Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIDCD intramural pesquisa fundos 1ZIADC000085-01 (K.S.K). Gostaríamos de agradecer a Candy Wong por sua assistência em escrever a macro de Fiji. Também gostaríamos de agradecer a Doris Wu e Candy Wong por suas sugestões úteis com o protocolo.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Imagens in vivo em animais intactos é inerentemente um desafio. Várias etapas neste método são críticas para obtenção confiável na vivo medições de cálcio das pilhas de cabelo de linha lateral. Por exemplo, é muito importante que a larva é fixada e paralisada corretamente antes de imagens para minimizar o movimento durante a imagem latente. Movimento em excesso durante a imagem latente pode levar a mudanças na fluorescência de GCaMP6s que não são sinais de verdadeiros e não correspondem às alterações nos níveis de cálcio (p. ex., figuras 4B1'-B1 ' e -C1 4 C 1' '). Pinos de cauda podem ser colocados mais anteriormente para ajudar a minimizar o movimento, embora isto pode render mais posterior neuromasts inacessível. Além disso, após a injeção de coração, alfinetes de cabeça pode ser girados para que a parte horizontal do pin encontra-se em toda a gema. Além de alterar a posição dos pinos, também é possível usar uma harpa de cérebro-fatia em vez de pinos para imobilizar as larvas34. Quando colocado sobre as larvas corretamente, uma harpa é um adicional, potencialmente menos método invasivo de larvas de imobilização. Enquanto movimento significativo pode resultar de fixação inadequada, executar corretamente a injeção de coração para entregar a α-bungarotoxina e paralisar as larvas pode resultar em paralisia incompleta, movimento e, finalmente, artefatos de movimento. Embora comumente usados anestésicos têm sido mostrados para afetar a excitabilidade das células de cabelo zebrafish, trabalhos recentes tem demonstrado que o anestésica benzocaína não interfere com muitos aspectos da atividade das células de cabelo. Da mesma forma, o mais comumente usado anestésico que MS-222 só interfere com certos aspectos da atividade de cabelo-célula15. Portanto, devido à natureza desafiadora do α-bungarotoxina injeção, benzocaína ou aplicação de MS-222 pode provar para ser um método alternativo útil de paralisia para impedir a movimentação da larva durante a imagem latente funcional de cálcio.
Além dos desafios técnicos envolvidos no presente protocolo, nem uma amostra perfeitamente montada é inútil se a larva e células ciliadas não são saudáveis antes e durante cada experiência de imagem. Para garantir que as larvas e as células ciliadas são saudáveis, é importante que as larvas são mantidas na reserva de E3 que é livre de detritos, tais como chorions (cascas de ovos), resíduos e microrganismos. Embora a localização superficial de células de cabelo de linha lateral é vantajosa para a imagem latente, este local torna mais vulneráveis a danos celulares quando o buffer de E3 é derrubado. Um ambiente limpo e aquoso é particularmente importante para as larvas jovens (2-4 dpf) ou mutantes que não podem manter uma natação vertical Posicione e deite-se principalmente na parte inferior da caixa de Petri. Nessas situações, células de cabelo de linha lateral e a cupula protetora ao redor dos feixes de cabelo podem facilmente tornar-se comprometido. Mesmo quando começando com larvas saudáveis e células ciliadas, no decorrer de cada experimento, é fundamental para garantir que a larva tem um batimento cardíaco e o fluxo de sangue rápido. Se o fluxo sanguíneo abranda ou para, a saúde das células de cabelo pode ficar comprometida. Em preparações comprometidas envolvendo larvas insalubres ou perda de fluxo sanguíneo, morrendo pilhas de cabelo pode ser identificada várias maneiras: primeiro, pelo aparecimento de karyopyknosis ou condensação nuclear, que se manifesta como uma bolha dentro da célula sob ótica do DIC; em segundo lugar, pela retração da célula e a presença de partículas dentro do citoplasma; movendo-se rapidamente e terceiro, quando forma dicas splay para fora em diferentes direções,35. Quando pacotes de cabelo são rompidas, a forma inclinada não mover juntos forma coesa durante a estimulação.
