photostable. I tillegg til disse funksjonene vi markere Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linjen fordi det kan brukes å lage to forskjellige målinger: hår-cellers mechanosensation og presynaptic kalsium i transgene enkeltlinjer.
Teknikken beskrevet i denne artikkelen viser hvordan kalsium imaging i sidelinjen sebrafisk kan være en kraftig metode å studere hvordan hårcellene fungerer i sitt eget miljø. Denne tilnærmingen er utfyllende til studier av pattedyr i hvilken hår-celle funksjonen studeres i ex vivo explants. I tillegg kan sebrafisk modell fortsette å bli brukt som en plattform for å teste effekten av genetisk kodet indikatorer som kan deretter brukes til å undersøke aktiviteten i pattedyrceller hår.

Funksjonell kalsium bildebehandling er et kraftig verktøy som kan brukes til å overvåke aktiviteten til mange celler samtidig1. Spesielt har kalsium bildevisning genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) vist å være en fordel fordi GECIs kan uttrykkes i spesifikke celletyper og lokaliserte subcellularly2. I nevrovitenskap forskning, har disse funksjonene gjort kalsium bildevisning GECIs en kraftig metode for både definere aktivitet mønstre i nevrale nettverk og måle kalsium tilstrømningen personlige synapser3,4. Dra nytte av disse funksjonene, en fersk studie brukt AC confocal mikroskopi og GECIs for å overvåke subcellular aktivitet innen samlinger av sensoriske hårcellene5.
Hårcellene er mechanoreceptors som oppdager lyd og vestibular stimuli i indre øret og lokale vann bevegelse i sidelinjen systemet i akvatiske vetebrates6,7. Hårcellene er ofte målet for skade eller genetiske mutasjoner som resulterer i den vanligste typen hørselstap hos mennesker kjent som sensorineural hørselen tap8,9. Derfor er det avgjørende å forstå hvordan disse cellene funksjon for å forstå hvordan å behandle og forebygge hørselstap. For å fungere skikkelig, benytte hårcellene to spesialiserte strukturer kalles mechanosensory-hår bunter og synaptic bånd å oppdage og overføre stimuli, henholdsvis. Hår bunter ligger på toppen av hårcellene og består hovedsakelig av fine, hår-lignende utstikkende deler kalt stereocilia (figur 1A). Vestibular og sidelinjen hårcellene har hver håret bunt også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sanne Flimmerhår), som kan strekke seg langt over stereocilia (figur 1A). Mechanosensory stimuli avlede hår bunter, og nedbøyning setter spenning på sammenhengene kalt "tips-koblinger" som interconnect stereocilia10. Denne spenningen åpner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, noe som resulterer i en apikale tilstrømning av kasjoner, inkludert kalsium11,12. Denne apikale aktiviteten til slutt depolarizes hår cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler (Cav1.3) på bunnen av cellen. Cav1.3 kanaler finnes tilstøtende synaptic bånd, en presynaptic struktur som tethers blemmer på aktive soner. Basal kalsium tilstrømningen gjennom Cav1.3 kanaler kreves for vesicle fusion, neurotransmission og aktivering av afferente neurons13,14.
I mange år, har elektrofysiologiske teknikker som helhet celle oppdateringen clamping brukt å undersøke funksjonelle egenskaper hårcellene i mange arter, inkludert sebrafisk15,16,17, 18,19,20. Elektrofysiologiske opptakene er spesielt verdifull i feltene høring og balanse fordi de kan brukes til å få ekstremt følsomme målinger fra personlige sensoriske celler, hvis formål er å kode ekstremt rask stimuli over en bredt spekter av frekvenser og intensiteter21,22. Dessverre, hele celler opptak kan ikke måle aktiviteten til bestander av hårcellene. For å studere aktiviteten til bestander av celler i sebrafisk-sidelinjen, har microphonic potensialer og afferente handling potensialer brukt til å måle summerte mechanosensitive og postsynaptic svar egenskapene for individuelle neuromasts23 ,24. Dessverre, verken hele celle opptak eller lokale feltet potensielle mål har romlig oppløsning å finne hvor aktiviteten skjer i enkeltceller eller måle aktiviteten i hver celle i en populasjon. Flere nylig, kalsium fargestoffer og GECIs har vært ansatt å omgå disse utfordringene25,26.
