Name: in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH/NIDCD intramurala forskning medel 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi skulle vilja erkänna Candy Wong för hennes hjälp skriftligen makrot Fiji. Vi vill också tacka Doris Wu och Candy Wong för deras hjälpsamma förslag med protokollet.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+a+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>P&#233;rez Koldenkova, V., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Activity+with+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators.">Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage.">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).</li><li>Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line.">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li><li>Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Hair+Cells:+Modern+and+Historic+Perspectives.">Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives.</a> Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).</li><li>Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+hearing+loss:+potential+therapies+and+gene+targets+for+drug+development.">Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development.</a> IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).</li><li>Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-link+integrity+and+mechanical+transduction+in+vertebrate+hair+cells.">Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells.</a> Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).</li><li>Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endogenous+Calcium+Buffer+and+the+Time+Course+of+Transducer+Adaptation+in+Auditory+Hair+Cells.">The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells.</a> Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).</li><li>Moser, T., Beutner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+and+endocytosis+at+the+cochlear+inner+hair+cell+afferent+synapse+of+the+mouse.">Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).</li><li>Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Few+CaV1.3+channels+regulate+the+exocytosis+of+a+synaptic+vesicle+at+the+hair+cell+ribbon+synapse.">Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).</li><li>Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+recording+from+the+lateral+line+of+juvenile+zebrafish.">In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).</li><li>Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+biophysical+properties+of+hair+cells+from+the+lateral+line+and+inner+ear+of+developing+and+adult+zebrafish.">In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish.</a> The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).</li><li>Griguer, C., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+potassium+currents+in+cochlear+hair+cells+of+the+embryonic+chick.">Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick.</a> Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).</li><li>Goutman, J. D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Cell+Patch-Clamp+Recording+of+Mouse+and+Rat+Inner+Hair+Cells+in+the+Intact+Organ+of+Corti.">Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).</li><li>Einarsson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+in+Inner+Ear+Hair+Cells+Isolated+from+Zebrafish.">Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+and+intensity+coding+at+the+hair+cell's+ribbon+synapse.">Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).</li><li>Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+ribbon+synapses.">Hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).</li><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Physiological+Recordings+from+Zebrafish+Lateral-Line+Hair+Cells+and+Afferent+Neurons.">Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li><li>Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+from+the+zebrafish+lateral+line.">Physiological recordings from the zebrafish lateral line.</a> Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).</li><li>Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+uncover+novel+mechanisms+of+action+and+prevention+in+drug-induced+hair+cell+death.">Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Intracellular+Calcium+Ion+Dynamics+in+Hair+Cell+Populations+with+Fluo-4+AM.">Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM.</a> PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+-+Functional+calcium+imaging+in+zebrafish+lateral-line+hair+cells.">Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells.</a> Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).</li><li>Sheets, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlargement+of+Ribbons+in+Zebrafish+Hair+Cells+Increases+Calcium+Currents+But+Disrupts+Afferent+Spontaneous+Activity+and+Timing+of+Stimulus+Onset.">Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).</li><li>Chou, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+basis+for+water+motion+detection+by+the+mechanosensory+lateral+line+of+zebrafish.">A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. Fiji is just ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc/">https://fiji.sc/</a> (2018)</li><li>Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+intracellular+calcium+regulation+is+integral+to+aminoglycoside-induced+hair+cell+death.">Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).</li><li>Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+assess+ototoxic+effects+in+the+lateral+line+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos.">An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 193, 18-29 (2017).</li><li>Fadero, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITE+microscopy:+Tilted+light-sheet+excitation+of+model+organisms+offers+high+resolution+and+low+photobleaching.">LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching.</a> Journal of Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

In vivo imaging i intakta djur är till sin natur utmanande. Flera steg i denna metod är kritiska till att erhålla tillförlitlig i vivo kalcium mätningar från sidolinje hårcellerna. Exempelvis är det mycket viktigt att larven är stiftad och förlamad ordentligt innan imaging för att minimera rörelse under imaging. Överskjutande rörelse under imaging kan leda till förändringar i GCaMP6s fluorescens som inte är sant signaler och inte motsvarar förändringar i kalciumnivåer (t.ex., siffror 4B1'-B1'' och 4 C 1'-C1''). Svans pins kan placeras mer anteriorly för att minimera rörelse, även om detta kan göra mer bakre neuromasts oåtkomlig. Dessutom efter hjärtat injektion, kan chef pins roteras så att den horisontella delen av stiftet ligger över äggulan. Förutom att ändra positionen för stift, är det också möjligt att använda en hjärna-slice harpa istället för stift för att immobilisera larverna34. När den placeras över larverna ordentligt, är en harpa ytterligare, potentiellt mindre invasiva metod för att immobilisera larver. Även betydande rörelser kan resultera från otillräcklig fastlåsning, kan underlåtenhet att korrekt utföra hjärtat injektionen för att leverera α-bungarotoxin och förlama larver resultera i ofullständig förlamning, rörelse, och i slutändan rörelse artefakter. Även om vanliga bedövningsmedel har visats påverka retbarhet av zebrafisk hårcellerna, har senaste arbete visat att den anestetiska bensokain inte stör många aspekter av hår-cells aktivitet. Likaså vanligaste mer bedövningsmedel MS-222 bara stör vissa aspekter av hår-cell aktivitet15. Därför utmanande pågrund av α-bungarotoxin injektion, kan bensokain eller MS-222 program visa sig vara ett användbart alternativ metod av förlamning att förhindra rörelse i larven under funktionella kalcium imaging.
