Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
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Este trabajo fue financiado por NIH/NIDCD investigación intramuros fondos 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Nos gustaría reconocer Candy Wong para su asistencia por escrito la macro de Fiji. También nos gustaría agradecer a Doris Wu y Candy Wong por sus sugerencias con el protocolo.

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Los autores no tienen nada que revelar.

En vivo la proyección de imagen en animales intactos es inherentemente difícil. Varios pasos en este método son críticos para obtener confiable en vivo las mediciones del calcio de las células ciliadas de la línea lateral. Por ejemplo, es muy importante que la larva se cubrió y paralizada correctamente antes de la proyección de imagen para reducir al mínimo el movimiento durante la proyección de imagen. Exceso de movimiento durante la proyección de imagen puede conducir a cambios en la fluorescencia GCaMP6s que no son verdaderas señales y no corresponden a los cambios en los niveles de calcio (p. ej., figuras 4B1'-B1'' y 4 C 1' C1 '). Pernos de cola pueden colocarse más hacia delante para ayudar a minimizar el movimiento, aunque esto puede hacer más neuromasts posterior inaccesibles. Además, después de la inyección de corazón, alfileres de cabeza se puede girar para que la parte horizontal del perno se encuentra en la yema de huevo. Además de alterar la posición de los pernos, es también posible utilizar un arpa de rebanadas de cerebro en lugar de pernos para inmovilizar las larvas34. Cuando se coloca adecuadamente sobre las larvas, un arpa es un adicional, potencialmente menos invasivo método de inmovilización de las larvas. Movimiento significativo puede resultar de una fijación inadecuada, no realizar correctamente la inyección de corazón para entregar α-Bungarotoxina y paralizar las larvas puede ocasionar parálisis incompleta, movimiento y artefactos de movimiento en última instancia. Aunque los anestésicos comúnmente utilizados se ha demostrado que afectan la excitabilidad de las células de pelo del pez cebra, trabajo reciente ha demostrado que la benzocaína anestésica no interfiere con muchos aspectos de la actividad de la célula de pelo. Del mismo modo, más de uso general anestésico que MS-222 sólo interfiere con ciertos aspectos de la célula de pelo actividad15. Por lo tanto, debido a la naturaleza desafiante de la inyección de α-Bungarotoxina, benzocaína o aplicación de MS-222 puede resultar para ser un método útil de la alternativa de la parálisis para evitar el movimiento de la larva durante la proyección de imagen funcional del calcio.
Además de los desafíos técnicos involucrados en el presente Protocolo, incluso una muestra perfectamente montada es inútil si la larva y las células de pelo no son saludables antes y durante cada experimento proyección de imagen. Para asegurar que las larvas y las células de pelo sanas, es importante que las larvas se mantienen en buffer de E3 que está libre de desechos tales como chorions (cáscaras de huevo), residuos y microorganismos. Aunque la localización superficial de las células ciliadas de la línea lateral es ventajosa para la proyección de imagen, esta ubicación hace más vulnerables al daño celular cuando el búfer de E3 es sucia. Un ambiente limpio y acuoso es especialmente importante para las larvas jóvenes (2-4 dpf) o mutantes que no pueden mantener una piscina vertical posición y principalmente se encuentran en la parte inferior de la caja Petri. En estas situaciones, las células ciliadas de la línea lateral y el cupula Protecto que rodea los haces de pelo pueden fácilmente ser comprometidos. Aun cuando a partir de larvas sanas y las células de pelo, en el transcurso de cada experimento, es fundamental para que la larva tiene un latido del corazón y el flujo sanguíneo rápido. Si el flujo sanguíneo disminuye o se detiene, la salud de las células de pelo puede ser comprometida. En preparados comprometidos con larvas insalubres o pérdida del flujo sanguíneo, mueren las células de pelo puede identificarse varias formas: primero, por la aparición de karyopyknosis o condensación nuclear, que se manifiesta como una burbuja dentro de la célula bajo la óptica de la DIC; en segundo lugar, por la contracción de la célula y la presencia de mover rápidamente las partículas dentro del citoplasma; y tercero, cuando quinocilios consejos splay hacia fuera en diversas direcciones35. Cuando se interrumpen los paquetes del pelo, los quinocilios extendidas no acercan coherente durante la estimulación.