I sebrafisk, har GECIs vist seg for å være en effektiv tilnærming til å undersøke hår-celle-funksjonen på grunn av det er relative enkelt å lage transgene sebrafisk og optisk klarhet Larvene27. I sebrafisk Larvene er hårcellene tilstede i det indre øret, samt sidelinjen systemet. Sidelinjen består av rosett-lignende klynger av hårcellene kalt neuromasts som brukes til å oppdage lokale endringer i vann bevegelse (figur 1). Sidelinjen er spesielt nyttig fordi det ligger eksternt langs overflaten av fisken. Dette har gjort det mulig å stimulere hårvekst celler og måle kalsium signaler optisk i intakt larver. Total, enkel transgenesis, gjennomsiktighet næringsplante og enestående tilgang sidelinjen hårcellene har gjort sebrafisk en uvurderlig modell å studere aktiviteten til hårcellene i vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer der hårcellene er omgitt av benete strukturer i det indre øret. Denne mangelen på tilgang har gjort det svært vanskelig å skaffe funksjonelle i vivo målinger av hår pattedyrceller.
Protokollen skissert her beskriver hvordan å overvåke MET kanal - og presynapse-avhengige endringer i kalsium i enkeltceller hår og blant celler innenfor neuromasts i larver sebrafisk. Denne protokollen bruker en etablert transgene sebrafisk linje som uttrykker en membran-lokalisert GCaMP6s under kontroll av hår-celle bestemte myosin6b promoter28. Denne membranen lokalisering stillinger GCaMP6s for å oppdage kalsium tilstrømningen gjennom ionekanaler i plasma membranen som er avgjørende for håret-celle-funksjonen. For eksempel membran-lokalisert GCaMP6s finner kalsium tilstrømningen gjennom MET kanaler i apikale hår bunter og gjennom CaV1.3 kanaler nær synaptic bånd på bunnen av cellen. Dette gir kontrast til bruker GECIs lokalisert på stoffer som cytosolic GECIs oppdager kalsium signaler som er en kombinasjon av MET og CaV1.3 kanal aktivitet samt kalsium bidrag fra andre kilder (f.eks, store release). Denne protokollen skisserer hvordan nakkens og lamme GCaMP6s transgene Larvene før bildebehandling. Det beskriver hvordan du forbereder og bruke en væske-jet for å avlede hår pakker for å stimulere sidelinjen hårcellene i en kontrollert og reproduserbar måte. Representant data som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen presenteres. Eksempler på data som representerer bevegelse gjenstander er også presentert. Kontroll eksperimenter som brukes til å bekrefte resultatene og utelukke gjenstander er beskrevet. Til slutt, en metode for å visualisere romlige kalsium signaler i Fiji programvaren er beskrevet. Fiji analysen er tilpasset fra tidligere etablert visualisering metoder utviklet ved hjelp av MATLAB5. Samlet skisserer denne protokollen en kraftig forberedelse teknikk som bruker GECIs larver sebrafisk å måle og visualisere hår-celle kalsium dynamikken i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensorisk hårcellene er mechanoreceptors i det indre øret som er nødvendig for hørsel og balanse. Hårcellene aktiveres svar på sensoriske stimuli som mekanisk avlede apikale utstikkende deler kalt hår bunter. Nedbøyning åpner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bunter, fører til en strøm av kasjoner, inkludert kalsium. Denne kasjon pågangen depolarizes cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler ligger basally på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellene er omsluttet i ben og det er utfordrende å funksjonelt vurdere disse aktivitetene i vivo. Derimot larver sebrafisk er transparent og ha et eksternt ligger sidelinjen organ som inneholder hårcellene. Disse hårcellene er funksjonelt og strukturelt ligner på pattedyr hårcellene og kan være funksjonelt vurdert i vivo. Denne artikkelen beskriver en teknikk som bruker en genetisk kodet kalsium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, måle stimulans-utløste kalsium i sebrafisk sidelinjen hårcellene. GCaMP6s kan brukes sammen med AC confocal imaging, måle i vivo kalsium signaler på toppen og bunnen av lateral linje hårcellene. Disse signalene inneholder en real-time, målbare avlesning av både mechanosensation - og presynapse-avhengige kalsium aktiviteter innenfor disse hårcellene. Disse kalsium signalene også gi viktige funksjonelle informasjon om hvordan hårcellene oppdage og overføre sensoriske stimuli. Total, denne teknikken genererer nyttige data om relativ endringer i kalsium aktivitet i vivo. Det er mindre velegnet for kvantifisering av absolutt omfanget av kalsium endringer. Denne i vivo teknikken er følsom for bevegelse. En rimelig andel av praksis og ferdigheter er nødvendig for riktig posisjonering, immobilisering og stimulering av larver. Til slutt, når godt utført, protokoll beskrevet i denne artikkelen gir en kraftfull måte å samle verdifull informasjon om aktiviteten av hårcellene i deres naturlige, fullt integrert delstater levende dyr.