Förutom de tekniska utmaningarna som är engagerade i detta protokoll är även ett perfekt monterade prov värdelös om den larv och hårcellerna inte är hälsosam före och under varje tänkbar experiment. För att säkerställa att larver och hårcellerna är frisk, är det viktigt att larver bibehålls i E3-buffert som är fria från skräp som chorions (äggskal), avfall och mikroorganismer. Även om ytliga sidolinje hårcellerna är fördelaktiga för avbildning, detta läge gör dem mer sårbara för cellulära skador när E3 bufferten är sotigt. En ren, vattenlösning miljö är särskilt viktig för unga larver (2-4 dpf) eller mutanter som inte kan upprätthålla en upprätt simning ställning och främst ligga på botten av petriskål. I dessa situationer, sidolinje hårcellerna och skyddande cupula omger hår buntarna kan enkelt bli äventyras. Även när börjar med friska larver och hårcellerna, under varje experiment är det viktigt att säkerställa att larven har ett hjärtslag och snabb blodflödet. Om blodflödet saktar eller slutar, kan hälsa hårcellerna bli komprometterat. I komprometterad preparat som innefattar ohälsosamma larver eller förlust av blodflödet, dör hårcellerna kan identifieras på flera sätt: första att utseendet på karyopyknosis eller nukleär kondensation, vilket yttrar sig som en bubbla inom cellen under DIC optik; det andra av cell krympning och förekomsten av snabbt rörliga partiklar inom cytoplasman; och tredje, när kinocilia tips splay i olika riktningar35. När hår buntar störs, flytta de utspärrade kinocilia inte sammanhållet tillsammans vid stimulering.
Detta preparat har flera mindre begränsningar, ett är att preparatet endast förblir robust för 1-3 timmar efter det är etablerat. Ändringar, till exempel använder mindre stift eller en hjärna-slice harpa för att immobilisera larver och att lägga till en perfusion system kan förlänga livslängden på denna in-vivo -beredning. En annan begränsning är att fotoblekning och fototoxicitet kan uppstå efter upprepad imaging studier. Ett spännande sätt att övervinna denna utmaning är att anpassa detta protokoll för ljus ark mikroskopi. Ljus-ark mikroskopi är ett kraftfullt sätt att minska ur fokus ljus, vilket leder till mindre fotoblekning och fototoxicitet36. Tillsammans kan skonsammare immobilisering och mindre foto-exponering hjälpa förlänga varje bildsession. Längre imaging sessioner kan användas för att undersöka hela varaktigheten av funktionella förändringar som åtföljer utveckling och de processer som ligger bakom hår-cell clearance och förnyelse efter skada. Det är viktigt att påpeka att, förutom ljus ark mikroskopi, detta protokoll kan anpassas till andra typer confocal system (punkt-scanning, 2-photon och roterande disk) samt relativt enkla widefield system28,34 . Sammantaget gör detta protokoll ett värdefullt verktyg som kan anpassas och användas med flera bildgivande system till dess mångsidighet.
Medan detta protokoll kan anpassas och användas med många bildsystem, kan delar av detta protokoll också anpassas och användas (1) med andra indikatorer förutom GCaMP6s och (2) till avbildningen aktivitet i andra sensoriska celler och nervceller inom larval zebrafiskar. Exempelvis i en tidigare studie har använt vi detta protokoll till bilden aktivitet med flera genetiskt kodade indikatorer inom sidolinje hårcellerna för att upptäcka cytosoliska kalcium (RGECO1), vesikler fusion (SypHy), membran spänning (Bongwoori) och membran kalcium (jRCaMP1a-caax och GCaMP6s-caax), och inom sidolinje afferenta processer för att upptäcka membran kalcium (GCaMP6s-caax)5. Transgena linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrivs i detta protokoll baserat på vår erfarenhet av att använda dessa indikatorer, och erbjuder en utmärkt start för imaging aktivitet i sidolinje neuromasts. Av alla de indikatorer som anges ovan, har vi funnit att GCaMP6s är den känsligaste och fotostabilt. Förutom dessa funktioner, vi belysa Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgena linjen eftersom det kan användas för att göra två olika mätningar: hår-cell mechanosensation och presynaptiska calcium inom en enda transgena linje.
Den teknik som beskrivs i denna artikel visar hur kalcium imaging i zebrafiskar laterala linjen kan vara en kraftfull metod för att studera hur hårcellerna fungerar i sin ursprungliga miljö. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till studier av däggdjur i vilken hår-cell funktion studeras för närvarande i ex vivo bladsticklingar. Zebrafisk modellen kan dessutom fortsätta att användas som en plattform för att testa effekten av genetiskt kodade indikatorer som sedan kan tillämpas för att granska aktivitet i däggdjursceller hår.

Funktionella kalcium bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att övervaka aktiviteten hos många celler samtidigt1. I synnerhet har kalcium bildåtergivning med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) visat sig vara fördelaktiga eftersom GECIs kan uttryckas i specifika celltyper och lokaliserade subcellularly2. I neurovetenskap forskning, har dessa funktioner gjort kalcium bildåtergivning med GECIs en kraftfull metod att både definiera aktivitetsmönster inom neuronala nätverk och mäta kalcium tillströmningen vid enskilda synapserna3,4. Dra nytta av dessa funktioner, används konfokalmikroskopi och GECIs i en studie för att övervaka subcellulär aktivitet inom samlingar av sensoriska hårcellerna5.