Esta preparación tiene varias limitaciones menores, uno de ellos que la preparación sólo sigue siendo robusta durante 1-3 horas después de que se establezca. Modificaciones como el uso de pernos más pequeños o una tajada de cerebro arpa para inmovilizar las larvas y un sistema de perfusión puede extender la vida útil de este preparado en vivo . Otra limitación es fotoblanqueo y fototoxicidad puede ocurrir después de repetidos ensayos de imagen. Una forma emocionante para superar este desafío es adaptar este protocolo para microscopía de luz de hoja. Microscopía de luz de hoja es una manera poderosa para reducir fuera de luz del foco, a menos de fotoblanqueo y fototoxicidad36. Juntos, inmovilización más apacible y menos exposición foto pueden ayudar a prolongar cada sesión de imagen. Sesiones de más proyección de imagen pueden utilizarse para examinar la duración completa de los cambios funcionales que acompañan el desarrollo y los procesos de separación de la célula de pelo y la regeneración después de lesión. Es importante señalar que, además de microscopía de luz de hoja, este protocolo puede ser adaptado a otros sistemas confocales de tipos (disco análisis de punto de 2 fotones y spinning) así como sistemas relativamente simples widefield28,34 . En general, su versatilidad lo hace una herramienta valiosa que puede ser adaptada y utilizada con múltiples sistemas de proyección de imagen de protocolo.
Si bien este protocolo puede ser adaptado y utilizado con muchos sistemas de proyección de imagen, partes de este protocolo pueden adaptadas y utilizadas (1) con otros indicadores además de GCaMP6s y (2) actividad de imagen en otras células sensoriales y las neuronas dentro de pez cebra larval. Por ejemplo, en un estudio anterior, utilizamos este protocolo a la actividad de la imagen utilizando varios indicadores genético codificados dentro de las células ciliadas de la línea lateral para detectar calcio citosólico (RGECO1), fusión de la vesícula (SypHy), voltaje de membrana (Bongwoori) y membrana calcio (caax jRCaMP1a y GCaMP6s-caax) y dentro de los procesos aferentes de la línea lateral para detectar membrana calcio (GCaMP6s-caax)5. Basándonos en nuestra experiencia usando estos indicadores, la línea transgénica que TG(myo6b:gcamp6s-caax) se describe en este protocolo ofrece un excelente comienzo para la actividad en la línea lateral neuromasts la proyección de imagen. De todos los indicadores mencionados, hemos encontrado que GCaMP6s es el más sensible y Fotoestables. Además de estas características, podemos destacar la línea transgénica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) porque puede ser utilizado para realizar dos mediciones distintas: calcio presináptico dentro de una línea transgénica y mechanosensation célula de pelo.
La técnica que se describe en este artículo muestra cómo la proyección de imagen de calcio en la línea de lateral del pez cebra puede ser un poderoso método para estudiar cómo funcionan las células de pelo en su ambiente nativo. Este enfoque es complementario a los estudios de los mamíferos en que célula de pelo función actualmente está siendo estudiada en explantes de ex vivo . Además, el modelo de pez cebra puede continuar ser utilizado como una plataforma para probar la eficacia de indicadores genético codificados que puede aplicarse para examinar la actividad en mamíferas células de pelo.

La proyección de imagen funcional del calcio es una poderosa herramienta que puede utilizarse para supervisar la actividad de muchas células simultáneamente1. En particular, la proyección de imagen de calcio utilizando indicadores genético codificados calcio (GECIs) ha demostrado ser ventajosa porque GECIs puede expresarse en tipos celulares específicos y localizados subcellularly2. En la investigación de la neurociencia, estas características han hecho imágenes de calcio utilizando GECIs un poderoso método para definir patrones de actividad dentro de las redes neuronales tanto medir la afluencia del calcio en la sinapsis individuales3,4. Aprovechando estas características, un estudio reciente utiliza la microscopia confocal y GECIs para supervisar actividad subcelular dentro de colecciones de células de pelo sensoriales5.