Etter myo6b:GCaMP6s-caax transgene fisk er riktig immobilisert og væske-jet stimulans leveres til sidelinjen hårcellene, robust kalsium signaler kan visualiseres og målt (tall 4 og 5på 2 X binning). Under væske-jet stimulering signaler kalsium kan enten måles i apikale hår bunter, der MET kanaler åpne som svar på stimuli eller ved foten av hårcellene, der presynaptic Cav1.3 kalsium kanaler utløse neurotransmission. Et representativt eksempel på kalsium svar i disse områdene med en individuell neuromast er vist i Figur 4A1-A2''. I dette eksemplet ble en 2-s 5 Hz væske-jet stimulans levert for å aktivere alle hårcellene i representative neuromast. Under stimulans, robust kalsium signaler kan påvises i hår bunter (Figur 4A1-A1'', svar fra 8 hår bunter vises). Nesten alle eldre hårcellene Vis denne apikale pågangen av kalsium5i dette systemet. Innenfor den samme neuromast, det er synlig kalsium signaler i basale, synaptic flyet i bare et delsett (~ 30%) av hårcellene (Figur 4A2-A2'', 4 celler med presynaptic svar vises)5. 4 grønn ROIs Vis celler med ingen signifikant presynaptic kalsium signaler (Figur 4A2-A2'') til tross for robust apikale kalsium signaler (Figur 4A1-A1''). I dette representant (Figur 4A1-A2''), farget ROIs matche opp hår bunter i apikale MET flyet (Figur 4A1) med kroppen sin celle på basale synaptic flyet (Figur 4A2). Dette eksemplet viser hvordan begge MET avhengige - og presynaptic-kalsium signaler kan måles i enkeltceller hår og blant populasjoner av hårcellene.
Kalsium signaler i begge hår pakker og presynapse kan tegnes grafisk som rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (se Trinn 12, tall 4A1'-A1'' og 4A2'-A2''). (F) GaMP6s grafene markere at planlagte fluorescens intensiteten for hver celle kan variere (tall 4A1' og 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, hver celle er normalisert til den opprinnelige verdien og den relative intensiteten endringen fra baseline tegnes (tall 4A1'' og 4A2''). I begge (F) og ΔF/Fo GCaMP6s tomter, kalsium signaler i både apikale håret bunt og basale presynaptic flyet starter med utbruddet av stimulans (grå boks) og avslå eksponentielt etter stimulans. Under stimulans, kalsium signaler i hår bunter stige raskt og Mette hvis styrke nedbøyning ikke endres (Figur 4A1-A1''). I kontrast i delsettet med hårcellene med synlig kalsium signaler i synaptic flyet, kalsium signaler mer gradvis øker og er mindre utsatt for metning (Figur 4A2-A2''). Kalsium signalene fortsatt nær planlagt i hårcellene uten presynaptic kalsium signaler (grønn ROIs).