Hårcellerna är de mekanoreceptorer att upptäcker ljud och vestibulära stimuli i innerörat och lokala vatten rörelse i sidolinje systemet i vattenlevande vetebrates6,7. Hårcellerna är ofta målet för skador eller genetiska mutationer som leder till den vanligaste formen av hörselnedsättning hos människor kallas sensorineural hörsel förlust8,9. Därför är det viktigt att förstå hur dessa celler fungerar för att förstå hur att behandla och förebygga hörselnedsättning. För att fungera korrekt, utnyttja hårcellerna två specialiserade strukturer som kallas mechanosensory-hår buntar och synaptic band att upptäcka och överföra stimuli, respektive. Hår buntar ligger vid spetsen av hårcellerna och består primärt av fina, hår-liknande utbuktningar kallas sinneshår (figur 1A). I vestibulära och sidolinje hårceller har varje hår bunt också en enda lång kinocilium (cellens enda sanna cilier), som kan sträcka sig långt ovanför sinneshår (figur 1A). Mechanosensory stimuli avleda hår buntar och avböjning sätter spänning på kopplingar kallas ”tip-länkar” som interconnect sinneshår10. Denna spänning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler ligger i den sinneshår, vilket resulterar i en apikal tillströmning av katjoner, inklusive kalcium11,12. Denna apikala aktivitet i slutändan depolarizes cellen hår och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler (Cav1.3) vid basen av cellen. Cav1.3 kanaler hittas intill synaptic band, en presynaptiska struktur som tjuder blåsor på aktiva zoner. Basala kalcium inflöde genom Cav1.3 kanaler krävs för vesikler fusion, neurotransmission och aktivering av afferenta neuroner13,14.
För många år, elektrofysiologiska tekniker såsom hela-cell patch fastspänning har använts sond funktionella egenskaper av hårceller i många arter, inklusive zebrafiskar15,16,17, 18,19,20. Dessa elektrofysiologiska inspelningar har varit särskilt värdefulla i fälten hörsel och balans eftersom de kan användas för att få extremt känsliga mätningar från enskilda sensoriska celler, vars syfte är att koda extremt snabb stimuli över en brett spektrum av frekvenser och stödnivåer21,22. Tyvärr kan inte hela-cell inspelningar mäta aktiviteten av populationer av hårcellerna. För att studera aktiviteten av populationer av celler i zebrafiskar lateral-linjen, mikrofonkabelsystem potentialer och afferenta handlingspänningar som har använts för att mäta de summerade mechanosensitive och postsynaptiska svar egenskaper av enskilda neuromasts23 ,24. Tyvärr har varken hela-cell inspelningar eller potentiella lokala fältmätningar den rumsliga upplösningen att lokalisera där aktivitet sker inom enskilda celler eller mäta aktiviteten i varje cell inom en befolkning. Mer nyligen, kalcium färgämnen och GECIs har använts för att kringgå dessa utmaningar25,26.
I zebrafiskar, har GECIs visat sig vara en kraftfull metod att undersöka hår-cellernas funktion på grund av den relativa lätthet att skapa transgena zebrafiskar och optisk klarhet larver27. På zebrafiskar larver föreligger hårcellerna i innerörat samt sidolinje systemet. Den laterala linjen består av rosett-liknande kluster av hårceller som kallas neuromasts som används för att upptäcka lokala förändringar i vattnets rörelse (figur 1). Den laterala linjen är särskilt användbart eftersom det ligger externt längs ytan av fisken. Denna tillgång har gjort det möjligt att stimulera hårcellerna och mäta kalcium signaler optiskt i intakt larver. Användarvänlighet genmodifiering, öppenhet av larverna, och oöverträffad tillgång sidolinje hårcellerna har sammantaget gjort zebrafiskar en ovärderlig modell att studera aktiviteten av hårcellerna i vivo. Detta är en viktig fördel jämfört med däggdjur system där håret celler omges av benstrukturer i innerörat. Denna bristande tillgång har gjort det mycket svårt att förvärva funktionella invivo mätningar av hår däggdjursceller.
Protokollet beskrivs här beskriver hur du övervakar MET kanal - och presynapse-beroende förändrad kalcium inom enskilda hårcellerna och bland celler inom neuromasts i larval zebrafiskar. Detta protokoll använder tredjeparts en etablerad transgena zebrafiskar linje som uttrycker en membran-lokaliserad GCaMP6s under kontroll av de hår-cell specifika myosin6b promotorn28. Detta membran lokalisering positioner GCaMP6s för att upptäcka kalcium inflöde genom jonkanaler i plasmamembranet som är kritiska för hår-cellernas funktion. Till exempel membran-lokaliserad GCaMP6s kan upptäcka kalcium inflöde genom MET kanaler i apikala hår buntar och genom CaV1.3 kanaler nära synaptic band vid basen av cellen. Detta kontrasterar mot med GECIs lokaliserade i cytosolen, som cytosoliska GECIs upptäcka kalcium signaler som är en kombination av MET och CaV1.3 kanal aktivitet samt kalcium bidrag från andra källor (t.ex., store release). Detta protokoll beskriver hur att immobilisera och förlama GCaMP6s transgena larver före imaging. Det beskriver sedan hur du bereder och använder en vätska-jet för att avleda hår buntarna för att stimulera sidolinje hårcellerna i ett kontrollerat och reproducerbart sätt. Representativa uppgifter som kan uppnås med detta protokoll presenteras. Exempel på data som representerar rörelse artefakter presenteras också. Kontroll experiment som används för att verifiera resultaten och utesluta artefakter beskrivs. Slutligen beskrivs en metod för att visualisera rumsliga kalcium signaler i Fiji programmet. Denna Fiji-analys är anpassat från tidigare etablerade visualiseringsmetoder utvecklas med hjälp av MATLAB5. Sammantaget beskriver här protokollet en kraftfull förberedelse-teknik som använder GECIs i larval zebrafiskar att mäta och visualisera hår-cell kalcium dynamics invivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1155px;" width="1155">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Section 1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Bungarotoxin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2133</td>
			<td>For paralyzing larvae prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red Solution 0.5%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For visualization of &#945;-bungarotoxin solution during heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-R</td>
			<td>Platform to mount larvae for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td>To seal imaging chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum silicone grease</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-635-5D&#160;</td>
			<td>For affixing of coverslip to imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone encapsulant clear 0.5 g kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>To fill imaging chamber to create a surface to pin fish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>HB-1D</td>
			<td>For drying silicone encapsulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating wire, forceps and scissors to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For making pins&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>5.5&#34;, EW-10818-00</td>