Las células de pelo son los mecanorreceptores que detectan estímulos de sonido y vestibulares en el oído interno y el movimiento de agua en el sistema de línea lateral en acuáticos vetebrates6,7. Las células de pelo son a menudo objetivo de daños o mutaciones genéticas que resultan en la forma más común de pérdida de audición en los seres humanos conocida como pérdida de oído sensorineural8,9. Por lo tanto, es fundamental para entender cómo estos función de las células con el fin de entender cómo tratar y prevenir la pérdida de la audición. Para funcionar adecuadamente, las células de pelo utilizan dos estructuras especializadas llamados paquetes mechanosensory-pelo y cintas sinápticas para detectar y transmitir estímulos, respectivamente. Paquetes del pelo se encuentran en el ápice de las células ciliadas y se componen principalmente de protuberancias finas, como pelos, conocidas como estereocilios (figura 1A). En las células de pelo vestibulares y de la línea lateral, cada paquete de pelo también tiene una sola kinocilium largo (cilio único y verdadero de la célula), que puede extenderse muy por encima de los estereocilios (figura 1A). Estímulos de Mechanosensory desvían paquetes del pelo, y desviación pone tensión en los vínculos que se llama "punta-links" que interconectan estereocilios10. Esta tensión abre canales de mecanotransducción (MET), situados en los estereocilios, dando por resultado una afluencia apical de cationes como calcio11,12. Esta actividad apical finalmente despolarizan la célula de pelo y abre canales de calcio voltaje-bloqueado (Cav1.3) en la base de la célula. Canales de CAv1.3 se encuentran adyacentes a cintas sinápticas, una estructura presináptica que anclar las vesículas en zonas activas. Afluencia del calcio basal a través de canales de Cav1.3 es necesario para la fusión de la vesícula, la neurotransmisión y la activación de neuronas aferentes13,14.
Durante muchos años, se han utilizado técnicas electrofisiológicas como parche de células completas de sujeción para probar las propiedades funcionales de las células de pelo en muchas especies, incluyendo peces cebra15,16,17, 1819,de,20. Estas grabaciones electrofisiológicas han sido particularmente valiosas en el campo de la audición y el equilibrio porque pueden ser utilizados para obtener mediciones extremadamente sensibles de las células sensoriales individuales, cuyo propósito es codificar estímulos extremadamente rápidos sobre un amplia gama de frecuencias e intensidades de21,22. Por desgracia, grabaciones de celulares no pueden medir la actividad de las poblaciones de células de pelo. Para estudiar la actividad de las poblaciones de células en la línea lateral del pez cebra, potenciales microfónicos de la coclea y los potenciales de acción aferentes se han utilizado para medir las propiedades de la respuesta postsináptica de neuromasts individuales23 y mechanosensitive sumado ,24. Lamentablemente, ni grabaciones de celulares ni mediciones de potenciales de campo locales tienen la resolución espacial para determinar donde la actividad está ocurriendo dentro de células individuales o medir la actividad de cada célula dentro de una población. Más recientemente, calcio tintes y GECIs han sido empleados para eludir estos problemas25,26.
En el pez cebra, GECIs han demostrado para ser un poderoso enfoque para examinar la función de la célula de pelo debido a la relativa facilidad de creación de pez cebra transgénico y la claridad óptica de larvas27. En larvas de pez cebra, las células ciliadas están presentes en el oído interno, así como el sistema de línea lateral. La línea lateral se compone de rosetón-como racimos de células de pelo llamados neuromasts que se utilizan para detectar los cambios locales en el movimiento del agua (figura 1). La línea lateral es particularmente útil ya que se encuentra externamente a lo largo de la superficie de los peces. Este acceso ha hecho posible estimular las células de pelo y medir señales de calcio ópticamente en larvas intactas. En general, la facilidad de transgénesis, transparencia de las larvas y el acceso sin precedentes de las células ciliadas de la línea lateral han hecho pez cebra un modelo valioso para estudiar la actividad de las células de pelo en vivo. Esto es una ventaja significativa en comparación con sistemas de mamíferos en el que las células ciliadas están rodeadas por estructuras óseas del oído interno. Esta falta de acceso ha hecho muy difícil adquirir funcionales medidas en vivo de mamíferas células de pelo.