I tillegg til disse grafiske fremstillinger (Figur 4), kan kalsium signaler visualiseres romlig i det hele neuromast i gang løpet av innspillingen. Et eksempel på en spatiotemporal representasjon er vist i figur 5 for presynaptic GCaMP6s signaler i basale planet på en neuromast. I figur 5, er de viktigste trinnene for å behandle en bildesekvens for romlig visualisering beskrevet som beskrevet i trinn 13. Først rå (F) GCaMP6s bildene er timelig binned [figur 5: 1.p (5 av 14 hyllene er vist); trinn 13.2.1]. Deretter opprinnelige bildet, beregnet fra før stimulans rammer (trinn 13.2), trekkes fra (F) GCaMP6s fluorescens signaler å få ΔF bilder (figur 5: rad 2; trinn 13.2.2). Neste, gråtonebilder ΔF konverteres til en farge LUT (figur 5: rad 3, Red Hot LUT; trinn 13,3). Til slutt, ΔF bilder med LUT konverteringen er kledde på timelig binned (F) bilder (figur 5, 1.p) å avsløre de spatiotemporal signalene i neuromast under stimulering (figur 5: rad 4; trinn 13,4). Varme kartene ΔF GCaMP6s signaler gir både verdifulle romlige og tidsmessige informasjon som ikke lett å sortere ut fra enkelt ROIs og grafene i Figur 4. Varme kart kan hjelpe visualisere kritiske spatiotemporal informasjon, inkludert subcellular informasjon om utbruddet og varigheten av kalsium signaler i hver håret celle samt til timing og intensitet forskjellene mellom hårcellene i hele neuromast.
Det er viktig å kontrollere at grafene og romlig varme kart representere sanne kalsium signaler og er ikke gjenstander pga bevegelse. I denne protokollen, kan bevegelse være et resultat av overdreven drift eller bevegelse av Larven eller bevegelse grunnet væske-jet stimulering. Alle disse gjenstander er utfordrende å fullstendig eliminere dette i vivo forberedelse. Mens registrering av bildesekvenser (Trinn 12.1.3) kan korrigere for må flertallet av bevegelse i x - og y-akser, bildesekvenser med overdreven bevegelse i z-aksen identifiseres og fjernes fra analyser. Bevegelse er lettest å identifisere av grafiske kalsium signaler. Eksempler på GCaMP6s intensitet endringer som gjenstander ikke og sant GCaMP6s signaler kan observeres på toppen (Figur 4B1'-B1'') og base (Figur 4C1'-C1'') av hårcellene.
I de apikale hår buntene, bevegelse er vanlig når væske-jet stimulans er for sterk (Figur 3A3'' '). Under disse overdrevet sterke stimuli, apikale håret-bunt flyet kan flytte ut av fokus under væske-jet stimulering deretter tilbake til den opprinnelige fokalplanet etter stimulans avslutter (Figur 4B1'-B''). Dette gjør det vanskelig å måle apikale MET-avhengige kalsium signaler. Et eksempel på håret bunt bevegelse gjenstander kan ses i Figur 4B1'-B1''. Her, grafene viser en nedgang i GCaMP6s signaler under stimulans (grå boks) når håret pakker er ute av fokus. Etter stimulans, øke GCaMP6s signalene raskt hår bunter tilbake til utgangsposisjonen og komme tilbake i fokus. Dette gir kontrast til eksemplet i Figur 4A1'-A1'' der apikale kalsium signalene øker utbruddet av stimulans og redusere når stimulans ender.
Mens bevegelsen på grunn av overdreven væske-jet stimuli kan også flytte synaptic flyet av fokus, er denne typen bevegelse gjenstand mindre vanlig i dette flyet. I stedet er endringer i fokus i z-aksen på grunn av bevegelse eller drift av Larven de vanligste årsakene til bevegelse. Larver bevegelse eller drift kan påvirke GCaMP6s mål både på toppen og bunnen av hårcellene. Et eksempel på larver bevegelse som øker GCaMP6s i basale, synaptic flyet under stimulans er vist i Figur 4C'-C''. Bevegelse gjenstander (Figur 4C1'-C1'') kan skilles fra sant presynaptic signaler (Figur 4A2'-A2'') ved å undersøke time course of GCaMP6s signaler. I stedet for å øke eller redusere eksponentielt med stimulans (Figur 4A2'-A2''), i bevegelse-indusert økning i GCaMP6s signalet har en firkantet form og stige og falle brått med utbruddet og forskyvning av stimulus, henholdsvis ( Figur 4 C1'-C1'').
I tillegg til nøye undersøkelse av time course of GCaMP6s signaler, kan kontroll eksperimenter ved hjelp av farmakologi brukes til å skille ekte GCaMP6s signaler fra bevegelse. BAPTA (trinn 10) kan for eksempel brukes til å holde seg tips-koblinger som kreves for MET kanal funksjon i hår bunter. BAPTA bør fjerne både væske-jet-utløste apikale MET-kanal-avhengige kalsium tilstrømningen samt etterfølgende basale, presynaptic kalsium tilstrømningen gjennom Cav1.3 kanaler. I eksemplet representant sant stimulans-utløste kalsium signaler (Figur 4A1-A2'') under væske-jet stimulering, alle endringer i GCaMP6s fluorescens i begge apikale og basal flyene vil bli eliminert etter BAPTA behandling. I kontrast, endringer i GCaMP6s fluorescens pga bevegelse som de som vises i tall 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1'' ville ikke bli eliminert av BAPTA behandling.