			<td>For cutting tunsgten wire to make pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.035 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005131</td>
			<td>For head pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten wire, 0.025 mm</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AA10405-H4</td>
			<td>For tail pins to immobilize larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette guller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into &#945;-bungarotoxin injection needles for heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries w/o filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B 150-86-10</td>
			<td>Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ceramic tile</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>NC9569052</td>
			<td>For scoring and evening breaking fluid-jet needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 4 &#38; 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>For pinning larvae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling heart injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Stemi 2000 with transmitted light illumination</td>
			<td>For illuminating larvae during pinning and heart injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder to inject &#945;-bungarotoxin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>For holding manual micromanipulator for &#945;-bungarotoxin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet 4x</td>
			<td>To deliver &#945;-bungarotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sections 6, 7 &#38; 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Swept field/Opterra confocal microscope</td>
			<td>Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Prairieview 5.3</td>
			<td>To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00101</td>
			<td>Low magnification for positioning of larvae and fluid jet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60X water objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF07620</td>
			<td>Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo-Z objective scanner with controller/driver</td>
			<td>Physik Intruments instruments/Bruker</td>
			<td>01144210/UM-Z-PZ</td>
			<td>High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMCCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>Rolera EM-C2 EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Circular chamber adapter</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>PC-A</td>
			<td>For holding and rotating imaging chamber on microscope stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized Z-deck stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>ZDN12MP</td>
			<td>Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-deck stage insert adaptor</td>
			<td>NIH Machine shop</td>
			<td>custom</td>
			<td>To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluid-jet apparatus</td>
			<td>ALA scientific instruments</td>
			<td>HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP</td>
			<td>For controlling and delivering the fluid-jet stimulus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td>
			<td>For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MP-225</td>
			<td>For holding and positioning of needle holder for fluid jet&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator controller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>For controlling fluid-jet needle manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For backfilling fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary/needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH315</td>
			<td>To hold fluid-jet needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PSI manometer</td>
			<td>Sper Scientific</td>
			<td>840081</td>
			<td>For measuring pressure clamp output</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>B1204</td>
			<td>To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isradipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6658</td>
			<td>To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for pharmacological compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Section 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism7</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>Prism7</td>
			<td>Software to plot GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI</td>
			<td>Schindelin, et., al.34</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Software to process images and create spatio-temporal signal maps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turboreg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29&#160;</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StackReg Plugin</td>
			<td>Th&#233;venaz et., al.29</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Times Series Analyzer V3 Plugin</td>
			<td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td>Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of lateral-line hair cells in larval zebrafish

Sensoriska hårcellerna är mekanoreceptorer i innerörat som krävs för hörsel och balans. Hårcellerna aktiveras som svar på sensoriska stimuli som mekaniskt avleder apikala utbuktningar kallas hår buntar. Nedböjning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler i hår buntar, leder till ett inflöde av katjoner, inklusive kalcium. Detta ering inflöde depolarizes cellen och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler ligger basally vid den hår-cell presynapse. Hos däggdjur, hårcellerna är innesluten i ben, och det är utmanande att funktionellt bedöma dessa aktiviteter i vivo. Däremot larval zebrafiskar är transparenta och besitter ett externt belägna sidolinje organ som innehåller hårcellerna. Dessa hårceller funktionellt och strukturellt liknar hår däggdjursceller och kan bedömas funktionellt invivo. Denna artikel beskriver en teknik som använder en genetiskt kodade kalcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, att mäta stimulus-framkallat kalcium i zebrafiskar sidolinje hårcellerna. GCaMP6s kan användas, tillsammans med confocal imaging, för att mäta invivo kalcium signaler vid apex och bas av sidolinje hårcellerna. Dessa signaler ger en realtid, kvantifierbara avläsning av både mechanosensation - och presynapse-beroende kalcium verksamhet inom dessa hårceller. Dessa kalcium signaler ger också viktiga funktionella informationen om hur hårcellerna upptäcka och överför sensoriska stimuli. Sammantaget denna teknik skapar användbara data om relativa ändringar i kalcium aktivitet in vivo. Det är mindre väl lämpad för kvantifiering av den absoluta magnituden av kalcium förändringar. Denna invivo teknik är känsliga för rörelse artefakter. En rimlig praxis och skicklighet som krävs för korrekt positionering, immobilisering och stimulering av larver. Slutligen, när korrekt utförda, det protokoll som beskrivs i denna artikel ger ett kraftfullt sätt att samla in värdefull information om aktiviteten av hår-celler i sina naturliga, fullt integrerade inom ett levande djur.