El protocolo descrito aquí describe cómo monitorizar los cambios de canal y presynapse dependiente MET en calcio dentro de las células de pelo individuales y entre las células dentro de neuromasts en pez cebra larvas. Este protocolo utiliza una línea establecida de pez cebra transgénico que expresa una GCaMP6s localizada en la membrana bajo el control de la célula de pelo específicos myosin6b promotor28. Esta localización de membrana posiciones GCaMP6s para detectar la afluencia de calcio a través de canales iónicos situados en la membrana plasmática que son críticos para la función de la célula de pelo. Por ejemplo, GCaMP6s localizados en la membrana puede detectar calcio afluencia mediante MET canales en paquetes del pelo apical y a través de CaV1,3 canales cerca de cintas sinápticas en la base de la célula. Esto contrasta con el uso de GECIs localizadas en el citosol, como citosólicas GECIs detectan señales de calcio que son una combinación de MET y CaV1.3 canal actividad, así como aportes de calcio de otras fuentes (por ejemplo,, tienda soltar). Este protocolo describe cómo inmovilizar y paralizar larvas transgénicas GCaMP6s antes de la proyección de imagen. Luego describe cómo preparar y utilizar un chorro de fluido a los paquetes del pelo para estimular las células ciliadas de la línea lateral en una manera controlada y reproducible. Se presentan datos representativos que pueden lograrse utilizando este protocolo. También se presentan ejemplos de datos que representan los artefactos de movimiento. Se describen los experimentos de control que se utilizan para verificar los resultados y excluir artefactos. Por último, se describe un método para visualizar las señales de calcio espacial en el software de Fiji. Este análisis de Fiji es adaptado de métodos de visualización establecido previamente desarrollados usando MATLAB5. En general, este protocolo describe una técnica de preparación de gran alcance que utiliza GECIs en pez cebra larval para medir y visualizar la dinámica de calcio de la célula de pelo en vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensorial de las células ciliadas son mecanorreceptores encontradas el oído interno que se requieren para la audición y el equilibrio. Las células ciliadas se activan en respuesta a estímulos sensoriales que mecánicamente se desvíe apicales salientes llamados paquetes del pelo. Desviación abre canales de mecanotransducción (MET) en paquetes del pelo, conduciendo a una afluencia de cationes como el calcio. Esta afluencia de cationes despolarizan la célula y abre canales de calcio voltaje-bloqueado basally situados en la presynapse de la célula de pelo. En los mamíferos, las células de pelo son en hueso, y es un reto para evaluar funcionalmente estas actividades en vivo. Por el contrario, pez cebra larvas son transparente y poseen un órgano de línea lateral situado externamente que contiene células de pelo. Estas células de pelo son funcionalmente y estructuralmente similares a las células mamíferas del pelo y puede ser evaluadas funcionalmente en vivo. Este artículo describe una técnica que utiliza un indicador de calcio genéticamente codificados (GECI), señales de GCaMP6s, para medir calcio evocado por el estímulo en pez cebra células de pelo de la línea lateral. GCaMP6s puede utilizarse, junto con la proyección de imagen confocal, para medir señales de calcio in vivo en el ápice y la base de las células ciliadas de la línea lateral. Estas señales proporcionan una lectura en tiempo real, cuantificable de ambas actividades de calcio dependientes de presynapse y mechanosensation dentro de estas células de pelo. Estas señales de calcio también proporcionan importante información funcional acerca de cómo las células de pelo detectar y transmitir estímulos sensoriales. En general, esta técnica genera datos útiles sobre los cambios relativos en la actividad de calcio en vivo. Es menos adecuado para la cuantificación de la magnitud absoluta de los cambios del calcio. Esta técnica in vivo es sensible a los artefactos de movimiento. Una cantidad razonable de práctica y habilidad se requieren para la colocación apropiada, inmovilización y estimulación de las larvas. En última instancia, cuando se ejecuta correctamente, el protocolo descrito en este artículo proporciona una manera de gran alcance para recopilar información valiosa sobre la actividad de las células de pelo en su estado natural, completamente integrado dentro de un animal vivo.