I tillegg til BAPTA for å eliminere alle stimulans-utløste GCaMP6s signaler, isradipine kan brukes (trinn 11) spesielt blokkere Cav1.3-avhengige kalsium tilstrømning basale synaptic flyet samtidig la apikale MET-kanal-avhengige kalsium tilstrømningen intakt5. Etter bruk av isradipine, i en enkelt neuromast med noen bevegelse gjenstander, endringer i GCaMP6s fluorescens i apikale hår bunter (Figur 4A1'-A1'') under væske-jet stimulering ville være uendret, mens alle synaptic GCaMP6s fluorescens endringer på basen ville bli eliminert (Figur 4A2'-A2''). Endringer i GCaMP6s signalet i synaptic flyet etter isradipine program (f.eks,Figur 4C1-C1'') vil mest sannsynlig tilsvarer bevegelse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig1.jpg"> Figur 1 : Oversikt over en lateral linje neuromast og funksjonelle tenkelig fly. (A) i diagrammet til venstre viser en side-visning av en neuromast med fire hår-cellen legemer (svart) kontakter postsynaptic afferente neurons (blå). Bånd (grønn) tjore blemmer på presynaptic aktive nettsteder i hver celle. Apikale hver celle kroppen er en bunt med stereocilia (1 µm) som inneholder MET kanaler. Hver håret bunt har en kinocilium som overfører mekanisk kraft av vann bevegelse på undersiden av håret bunt. Diagrammet til høyre viser den samme modellen i en topp-ned visning. I denne topp-ned visning, svart brukes til å indikere fire cellene i diagrammet til venstre og grå brukes til å angi andre celler i neuromast. Tre viktige fly utheves i denne modellen, og disse 2 visninger: (1) tips av hår bunter (kinocilia) brukt om å kvantifisere omfanget av håret bunt utslag, (2) apikale MET flyet ved foten av hår bunter der kalsium inn cellen under stimulering, og (3) synaptic flyet på bunnen av cellen der kalsium inn nær synaptic bånd. (B1-B1') DIC og GCaMP6s ovenfra og ned bilder av MET flyet ved foten av hår bunter, hvor mechanosensation-avhengige kalsium signaler kan registreres. (B2-B2 ") DIC og GCaMP6s ovenfra og ned bilder fra den samme neuromast som B1-B1', men ved foten av neuromast i synaptic flyet, der presynaptic kalsium signaler kan oppdages. (C1-C2) Bilder av en neuromast uttrykke GCaMP6s hvor larvene er montert. I dette eksemplet er apikale MET flyet (C1) og synaptic flyet (C2) på bunnen av cellen plassert på en suboptimal vinkel. Denne posisjonen ikke tillater alle hår bunter til å avbildes i et enkelt fly, og mange flere tenkelig fly er nødvendig for å fange aktivitet på alle synapser i denne neuromast forhold til B1-B2 ". Bildene er av larver på 5 dpf. Baren skala i C2 tilsvarer alle bilder i B1-C2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig2.jpg"> Figur 2 : Imaging kammer, sebrafisk montering og hjerte injeksjon prosedyrer og nåler. (A) vist er en tenkelig kammer med en larve (uthevet av et stiplet rektangel) festet til midten på toppen av silikon encapsulant. (B1) Vist er en 5 dpf Larven immobilisert av to pinner. En stor leder pin er plassert vinkelrett kroppen bare bakenfor øyet. De to øynene er helt lagt så bunnen øyet er helt skjult av øvre øyet. En liten hale pin krysser notochord i halen. Larven er flat og ikke vridd. (B2) For å lamme Larven, en hjertet injeksjon nål er orientert vinkelrett til kroppen og brakt tilstøtende til hjertet. Hjertet injeksjon nålen bør kontakte pigment cellen foran hjertet. (B2 ") Depresjon nålen inn i huden forårsaker innrykk av pigment cellen foran hjertet. (C) nåler i rekkefølge fra venstre til høyre: eksempel på en hjertet injeksjon nål med en åpning på ca 3 µm; eksempel på en god væske-jet nål med en åpning på ca. 50 µm; eksempel på en dårlig brutt væske-jet nål som er store og taggete og vil trolig produsere overdreven og uregelmessig stimuli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig3.jpg"> Figur 3 : Væske-jet justering, posisjonering og stimulans kalibrering. (A1) Vist er en larve orientert med det hodet mot venstre og