Efter myo6b:GCaMP6s-caax transgen fisk är ordentligt immobiliserade och vätska-jet stimulans levereras till sidolinje hårcellerna, robust kalcium signaler kan visualiseras och mätt (figurerna 4 och 5, vid 2 X binning). Vid vätska-jet stimulering signaler kalcium kan antingen mätas i apikala hår buntarna, där MET kanaler öppna som svar på stimuli, eller vid basen av hårceller, där presynaptiska kalciumkanaler i Cav1.3 utlösa neurotransmission. Ett representativt exempel på kalcium svaren i dessa regioner med en individuell neuromast visas i figur 4A1-A2''. I det här exemplet levererades en 2-s 5 Hz vätska-jet stimulans för att aktivera alla hårcellerna inom den representativa neuromast. Under stimulansen, robust kalcium signaler kan upptäckas i håret buntar (figur 4A1-A1'', svaren från 8 hår buntar visas). I detta system visar nästan alla mogna håret celler detta apikala inflöde av kalcium5. Däremot inom den samma neuromast, det finns detekterbara kalcium signaler i basal, synaptic planet i endast en delmängd (~ 30%) av hårcellerna (figur 4A2-A2'', 4 celler med presynaptiska Svaren visas)5. 4 grön ROIs Visa celler med inga betydande presynaptiska calcium signaler (figur 4A2-A2'') trots robust apikala kalcium signaler (figur 4A1-A1''). I denna representativa exemplet (figur 4A1-A2''), färgade ROIs matcha upp hår buntar i apikala MET planet (figur 4A1) med deras cell kroppar i basal synaptic planet (figur 4A2). Detta exempel belyser hur båda MET beroende - och presynaptiska-kalcium signaler kan mätas inom enskilda hårcellerna och bland populationer av hårcellerna.
Kalcium signalerna i både hår buntarna och på presynapse kan plottas grafiskt som antingen rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (se steg 12, siffror 4A1'-A1'' och 4A2'-A2''). (F) GaMP6s diagrammen markera att baslinjen fluorescensintensiteten för varje cell kan variera (siffror 4A1' och 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, varje cell är normaliserad till sitt utgångsvärde och relativ intensitet förändringen från baslinjen plottas (siffror 4A1'' och 4A2''). I båda (F) och ΔF/Fo GCaMP6s tomter, kalcium signalerna både i apikala hår bunt och basala presynaptiska planet inleda med uppkomsten av stimulansen (grå rutan) och minska exponentiellt efter stimulans avslutas. Under stimulansen, kalcium signaler i hår buntar stiga snabbt och mätta om styrkan i omläggning inte ändras (figur 4A1-A1''). Däremot inom delmängden av hårceller med detekterbara kalcium signaler i synaptic planet, kalcium signalerna öka mer gradvis och är mindre benägna att mättnad (figur 4A2-A2''). I hårcellerna utan presynaptiska calcium signaler (gröna ROIs) förbli kalcium signalerna nära baslinjen.
Utöver dessa grafiska representationer (figur 4), kan kalcium signaler visualiseras rumsligt inom den hela neuromast under tidsförloppet för inspelningen. Ett exempel på en spatiotemporal representation visas i figur 5 presynaptiska GCaMP6s signaler i basal planet av en neuromast. I figur 5beskrivs de viktigaste stegen att bearbeta en bildsekvens för spatial visualisering som beskrivs i steg 13. Först, raw (F) GCaMP6s-bilder skulle är kastas i temporally papperskorgen [figur 5: rad 1 (5 14 lagerplatserna visas); steg 13.2.1]. Sedan, baslinjen bilden, beräknas från före stimulans ramar (steg 13,2), subtraheras från (F) GCaMP6s fluorescens signalerna att få ΔF bilder (figur 5: rad 2; steg 13.2.2). Nästa, ΔF gråskalebilder konverteras till en färg LUT (figur 5: rad 3, Red Hot LUT; steg 13,3). Slutligen ΔF bilderna med LUT omvandlingen är överlagras på temporally binned (F) bilder (figur 5, första raden) att avslöja de spatiotemporal signalerna inom neuromast vid stimulering (figur 5: rad 4; steg 13,4). Värmekartor över ΔF GCaMP6s signaler ger både värdefull rumsliga och temporal information som inte är lätt att tolka ut från enda ROIs och diagrammen i figur 4. Värmekartor kan hjälpa till att visualisera viktig spatiotemporal information, inbegripet subcellulär information om uppkomsten och varaktigheten av kalcium signaler inom varje hår cell samt tidpunkt och intensitet skillnaderna bland hårcellerna inom hela neuromast.
Det är viktigt att kontrollera att diagrammen och rumsliga värmekartor representerar sant kalcium signaler och inte är artefakter på grund av rörelse. I detta protokoll, kan rörelse artefakter vara resultatet av överdriven avdrift eller rörelse av larv eller motion på grund av vätska-jet stimulering. Alla dessa artefakter är utmanande att helt eliminera i denna invivo beredning. Medan registrering av bildsekvenser (steg 12.1.3) kan korrigera för måste majoriteten av rörelsen i x - och y, bildsekvenser med överdriven rörelse i z-axeln identifieras och tas bort från analyser. Rörelse artefakter är lättast att identifiera genom graphing kalcium signalerna. Exempel på GCaMP6s intensitet förändringar som är artefakter inte och sant GCaMP6s signaler kan observeras vid spetsen (figur 4B1'-B1'') och bas (figur 4C1'-C1'') av hårceller.
I de apikala hår buntarna, rörelse artefakter är vanliga när den vätska-jet stimulansen är för stark (figur 3A3'' '). Under dessa överdrivet starka stimuli, apikala hår-bundle planet kan flytta ur fokus under vätska-jet stimulering sedan återgå till ursprungliga fokalplanet efter stimulans avslutar (figur 4B1'-B''). Detta gör det svårt att exakt mäta apikala MET-beroende kalcium signaler. Ett exempel på hår-bundle rörelse artefakter kan ses i figur 4B1'-B1''. Här diagrammen visar en minskning av GCaMP6s signaler under stimulansen (grå rutan) när hår buntarna är out-of-fokus. Efter stimulansen slutar, öka GCaMP6s signalerna snabbt som hår buntarna återgå till sin ursprungliga position och komma tillbaka i fokus. Detta kontrasterar med exemplet i figur 4A1'-A1'' där de apikala kalcium signalerna öka vid uppkomsten av stimulansen och minska när stimulansen slutar.