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In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

El pez cebra es un modelo de sistema que tiene muchas características valiosas, incluyendo claridad óptica, desarrollo externo rápido y, de especial importancia para el campo de la audición y el equilibrio, situado externamente células de pelo sensoriales. Este artículo describe cómo transgénico pez cebra puede utilizarse para análisis función presináptica y mechanosensation célula de pelo en su totalidad.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo de la audición y el equilibrio. Describe cómo detectar dos aspectos importantes de la función de las células pilosas sensoriales, la mecanotransducción y la actividad presináptica. Las principales ventajas de esta técnica son que nos permite visualizar el funcionamiento de las células pilosas en un animal vivo, y estudiar cómo las colecciones de células pilosas detectan y transmiten información sensorial.Para comenzar este procedimiento, utilice fórceps finos y alambre de tungsteno para crear los pines que se utilizarán para inmovilizar la larva a través de la cabeza y la cola, en el encapsulante endurecido. Para hacer pasadores de cabeza, sostenga un pedazo de alambre de tungsteno de 0.035 milímetros en una mano. Usando fórceps finos en la otra mano, doble el alambre un milímetro hacia arriba desde el extremo, a 90 grados.Cambie los fórceps por tijeras finas, y corte un milímetro después del pliegue, para crear el pasador. A continuación, utilice fórceps para insertar los pasadores en el encapsulado endurecido en la cámara. Coloque la larva en el centro de la cámara de perfusión de modo que quede plana de lado contra el encapsulante de silicona.Usando fórceps finos, lleve el pasador de cabeza de 0.035 milímetros hacia abajo perpendicular a la larva. Inserte el pasador de la cabeza entre el ojo y la vesícula otic, y hacia abajo en el encapsulante. Utilice un segundo conjunto de fórceps para estabilizar la larva a lo largo de su lado dorsal y ventral, mientras se fija.Asegúrese de que la parte horizontal del pasador entra en contacto con la larva y no presiona todo el camino en el encapsulante. Angulo el pasador ventralmente, o apuntando ligeramente hacia la parte anterior de la larva, para evitar interferir con la inyección cardíaca posterior y las imágenes de las células pilosas. Usando los fórceps, inserte un pasador de cola de 0.025 milímetros en el notochord, lo más cerca posible del extremo de la cola.Para inyectar alfa bungarotoxina en la larva, rellene tres microlitros de la solución en la aguja de inyección, utilizando una punta de pipeta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente en la punta, sin burbujas. A continuación, inserte la aguja de inyección cardíaca en un soporte de pipeta unido a un micromaniprógrafo manual.Bajo un microscopio estéreo, coloque la aguja de modo que esté alineada perpendicularmente al eje AP de la larva anestesiada, apuntando hacia abajo en un ángulo de 30 grados. A continuación, conecte el soporte de la pipeta al inyector de presión. Inyectar un bolo de alfa bungarotoxina en la solución, para comprobar si la punta de la aguja está clara.Si no se ve ningún color rojo, raspe suavemente la punta de la aguja contra el borde de un alfiler, e inténtelo de nuevo, hasta que la aguja esté limpia. Posteriormente, avance la aguja hacia el corazón, hasta que toque la piel fuera del corazón. Presione la aguja en la larva y busque la sangría de la célula pigmentaria en la piel delante del corazón para asegurarse de que la aguja se coloca en el plano correcto, en relación con la larva.Luego, avance la aguja más lejos, hasta que perfore la piel y entre en la cavidad cardíaca. Tire de la aguja hacia atrás ligeramente, e inyecte un bolo de alfa bungarotoxina en la cavidad cardíaca. Busque la inflación de la cavidad cardíaca, o el tinte rojo que entra en la cavidad.Enjuague suavemente la larva tres veces, con un mililitro de tampón neuronal para eliminar el MS222 residual. Nunca retire todo el líquido. Mantener la larva en aproximadamente 1 milímetro de tampón neuronal en la cámara de perfusión.En este procedimiento rellene 10 microlitros de tampón neronal en una aguja de chorro de fluido correctamente rota utilizando una punta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente en la punta sin burbujas. A continuación, inserte la aguja en el soporte de la pipeta unido al micromaniprógrafo motorizado.Coloque la cámara de perfusión en un adaptador de cámara circular en la etapa del microscopio. Mueva la etapa motorizada para que la