Esta preparação tem várias limitações menores, sendo que a preparação apenas permanece robusta para 1-3 horas depois é estabelecido. Modificações, como o uso de pinos menores ou uma cérebro-fatia harpa para imobilizar as larvas e adicionando um sistema de perfusão pode estender a vida útil desta preparação na vivo . Outra limitação é que fotobranqueamento e fototoxicidade pode ocorrer após repetidas experimentações de imagem. Uma maneira emocionante para superar este desafio é adaptar este protocolo para microscopia de luz-folha. Microscopia de luz-folha é uma maneira poderosa para reduzir a luz do foco, levando a menos fotobranqueamento e fototoxicidade36. Juntos, imobilização mais suave e menos exposição de fotografia podem ajudar a prolongar a cada sessão de imagens. Sessões mais de imagem podem ser usadas para examinar a duração total de alterações funcionais que acompanham o desenvolvimento e os processos subjacentes à autorização de cabelo-celular e regeneração após lesão. É importante salientar que, além de microscopia de luz-folha, este protocolo pode ser adaptado para outros sistemas confocal tipos (ponto-digitalização, 2-fóton e girando disco) bem como de sistemas relativamente simples widefield28,34 . Em geral, sua versatilidade torna este protocolo uma ferramenta valiosa que pode ser adaptada e usada com vários sistemas de imagem.
Enquanto este protocolo pode ser adaptado e usado com muitos sistemas de imagem, partes do presente protocolo também podem ser adaptadas e usadas (1) com outros indicadores, além de GCaMP6s e (2) a atividade de imagem em outras células sensoriais e neurônios dentro zebrafish larval. Por exemplo, em um estudo anterior, usamos este protocolo para atividade de imagem usando vários indicadores geneticamente codificados dentro das células de cabelo de linha lateral para detectar o cálcio citosólico (RGECO1), fusão de vesículas (SypHy), voltagem da membrana (Bongwoori) e membrana cálcio (jRCaMP1a-lipidação e GCaMP6s-lipidação) e a linha lateral aferentes processos para detectar membrana cálcio (GCaMP6s-lipidação)5. Com base na nossa experiência utilizando estes indicadores, a linha transgênica que TG(myo6b:gcamp6s-CAAX) descrito neste protocolo oferece um excelente começo para atividade em linha lateral neuromasts de imagem. De todos os indicadores listados acima, nós encontramos que o GCaMP6s é o mais sensível e fotoestável. Além desses recursos, destacamos a linha transgênica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) porque ele pode ser usado para fazer duas medições distintas: cabelo-célula mechanosensation e cálcio pré-sináptica dentro de uma única linha de transgénico.
A técnica descrita neste artigo demonstra como imagem de cálcio na linha lateral do zebrafish pode ser um poderoso método para estudar a forma como células ciliadas funcionam em seu ambiente nativo. Esta abordagem é complementar aos estudos de mamíferos no qual cabelo-célula função atualmente está sendo estudada em explantes ex vivo . Além disso, o modelo de zebrafish pode continuar a ser usado como uma plataforma para testar a eficácia dos indicadores geneticamente codificados que pode então ser aplicado para examinar a atividade em células de mamíferos cabelo.

Imagem latente funcional de cálcio é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para monitorar a atividade de muitas células, simultaneamente,1. Em particular, imagem de cálcio através de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) foi mostrada para ser vantajoso, porque GECIs podem ser expressos em tipos de células específicas e localizadas subcellularly2. Na pesquisa da neurociência, essas características fizeram imagens de cálcio usando GECIs um poderoso método para definir padrões de atividade dentro de redes neuronais e medir o influxo de cálcio em sinapses individuais3,4. Aproveitando estas características, um estudo recente usou microscopia confocal e GECIs para monitorar a atividade subcellular dentro de coleções de células sensoriais do cabelo5.