hale til høyre, og en væske-jet nål orientert parallelt med A-P aksen av sebrafisk kroppen. Denne væsken-jet p justeres for å stimulere neuromasts som reagerer på fremre (push/trykk) og bakre (trekk/vakuum) regissert væske-flow. (A2) Vist er en neuromast (uthevet med stiplet hvit linje) og tips av apikale hår bunter (kinocilia) på venstre side panelet og væske-jet nålen på høyre side av panelet. Væske-jet er plassert ca 100 µm fra kanten av neuromast. (A3-A3'' ') Tips av apikale hår bunter (kinocilia) er forandret retning ulik avstand ved å variere væske-jet stimulans press. Banen av et enkelt kinocilial tips vises for 1,5 µm (A3') og 5 µm (A3'') nedbøyning avstander. Den svarte sirkelen angir hvile posisjon i kinocilium. Det er viktig at kinocilia ikke er forandret retning for langt, ellers stimulans intensiteten ikke kan kvantifiseres pålitelig og kan bli ødeleggende (A3'' '). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig4.jpg"> Figur 4 : Apikale MØTTE og basale presynaptic GCaMP6s signaler under væske-jet stimulering i sidelinjen hårcellene. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet endringer under væske-jet stimulering i en representant neuromast. Bildene til venstre viser apikale MET flyet (A1) og basale synaptic flyet (A2) i den samme neuromast. ROIs fargekodet i A1 og A2 ble brukt til å tegne den gang løpet av (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre for hvert bilde. (B1-B1'') Eksempel på en apikale MET bildesekvens med overflødig bevegelse under væske-jet stimulering. Bildet til venstre (B1) viser ROIs til plottet (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre. (C1-C1'') Eksempel på en bildesekvens i basale synaptic flyet som viser bevegelse gjenstander og GCaMP6s signal endringer som ikke er sanne kalsium signaler. Bildet til venstre (C1) viser ROIs til plottet (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre. Den grå boksen i hvert diagram representerer varigheten av væske-jet stimulans under hver bildesekvens. En 2-s 5 Hz væske-jet stimulans ble brukt for eksempel i A1-A2'' and B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s fremre trinn stimulans ble brukt. Y-aksen for (F) GCaMP6s grafer viser vilkårlig enheter (A.U.) fra Fiji bilde intensitet målinger. Eksempler er fra larver på 4-5 dpf. Skala bar = 5 µm for alle bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig5.jpg"> Figur 5 : Spatiotemporal visualisering av presynaptic GCaMP6s signaler under væske-jet stimulering. Trinnene for å visualisere spatiotemporal endringene i GCaMP6s intensitet i en neuromast under stimulans er beskrevet. Tid er representert fra venstre til høyre etter tidsangivelsen på toppen av bilder. Den øverste raden viser 5 av 14 timelige hyllene fra en 70-ramme GCaMP6s (F) bildesekvens (trinn 13.2.1). I den andre raden, er opprinnelige (trinn 13.2) fjernet fra hvert (F) GCaMP6s binned bilde til å lage ΔF bilder (trinn 13.2.2). I den tredje raden, ΔF bilder har blitt konvertert fra gråtone (andre rad) til Red Hot LUT (trinn 13,3). Min og max på bildene LUT settes ifølge Red Hot LUT varmekartet av relativ ΔF intensitet (A.U.) til høyre (trinn 13.3.1). I den nederste raden har i tredje rad vært kledde på bildene (F) i den øverste raden (trinn 13,4). Den grå linjen øverst på figuren indikerer tidsberegningen for 2-s 5 Hz væske-jet stimulans. Eksempel er fra en 5 dpf larver. En legende av Red Hot LUT varmekart over relativ ΔF intensitet (A.U.) vises til høyre. Skala bar = 5 µm for alle bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalsium bildebehandling av Lateral linje hårcellene i larver sebrafisk