Medan rörelse på grund av överdriven vätska-jet stimuli kan också flytta synaptic planet ur fokus, är denna typ av rörelse artefakt mindre vanligt i detta plan. Istället är förändringar i fokus i z-axeln på grund av rörelse eller drift av larven de vanligaste orsakerna till rörelse artefakter. Larval rörelse eller drift kan påverka GCaMP6s mätningar vid både apex och bas av hårcellerna. Ett exempel av larval rörelse som ökar GCaMP6s i basal, synaptic planet under stimulans visas i figur 4C'-C''. Rörelse artefakter (figur 4C1'-C1'') kan särskiljas från Sant presynaptiska signaler (figur 4A2'-A2'') genom att undersöka tidsförloppet för GCaMP6s signaler. Snarare än att öka och minska exponentiellt med stimulans (figur 4A2'-A2''), den rörelse-inducerad ökningen av GCaMP6s signal har en fyrkant forma och stiga och falla abrupt med uppkomsten och förskjutning av stimulans, respektive () Figur 4 C1'-C1'').
Förutom noggrann undersökning av tidsförloppet för GCaMP6s signaler, kan kontroll experiment med farmakologi användas för att skilja sant GCaMP6s signaler från rörelse artefakter. Till exempel kan BAPTA (steg 10) tillämpas för att klyva tip-länkarna som krävs för MET-kanals funktion i hår buntar. BAPTA bör eliminera vätska-jet-framkallat apikala MET-kanal-beroende kalcium tillströmning såväl som efterföljande basala, presynaptiska calcium inflödet genom Cav1.3 kanaler. I representativa exempel på sann stimulus-framkallat kalcium signaler (figur 4A1-A2'') under vätska-jet stimulering, alla ändringar i GCaMP6s fluorescens i båda de apikala och basala plan skulle elimineras efter BAPTA behandling. Däremot förändringar i GCaMP6s fluorescens på grund av rörelse, såsom de som visas i siffror 4B1'-B1'' och 4 C 1'-C1'' skulle inte elimineras genom BAPTA behandling.
Förutom för att eliminera alla stimulans-framkallat GCaMP6s signaler med BAPTA, isradipine kan tillämpas (steg 11) för att specifikt blockera Cav1.3-beroende kalcium tillströmning i basal synaptic planet samtidigt som den lämnar apikala MET-kanal-beroende kalcium tillströmningen intakt5. Efter tillämpning av isradipine, i en individuell neuromast med ingen rörelse artefakter, förändringar i GCaMP6s fluorescens i apikala hår buntar (figur 4A1'-A1'') under vätska-jet stimulering skulle vara oförändrat, medan alla synaptic GCaMP6s fluorescens förändringar vid basen skulle elimineras (figur 4A2'-A2''). Någon förändring i GCaMP6s signal i synaptic planet efter isradipine ansökan (t.ex.,figur 4C1-C1'') skulle troligen motsvarar rörelse artefakter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig1.jpg"> Figur 1 : Översikt över en sidolinje neuromast och funktionella imaging flygplan. (A) diagrammet till vänster visar en sida-vy av en neuromast med fyra hår-cell organ (svart) att kontakta postsynaptiska afferenta neuroner (blå). Band (grön) tjuder blåsor på presynaptiska aktiva platser inom varje cell. Apikala till varje cell organ är en bunt sinneshår (1 µm) som innehåller MET kanaler. Varje hår bunt har en kinocilium som överför den mekaniska kraften av vatten rörelse till basen av den hår bunten. Diagrammet till höger visar samma modell i en top-down vy. I den här uppifrån vyn svart används för att ange de fyra cellerna som skildras i diagrammet till vänster, och grå används för att ange andra celler i neuromast. Inom denna modell och dessa 2 visningar, tre viktiga plan är markerade: (1) tips av hår buntarna (kinocilia) används för att kvantifiera omfattningen av hår-bundle deformationen, (2) det apikala MET planet vid basen av hår buntarna där kalcium kommer in i cellen under stimulering, och (3) synaptic planet vid basen av cellen där kalcium kommer in nära synaptic band. (B1-B1') DIC och GCaMP6s uppifrån bilder av MET plan vid basen av hår buntarna, där mechanosensation-beroende kalcium signaler kan registreras. (B2-B2') DIC och GCaMP6s uppifrån bilder från de samma neuromast som B1-B1', men vid basen av neuromast i synaptic planet, där presynaptiska calcium signaler kan upptäckas. (C1-C2) Bilder av en neuromast som uttrycker GCaMP6s där larverna är felaktigt monterad. I det här exemplet är apikala MET planet (C1) och synaptic planet (C2) vid basen av cellen placerade i en optimal vinkel. Denna ställning tillåter inte alla hår buntar som avbildas i ett enda plan, och många fler imaging plan behövs för att fånga aktivitet på alla synapser inom detta neuromast jämfört med B1-B2'. Bilderna är av larver på 5 dpf. Skalstapeln i C2 motsvarar alla bilder i B1-C2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig2.jpg"> Figur 2 : Imaging kammare, zebrafiskar montering och hjärtat injektion procedurer och nålar. (A) visas är en tänkbar kammare med en larv (beskrivs av en streckad rektangel) nålas till stadens ovanpå den silikon encapsulant. (B1) Visas är en 5 dpf larven orörlig med två stift. Ett stort huvud stift placeras vinkelrätt mot kroppen bara posteriort ögat. De två ögonen är helt ovanpå så botten ögat helt skyms av övre ögat. En liten svans pin