Células ciliadas são mecanorreceptores que detectam estímulos som e vestibulares no ouvido interno e movimento de água local no sistema de linha lateral em aquático vetebrates6,7. Células ciliadas são muitas vezes alvo de danos ou mutações genéticas que resultam na forma mais comum de perda de audição em humanos, conhecido como perda de audição neurossensorial8,9. Portanto, é fundamental entender como esses função de células a fim de compreender como tratar e prevenir a perda de audição. Para funcionar adequadamente, células ciliadas utilizam duas estruturas especializadas chamadas feixes mechanosensory-cabelo e sinápticas fitas para detectar e transmitir estímulos, respectivamente. Pacotes de cabelo estão localizados no ápice das células ciliadas e são compostas principalmente de fina, cabelo-como saliências conhecidas como Estereocílio (Figura 1A). Nas células de cabelo vestibulares e linha lateral, cada pacote de cabelo também tem um único kinocilium longo (cílio única verdadeira da célula), que pode estender-se muito acima do Estereocílio (Figura 1A). Mechanosensory estímulos desviar feixes de cabelo, e deflexão coloca tensão sobre ligações chamadas "ponta-links" que interligam Estereocílio10. Esta tensão abre canais mechanotransduction (MET), localizados em Estereocílio, resultando em um influxo apical de cátions, incluindo cálcio11,12. Em última análise, esta atividade apical depolarizes a célula do cabelo e abre canais de cálcio voltagem-dependentes (Cav1.3) na base da célula. Canais de CAv1.3 encontram-se adjacentes para fitas sinápticas, uma estrutura pré-sináptica que amarras vesículas em zonas ativas. Influxo de cálcio basal através de canais de Cav1.3 é necessário para a fusão de vesículas, neurotransmissão e ativação dos neurônios aferentes13,14.
Por muitos anos, eletrofisiológicas técnicas como aperto de células inteiras remendo têm sido usadas para investigar as propriedades funcionais de células ciliadas em muitas espécies, incluindo zebrafish15,16,17, 1819,de,20. Estas gravações eletrofisiológicas foram particularmente valiosas no campo de audição e equilíbrio, porque eles podem ser usados para obter medições extremamente sensíveis de células sensoriais individuais, cujo objetivo é codificar estímulos extremamente rápidos sobre um ampla gama de frequências e intensidades de21,22. Infelizmente, as gravações de células inteiras não medem a atividade de populações de células ciliadas. Para estudar a atividade de populações de células na linha lateral do zebrafish, alertarão potenciais e aferentes potenciais de ação têm sido utilizados para medir a mechanosensitive somado e propriedades da resposta pós-sináptica de neuromasts individual23 ,24. Infelizmente, células inteiras gravações nem medições de potenciais de campo locais têm a resolução espacial para determinar onde a atividade está ocorrendo dentro de células individuais ou mede a atividade de cada célula dentro de uma população. Mais recentemente, corantes de cálcio e GECIs têm sido empregadas para contornar estes desafios25,26.
No zebrafish, GECIs provaram para ser uma poderosa abordagem para examinar a função do cabelo-célula devido a relativa facilidade de criação de zebrafish transgênico e a claridade ótica de larvas27. Larvas de peixe-zebra, células ciliadas estão presentes no ouvido interno, bem como o sistema da linha lateral. A linha lateral é composta de Roseta, como aglomerados de células ciliadas chamados neuromasts que são usados para detectar alterações locais no movimento de água (Figura 1). A linha lateral é particularmente útil porque está localizado externamente ao longo da superfície do peixe. Este acesso tornou possível para estimular células ciliadas e medir sinais de cálcio opticamente em larvas intactas. Em geral, a facilidade de transgênese, transparência das larvas e o acesso sem paralelo-linha lateral células fizeram zebrafish um modelo inestimável para estudar a atividade de células in vivo. Esta é uma vantagem significativa em comparação com sistemas de mamíferos em que células ciliadas estão rodeadas por estruturas ósseas do ouvido interno. Esta falta de acesso tornou muito difícil adquirir funcionais medições in vivo de células mamíferas.