Sebrafisk er en modell som har mange verdifulle funksjoner inkludert optisk klarhet, raske eksterne utviklingen, og spesielt viktig å høre og balanse, eksternt ligger sensoriske hårcellene. Denne artikkelen beskriver hvordan transgene sebrafisk kan brukes til analysen både hår-cellers mechanosensation og presynaptic-funksjonen i toto.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Denne metoden kan bidra til å besvare grunnleggende spørsmål innen hørsel og balanse. Den beskriver hvordan man oppdager to viktige aspekter ved sensorisk hårceller funksjon, mechanotransduction og presynaptic aktivitet. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den tillater oss å visualisere funksjonen til hårceller i et levende dyr, og å studere hvordan samlinger av hårceller oppdager og overfører sensorisk informasjon.For å begynne denne prosedyren, bruk fine tang og wolframtråd for å mote pinnene som skal brukes til å immobilisere larven gjennom hodet og halen, på herdet innkaps. For å lage hodepinner, hold et stykke 0,035 millimeter wolframtråd i den ene hånden. Ved hjelp av fine tang i den annen side, bøy ledningen en millimeter opp fra enden, ved 90 grader.Bytt tang for fin saks, og kutt en millimeter etter svingen, for å lage pinnen. Bruk deretter tang til å sette pinnene inn i den herdede innkapslingen på kammeret. Plasser larven i midten av perfusjonskammeret slik at den ligger flatt på siden mot silikonkaps.Bruk fine tang, ta 0,035 millimeter hodepinne ned vinkelrett på larven. Sett hodepinnen mellom øyet og otic vesikkelen, og ned i innkapslet. Bruk et annet sett med tang for å stabilisere larven langs sin dorsal og ventral side, mens du fester.Pass på at den horisontale delen av stiften kommer i kontakt med larven og ikke trykker helt inn i innkapsle. Vinkle pinnen ventrikt, eller peker litt mot larvens fremre, for å unngå å forstyrre påfølgende hjerteinjeksjon og hårcelleavbildning. Bruk tangen til å sette inn en 0,025 millimeter halepinne i notochord, så nært som mulig til enden av halen.For å injisere alfa bungarotoksin i larven, fyll tre mikroliter av oppløsningen inn i injeksjonsnålen, ved hjelp av en gellastende pipettespiss. Legg løsningen jevnt til spissen, uten bobler. Sett deretter hjerteinjeksjonsnålen inn i en pipetteholder festet til en manuell mikromanipulator.Under et stereomikroskop plasserer du nålen slik at den er justert vinkelrett på AP-aksen til den bedøvede larven, og peker ned i en vinkel på 30 grader. Deretter kobler du pipetteholderen til trykkinjektoren. Injiser en bolus av alfa bungarotoxin i løsningen, for å teste om nålespissen er klar.Hvis ingen rød farge er sett, veldig forsiktig skrape nålespissen mot kanten av en pinne, og prøv igjen, til nålen er klar. Deretter, fremme nålen mot hjertet, til den berører huden utenfor hjertet. Trykk nålen inn i larven, og se etter innrykk av pigmentcellen på huden foran hjertet for å sikre at nålen er plassert i riktig plan, i forhold til larven.Deretter, fremme nålen lenger, til den pierces huden og kommer inn i hjertehulen. Trekk nålen litt tilbake, og injiser en bolus av alfa bungarotoxin inn i hjertehulen. Se etter inflasjon av hjertehulen, eller for rødt fargestoff inn i hulrommet.Skyll larven forsiktig tre ganger, med en milliliter nevronal buffer for å fjerne gjenværende MS222. Fjern aldri all væsken. Oppretthold larven i ca. 1 millileter nevronal buffer i perfusjonskammeret.I denne prosedyren tilbakefylling 10 mikroliter neronal buffer i en riktig ødelagt væske-jet nål ved hjelp av en gel lasting tips. Legg løsningen jevnt til spissen uten bobler. Sett deretter nålen inn i pipetteholderen som er festet til den motoriserte mikromanipulatoren.Plasser perfusjonskammeret i en sirkulær kammeradapter på mikroskopstadiet. Flytt det motoriserte stadiet slik at larven er i midten av synsfeltet. Deretter dreier du sirkelkammeradapteren slik at AP-tilgangen til larven er omtrent på linje med banen til væskestrålen.Bruk overført lys og differensial interferenskontrast, få larven i fokus og sentrer den under 10x-målet. Deretter heve 10x målet. Bruk den motoriserte mikromanipulatoren, ta væskestrålenålen ned i midten av synsfeltet, slik