larva esté en el centro del campo de visión. Posteriormente, gire el adaptador de cámara circular para que el acceso AP a la larva esté más o menos alineado con la trayectoria de la aguja de chorro de fluido.Usando el contraste de luz y interferencia diferencial transmitida, ponga la larva en el foco y céntrela bajo el objetivo 10x. A continuación, suba el objetivo 10x. Usando el micromaniprógrafo motorizado, baje la aguja de chorro de fluido al centro del campo de visión, para que se ilumine por la luz transmitida y apenas toque el tampón neuronal.Bajar el objetivo 10x para centrarse en la larva con el fin de confirmar su ubicación. Fuous el objetivo en la aguja de chorro de fluido. Mueva la aguja de chorro de fluido con el micromaniprulador en el eje X e Y hasta que esté en una posición paralela al lado dorsal de la larva.Después, concéntrate en la larva. Lleve la aguja hacia abajo en el eje z y coloque la aguja a lo largo del lado dorsal del pez, a 1 milímetro del cuerpo. Mueva con cuidado el adaptador de cámara circular para asegurarse de que la aguja de chorro de fluido esté alineada a lo largo de la línea media AP de la larva.A continuación, cambie al objetivo de agua 60x. Asegúrese de que el objetivo se emeje en el búfer neuronal. Usa el enfoque fino para localizar a un neuromasta.Posteriormente mueva la etapa motarizada para colocar el neuromasta de interés en el centro del campo de visión. Mantenga la punta de la aguja de chorro de líquido a lo largo del lado dorsal del pez. No toque la punta de la aguja de chorro de fluido a la larva o a la superficie de la cámara.Coloque la aguja de chorro de fluido con el micromaniprógrafo de modo que esté a 100 micrómetros del borde exterior del neuromasta. Luego, concéntrate en las puntas de los haces de pelo apical. La parte inferior de la aguja de chorro de fluido debe estar enfocada en este plano.Ajuste la abrazadera de presión de alta velocidad del manual al modo externo para recibir la entrada del software de imágenes. Cero la abrazadera de presión de alta velocidad pulsando el botón cero, y utilice la perilla de punto de ajuste para ajustar la presión de reposo ligeramente positiva. Confirme la salida de reposo de la abrazadera de presión de alta velocidad utilizando un manómetro PSI conectado a la salida de la etapa de la cabeza.Para determinar la presión necesaria para estimular los haces capilares, aplique un estímulo de prueba con una salida de 0.125 y 0.25 voltios para 200-500 milisegundos. Para cada estímulo de prueba, medir la distancia de desviación de las puntas de las horquillas, la kinocilia. Elija una presión que mueva los haces a una distancia de aproximadamente 5 micrómetros.Asegúrese de que las puntas de la kinocilia permanezcan enfocadas todo el tiempo. Para adquirir imágenes de un solo plano, seleccione un estímulo para entregar durante la adquisición de 80 fotogramas, después del fotograma 30, a 3 segundos. Para medir las respuestas mecanosensibles al calcio, concéntrese en la base de los haces de cabello apical e inicie la adquisición de imágenes.Para medir las respuestas presinápticas de calcio, concéntrese en la base de las células pilosas e inicie la adquisición de imágenes. Los pasos para visualizar los cambios espaciotemporales en la intensidad GCaMP6S, dentro de un neuromasta durante la simulación, se describen aquí. El tiempo se representa de izquierda a derecha según la marca de tiempo.La fila superior muestra cinco de las catorce ubicaciones temporales de una secuencia de imágenes GCaMP6S F de 70 fotogramas. En la segunda fila, la línea base se ha eliminado de cada imagen con binned GCaMP6S F para crear imágenes delta F. En la tercera fila, las imágenes delta F se han convertido de escala de grises a tabla de búsqueda al rojo vivo.En la fila inferior, la tercera fila se ha superpuesto a las imágenes F de la fila superior. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la larva está anclada correctamente y utilizar los controles adecuados, como se describe en el manuscrito para excluir artefactos de movimiento de sus datos. Trabajar con bungarotoxina alfa puede ser peligroso.Es importante tomar precauciones, como usar guantes mientras lo manipulas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Actividad De Las Neuronas Aferentes De La Línea Lateral Posterior Durante La Natación En El Pez Cebra

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay como herramienta de aprendizaje asociativo para la evaluación cognitiva en estudios de aprendizaje y memoria utilizando pez cebra adulto

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...