O protocolo descrito aqui descreve como monitorar mudanças de canal presynapse-dependentes e MET em cálcio dentro de células individuais do cabelo e entre células dentro de neuromasts no zebrafish larval. Este protocolo utiliza uma linha estabelecida zebrafish transgênicos que expressa um GCaMP6s membrana-localizada sob o controle do promotor específico myosin6b cabelo-célula28. Esta localização de membrana posições GCaMP6s para detectar o influxo de cálcio através de canais iônicos, localizado na membrana plasmática que são críticas para a função de cabelo-célula. Por exemplo, GCaMP6s de membrana-localizada pode detectar cálcio influxo através de MET canais nos pacotes de cabelo apical e através do CaV1,3 canais perto sinápticas fitas na base da célula. Isto contrasta com o uso de GECIs localizadas no citosol, como GECIs citosólica detectam sinais de cálcio que são uma combinação de atividade de canal 1.3VMET e Ca, bem como contribuições de cálcio de outras fontes (por exemplo, lançamento de loja de, ). Este protocolo descreve como imobilizar e paralisar GCaMP6s transgénicas larvas antes da imagem latente. Ele então descreve como preparar e usar um jato de fluido para desviar os pacotes de cabelo para estimular células de cabelo de linha lateral de uma forma controlada e reprodutível. São apresentados dados representativos que podem ser alcançados usando este protocolo. Também são apresentados exemplos de dados que representam os artefatos de movimento. Experimentos de controle que são usados para verificar os resultados e excluir artefatos são descritos. Por último, um método para visualizar sinais de cálcio espacial no software Fiji é descrito. Esta análise de Fiji é uma adaptação de métodos de visualização estabelecida anteriormente desenvolvidos usando MATLAB5. Em geral, este protocolo descreve uma técnica de preparação poderoso que usa GECIs no zebrafish larval para medir e visualizar a dinâmica de cálcio cabelo células in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Células sensoriais do cabelo são mecanorreceptores encontrados no ouvido interno que são necessárias para a audição e equilíbrio. Células ciliadas são ativadas em resposta aos estímulos sensoriais que mecanicamente desviar apicais saliências chamadas pacotes de cabelo. Deflexão abre canais mechanotransduction (MET) em pacotes de cabelo, levando a um afluxo de cátions, incluindo o cálcio. Este influxo de cátion depolarizes a célula e abre canais de cálcio voltagem-dependentes basalmente localizados no presynapse do cabelo-célula. Nos mamíferos, células ciliadas são encerradas em osso, e é difícil avaliar funcionalmente estas actividades in vivo. Em contraste, o zebrafish larval são transparente e possuem um órgão localizado externamente de linha lateral que contém células ciliadas. Estas células ciliadas são funcionalmente e estruturalmente semelhantes às células dos mamíferos e pode ser funcionalmente avaliadas in vivo. Este artigo descreve uma técnica que utiliza um indicador de cálcio geneticamente codificado (Lino), GCaMP6s, para medir o cálcio evocada por estímulo sinais em células de cabelo de linha lateral de zebrafish. GCaMP6s pode ser usado, junto com a imagem latente confocal, para medir sinais de cálcio em vivo no ápice e base de células de cabelo de linha lateral. Estes sinais fornecem uma leitura em tempo real e quantificável de ambas as atividades de cálcio mechanosensation presynapse-dependentes e dentro destas células. Estes sinais de cálcio também fornecem importantes informações funcionais como células ciliadas detectam e transmitem estímulos sensoriais. Em geral, esta técnica gera dados úteis sobre mudanças relativos na atividade de cálcio in vivo. É menos well-suited para quantificação da magnitude absoluta de alterações de cálcio. Esta técnica in vivo é sensível aos artefatos de movimento. Uma quantidade razoável de prática e habilidade são necessários para o adequado posicionamento, imobilização e estimulação de larvas. Em última análise, quando executado corretamente, o protocolo descrito neste artigo fornece uma maneira poderosa para coletar informações valiosas sobre a atividade de células ciliadas em seus Estados naturais, totalmente integrados dentro de um animal vivo.