korsar ryggsträng i svansen. Larven är platt och inte vridna. (B2) För att förlama larv, en hjärta injektionsnål är orienterade vinkelrätt mot kroppen och förde intill hjärtat. Hjärtat injektionsnålen bör kontakta cellen pigment framför hjärtat. (B2') Depression av nålen in i huden orsakar indrag av pigment cellen framför hjärtat. (C) nålar i ordning från vänster till höger: exempel på en hjärtat injektionsnål med en öppning på ungefär 3 µm; exempel på en bra vätska-jet nål med en öppning på ca 50 µm, exempel på en dåligt trasiga vätska-jet-nål som är stor och taggiga och kommer sannolikt producera överdrivna och oregelbundna stimuli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig3.jpg"> Figur 3 : Vätska-jet justering, positionering och stimulans kalibrering. (A1) Visas är en larv orienterade med huvudet fasaden till vänster och svans till höger, och en vätska-jet nål orienterad parallellt med A-P axeln av zebrafisk kroppen. Denna vätska-jet nål justeras för att stimulera den neuromasts som svarar på främre (push/tryck) och bakre (pull/vakuum) regisserad vätska-flöda. (A2) Visas är en neuromast (markerad med streckad vit linje) och tips av apikala hår buntar (kinocilia) på vänster sida i panelen och vätska-jet nålen till höger på panelen. Vätska-jet är placerade ungefär 100 µm från kanten av neuromast. (A3-A3'' ') Tips av apikala hår buntar (kinocilia) är utbuktande olika sträckor av varierande vätska-jet stimulans trycket. Banan för ett enda kinocilial tips visas för 1,5 µm (A3') och 5 µm (A3'') nedböjning avstånd. Den svarta cirkeln visar vilande position av kinocilium. Det är viktigt att kinocilia inte är avlänkas för långt, annars stimulus intensitet kan inte mätas på ett tillförlitligt sätt och kan bli skadligt (A3'' '). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig4.jpg"> Figur 4 : Apikala träffade och basala presynaptiska GCaMP6s signaler under vätska-jet stimulering i sidolinje hårcellerna. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet ändras under vätska-jet stimulering inom en representativ neuromast. Bilderna till vänster visar apikala MET planet (A1) och basal synaptic planet (A2) inom den samma neuromast. ROIs färg kodade i A1 och A2 har använts för att rita de tidsförloppet för (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger om varje bild. (B1-B1'') Exempel på en apikal MET bildsekvens med överskott rörelse under vätska-jet stimulering. Bilden till vänster (B1) visar de ROIs brukade tomten (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger. (C1-C1'') Exempel på en bildsekvens i basal synaptic planet att visar rörelse artefakter och GCaMP6s signal förändringar som inte är sant kalcium signaler. Bilden till vänster (C1) visar de ROIs brukade tomten (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger. Den grå rutan i varje diagram representerar varaktigheten av den vätska-jet stimulansen under varje bildsekvens. En 2-s 5 Hz vätska-jet stimulus användes för exemplet i A1-A2'' och B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s främre stegstimulus användes. Y-axeln för (F) GCaMP6s grafer skildrar godtyckliga enheter (A.U.) erhålls från Fiji bild intensitet mätningar. Alla exempel är från larver på 4-5 dpf. Skalstapeln = 5 µm för alla bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58794/58794fig5.jpg"> Figur 5 : Spatiotemporal visualisering av presynaptiska GCaMP6s signaler under vätska-jet stimulering. Stegen för att visualisera spatiotemporal ändringarna i GCaMP6s intensitet inom en neuromast under stimulans beskrivs. Tid är representerade från vänster till höger enligt tidsstämpeln högst upp på bilderna. Den översta raden visar 5 14 temporal lagerplatserna från en 70-GCaMP6s (F) bild bildrutesekvens (steg 13.2.1). I den andra raden, har baslinjen (steg 13,2) tagits från varje (F) GCaMP6s binned bild skapa ΔF bilder (steg 13.2.2). I den tredje raden, ΔF bilder har konverterats från gråskala (andra raden) till Red Hot LUT (steg 13,3). Min och max dessa LUT bilder ställs enligt Red Hot LUT värmekarta över relativa ΔF intensitet (A.U.) till höger (steg 13.3.1). I den nedersta raden, har den tredje raden varit överlagras på (F) bilderna i den översta raden (steg 13,4). Det grå fältet överst i figuren anger tidpunkten för den 2-s 5 Hz vätska-jet stimulansen. Exemplet är från en 5 dpf-larver. En legend av Red Hot LUT värmekarta över relativa ΔF intensitet (A.U.) visas till höger. Skalstapeln = 5 µm för alla bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58794/58794fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalcium avbildning av sidolinje hårcellerna i Larval zebrafiskar

Zebrafiskar är modellsystem som har många värdefulla funktioner inklusive optisk klarhet, snabb extern utveckling, och av särskild betydelse inom hörsel och balans, externt belägna sensoriska hårcellerna. Denna artikel beskriver hur transgena zebrafiskar kan användas till assay både hår-cell mechanosensation och presynaptiska funktion i sin helhet.