at den er opplyst av det overførte lyset og berører knapt den nevronale bufferen.Senk 10x målet å fokusere på larven for å bekrefte sin plassering. Fuous målet på væske-jet nålen. Flytt væskestrålenålen med mikromanipulatoren i x- og y-aksen til den er i en posisjon parallelt med den dorsale siden av larven.Etterpå, fokuser tilbake på larven. Ta nålen ned i z-aksen og plasser nålen langs den dorsale siden av fisken, 1 millimeter unna kroppen. Flytt forsiktig den sirkulære kammeradapteren for å sikre at væskestrålen er justert langs AP midtlinjen i larven.Deretter bytter du til 60x vannmål. Sørg for at målet er emersed i nevronal buffer. Bruk det fine fokuset til å finne en nevromast.Deretter flytter du det motariserte stadiet for å plassere den nevromast av interesse i sentrum av synsfeltet. Hold væskestrålenålspissen langs den dorsale siden av fisken. Ikke berør væskestrålenålspissen til larven eller kammeroverflaten.Plasser væskestrålenålen med mikromanipulatoren slik at den er 100 mikrometer fra den ytre kanten av nevromassen. Deretter fokuserer du opp til tuppen av de a apical hårbunter. Bunnen av væskestrålen skal være i fokus i dette planet.Still inn høyhastighetstrykkklemmen fra manuell til ekstern modus for å motta inngang fra bildeprogramvaren. Null høyhastighetstrykkklemmen ved å trykke på nullknappen, og bruk settpunktknappen til å stille hviletrykket litt positivt. Bekreft hvileeffekten til trykkklemmen med høy hastighet ved hjelp av et PSI-manometer festet til utgangseffekten på hodetrinnet.For å bestemme trykket som trengs for å stimulere hårbunter, bruk en teststimulans med en 0,125 og 0,25 volts utgang for 200-500 millisekunder. For hver test stimulans, måle avstanden av nedbøyning av tuppene av hårbundles, kinocilia. Velg et trykk som flytter buntene en avstand på ca. 5 mikrometer.Sørg for at tuppene av kinocilia forblir i fokus hele tiden. Hvis du vil anskaffe bilder med ett plan, velger du en stimulans som skal levere under 80-rammeoppkjøpet, etter ramme 30, på 3 sekunder. For å måle mekanosensitive kalsiumresponser, fokuser på bunnen av de a apiske hårbunter og start bildeoppkjøp.For å måle presynaptiske kalsiumresponser, fokuser på bunnen av hårcellene og start bildeoppkjøp. Trinnene for å visualisere de spatiotemporale endringene i GCaMP6S intensitet, i en nevromast under simulering, er skissert her. Tiden er representert fra venstre til høyre i henhold til tidsstempelet.Den øverste raden viser fem av de fjorten timelige hyllene fra en 70-ramme GCaMP6S F bildesekvens. I den andre raden er grunnlinjen fjernet fra hvert GCaMP6S F-binned-bilde for å opprette delta F-bilder. I tredje rad har delta F-bilder blitt konvertert fra gråskala til rød hot oppslagstabell.I den nederste raden er den tredje raden lagt over på F-bildene i den øverste raden. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å sørge for at larven er festet riktig og å bruke passende kontroller, som beskrevet i manuskriptet for å utelukke bevegelsesartefakter fra dataene dine. Arbeid med alfa bungarotoxin kan være farlig.Det er viktig å ta forholdsregler, for eksempel bruk av hansker mens du håndterer den.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings i Indre ørehår celler isolert fra sebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forebrain Elektrofysiologisk opptak i larve Sebrafisk

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Aktivitet av bakre laterale linje afferent nevroner under svømming i sebrafisk

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalerbar modell for å studere effekten av stump kraftskade hos voksen sebrafisk

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus i Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et assosiativt læringsverktøy for kognitiv vurdering i lærings- og minnestudier ved hjelp av voksen sebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...