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In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish (Video) | JoVE

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Esse método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da audição e do equilíbrio. Descreve como detectar dois aspectos importantes da função das células ciliar sensoriais, mechanotransdução e atividade pré-sináptica. As principais vantagens dessa técnica são que ela nos permite visualizar a função das células ciliar em um animal vivo, e estudar como as coleções de células ciliar detectam e transmitem informações sensoriais.Para iniciar este procedimento, use fórceps finos e fio de tungstênio para moldar os pinos a serem usados para imobilizar a larva através da cabeça e cauda, no encapsulante endurecido. Para fazer pinos de cabeça, segure um pedaço de fio de tungstênio de 0,035 milímetros em uma mão. Usando fórceps finos na outra mão, dobre o fio um milímetro até o final, a 90 graus.Troque os fórceps por uma tesoura fina e corte um milímetro após a curva, para criar o pino. Em seguida, use fórceps para inserir os pinos no encapsulamento endurecido na câmara. Posicione a larva no centro da câmara de perfusão para que ela fique plana de lado contra o encapsulante de silicone.Usando fórceps finos, leve o pino de cabeça de 0,035 milímetros para baixo perpendicular para a larva. Insira o pino da cabeça entre o olho e o vesícula otic, e para baixo no encapsulante. Use um segundo conjunto de fórceps para estabilizar a larva ao longo de seu lado dorsal e ventral, enquanto fixa.Certifique-se de que a parte horizontal do pino entra em contato com a larva e não pressione todo o caminho até o encapsulante. Angule o pino ventrally, ou apontando ligeiramente para o anterior da larva, para evitar interferir com a injeção cardíaca subsequente e a imagem das células ciliar. Usando os fórceps, insira um pino de cauda de 0,025 milímetros no notochord, o mais próximo possível da extremidade da cauda.Para injetar bungarotoxina alfa na larva, enchir três microliters da solução na agulha de injeção, usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta, sem bolhas. Em seguida, insira a agulha de injeção cardíaca em um suporte de pipeta ligado a um micromanipulador manual.Sob um microscópio estéreo, posicione a agulha para que ela esteja alinhada perpendicularmente ao eixo AP da larva anestesiada, apontando para baixo em um ângulo de 30 graus. Em seguida, conecte o suporte da pipeta ao injetor de pressão. Injete um bolus de bungarotoxina alfa na solução, para testar se a ponta da agulha está clara.Se não for vista a cor vermelha, raspe delicadamente a ponta da agulha contra a borda de um pino, e tente novamente, até que a agulha esteja limpa. Posteriormente, avance a agulha em direção ao coração, até que toque a pele fora do coração. Pressione a agulha na larva e procure o recuo da célula pigmentada na pele em frente ao coração para garantir que a agulha esteja posicionada no plano correto, em relação à larva.Em seguida, avance a agulha mais longe, até perfurar a pele e entrar na cavidade cardíaca. Puxe a agulha para trás ligeiramente, e injete um bolus de bungarotoxina alfa na cavidade cardíaca. Procure a inflação da cavidade cardíaca, ou para corante vermelho entrando na cavidade.Enxágue suavemente a larva três vezes, com um mililitro de tampão neuronal para remover o MS222 residual. Nunca remova todo o fluido. Mantenha a larva em aproximadamente 1 miléseto de tampão neuronal na câmara de perfusão.Neste procedimento, enchir 10 microliter de tampão neronal em uma agulha de jato fluido devidamente quebrada usando uma ponta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta sem bolhas. Em seguida, insira a agulha no porta-pipetas ligado ao micromanipulador motorizado.Coloque a câmara de perfusão em um adaptador de câmara circular no estágio do microscópio. Mova o estágio motorizado para que a larva esteja no centro do campo de visão. Posteriormente, gire o adaptador de câmara circular para que o acesso ap à larva esteja aproximadamente alinhado com a trajetória da agulha de jato fluido.Utilizando o contraste de interferência de luz e diferencial transmitido, leve a larva ao foco e centralizá-la sob o objetivo de 10x. Então, eleve o objetivo de 10x. Usando o micromanipulador motorizado, leve a agulha de jato fluido para o centro do campo de visão, para que seja iluminada pela luz transmitida e mal toque no tampão neuronal.Abaixe o objetivo de 10x para focar na larva, a fim de confirmar sua localização. Fuous o objetivo na agulha de jato fluido. Mova a agulha de jato fluido com o micromanipulador no eixo x e y até que esteja em uma posição paralela ao lado dorsal da larva.Depois, concentre-se na larva. Abaixe a agulha no eixo z e posicione a agulha ao longo do lado dorsal do peixe, a 1 milímetro do corpo. Mova cuidadosamente o adaptador de câmara circular para garantir que a agulha de jato fluido esteja alinhada ao longo da linha média AP da larva.Em seguida, mude para o objetivo de água 60x. Certifique-se de que o objetivo está emersed no tampão neuronal. Use o foco fino para localizar um neuromas.Posteriormente, mova o estágio motarizado para colocar o neuromass de interesse no centro do campo de visão. Mantenha a ponta da agulha de jato fluida ao longo do lado dorsal do peixe. Não toque na ponta da agulha de jato fluido na larva ou na superfície da câmara.Posicione a agulha de jato fluido com o micromanipulador de modo que esteja a 100 micrômetros da borda externa do neuromass. Em seguida, foque até as pontas dos feixes de cabelo apical. A parte inferior da agulha de jato fluido deve estar em foco neste avião.Defina o grampo de pressão de alta velocidade do modo manual para o externo para receber a entrada do software de imagem. Zero o grampo de pressão de alta velocidade pressionando o botão zero e use o botão de ponto de configuração para definir a pressão de repouso ligeiramente positiva. Confirme a saída de repouso do grampo de alta velocidade usando um manômetro PSI ligado à saída do estágio da cabeça.Para determinar a pressão necessária para estimular os feixes de cabelo, aplique um estímulo de teste com uma saída de 0,125 e 0,25 volts para 200-500 milissegundos. Para cada estímulo de teste, meça a distância de deflexão das pontas dos cabeleireiros, a kinocilia. Escolha uma pressão que mova os feixes a uma distância de aproximadamente 5 micrômetros.Certifique-se de que as pontas da kinocilia permanecem em foco o tempo todo. Para adquirir imagens de plano único, selecione um estímulo para entregar durante a aquisição de 80 quadros, após o quadro 30, em 3 segundos. Para medir as respostas mecanosensíveis de cálcio, concentre-se na base dos feixes de cabelo apical e inicie a aquisição de imagens.Para medir as respostas pré-sinápticas de cálcio, concentre-se na base das células ciliares e inicie a aquisição de imagens. Os passos para visualizar as mudanças espásticas na intensidade do GCaMP6S, dentro de um neuromast durante a simulação, são descritos aqui. O tempo é representado da esquerda para a direita de acordo com o carimbo de ponto.A linha superior mostra cinco das quatorze caixas temporais de uma sequência de imagem GCaMP6S F de 70 quadros. Na segunda linha, a linha de base foi removida de cada imagem do GCaMP6S F para criar imagens delta F. Na terceira linha, as imagens delta F foram convertidas de escala cinza, para tabela de procuração quente vermelho.Na linha inferior, a terceira linha foi sobreposta às imagens F na linha superior. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para ter certeza de que a larva está presa corretamente e usar controles apropriados, como descrito no manuscrito para excluir artefatos de movimento de seus dados. Trabalhar com bungarotoxina alfa pode ser perigoso.É importante tomar precauções, como usar luvas enquanto manuseia.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

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Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

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In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin (Video) | JoVE

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive (Video) | JoVE

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish (Video) | JoVE

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish (Video) | JoVE

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo (Video) | JoVE

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...