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara grundläggande frågor inom hörsel och balans. Den beskriver hur man upptäcker två viktiga aspekter av sensoriska hårceller funktion, mekanotransduction och presynaptic aktivitet. De främsta fördelarna med denna teknik är att det tillåter oss att visualisera funktionen av hårceller i ett levande djur, och att studera hur samlingar av hårceller upptäcka och överföra sensorisk information.För att börja detta förfarande, använd fina pinj och volfram tråd för att mode stiften som ska användas för att immobilisera larven genom huvudet och svansen, på den härdade encapsulanten. För att göra huvud stift, håll en bit av 0,035 millimeter volfram tråd i en hand. Med hjälp av fina tänjningar i den andra handen, böja tråden en millimeter upp från slutet, vid 90 grader.Byt tänjning av pinjarna mot fin sax, och skär en millimeter efter böjningen, för att skapa stiftet. Använd sedan pinps för att föra in stiften i den härdade kapsla in på kammaren. Placera larven i mitten av perfusionskammaren så att den ligger platt på sin sida mot silikonen encapsulant.Med hjälp av fina pinps, ta med 0,035 millimeters huvudpinnen nedåt vinkelrätt mot larven. Sätt in huvudet stiftet mellan ögat och otic vesicle, och ner i encapsulant. Använd en andra uppsättning pinps för att stabilisera larven längs dess dorsala och ventrala sida, medan du fäster.Se till att den horisontella delen av stiftet kontaktar larven och inte trycker hela vägen in i encapsulanten. Vinkla stiftet ventrally, eller pekar något mot den främre delen av larven, för att undvika att störa efterföljande hjärtinjektion och hårcellsavbildning. Med hjälp av pinpsen för du in en 0,025 millimeters svanstapp i notokordet, så nära som möjligt till änden av svansen.För att injicera alfa bungarotoxin i larven, återfylla tre mikroliter av lösningen i injektionsnålen, med hjälp av en gel-lastande pipettspets. Ladda lösningen jämnt till spetsen, utan bubblor. Sätt sedan in hjärtinjektionsnålen i en pipetthållare som är fäst vid en manuell mikromanipulator.Under ett stereomikroskop placerar du nålen så att den är riktad vinkelrätt mot AP-axeln hos den sesteserade larven, riktad nedåt i en vinkel på 30 grader. Därefter ansluts pipettens hållare till tryckinjektorn. Injicera en bolus av alfa bungarotoxin i lösningen, för att testa om nålspetsen är klar.Om ingen röd färg ses, mycket försiktigt skrapa nålspetsen mot kanten av en stift, och försök igen, tills nålen är klar. Därefter, föra nålen mot hjärtat, tills den vidrör huden utanför hjärtat. Tryck nålen in i larven, och leta efter indrag av pigmentcellen på huden framför hjärtat för att säkerställa att nålen är placerad i rätt plan, i förhållande till larven.Sedan, föra nålen längre, tills den genomborrar huden och kommer in i hjärthålan. Dra nålen tillbaka något, och injicera en bolus av alfa bungarotoxin i hjärtat hålighet. Leta efter inflationen i hjärthålan, eller för rött färgämne som kommer in i hålrummet.Skölj larven försiktigt tre gånger, med en milliliter neuronal buffert för att avlägsna resterande MS222. Ta aldrig bort all vätska. Underhåll larv i cirka 1 millileter neuronal buffert i perfusionskammaren.I detta förfarande återfylla 10 mikroliter av neronal buffert i en ordentligt bruten fluid-jet nål med hjälp av en gel lastning spets. Ladda lösningen jämnt till spetsen utan bubblor. Sätt sedan in nålen i pipetthållaren som är fäst vid den motoriserade mikromanipulatorn.Placera perfusionskammaren i en cirkulär kammaradapter på mikroskopstadiet. Flytta den motoriserade scenen så att larven är i mitten av synfältet. Därefter vrid den cirkulära kammaradaptorn så att AP-åtkomsten till larven är ungefär i linje med banan för vätskestrålenålen.Använda överförd ljus och differentialinterferens kontrast, föra larven i fokus och centrera den under 10x objektivet. Sedan, höja 10x målet. Med hjälp av den motoriserade micromanipulator, föra fluid-jet nålen ner i mitten av synfältet, så det är upplyst av det överförda ljuset och knappt röra neuronal buffert.Sänk 10x-målet för att fokusera på larven för att bekräfta dess placering. Fuous målet på vätske-jet nål. Flytta fluid-jet nålen med mikromanipulator i x och y-axeln tills den är i en position parallellt med dorsala sidan av larven.Efteråt, fokusera tillbaka på larven. För ner nålen i z-axeln och placera nålen längs fiskens ryggsida, 1 millimeter bort från kroppen. Flytta försiktigt den cirkulära kammaradaptorn för att säkerställa att fluidstrålenålen är i linje längs larvens AP-mittlinje.Därefter byter du till 60x vattenmålet. Se till att målet är emersed i den neuronala bufferten. Använd den fina fokus för att lokalisera en neuromast.Därefter flytta motariserade scenen för att placera neuromast av intresse i mitten av synfältet. Håll vätskestrålenålsspetsen längs fiskens ryggsida. Rör inte vätskestrålenålsspetsen till larven eller kammarytan.Placera fluid-jet nålen med micromanipulator så att den är 100 mikrometer från den yttre kanten av neuromast. Sedan fokuserar du upp till spetsarna på de apikala hårknipparna. Botten av vätskestråle nålen bör vara i fokus i detta plan.Ställ in tryckklämman för höghastighetstryck från manualen till externt läge för att ta emot indata från bildhanteringsprogrammet. Nollställ tryckklämman för höghastighetstryck genom att trycka på nollknappen, och använd börlägesvredet för att ställa in vilotrycket något positivt. Bekräfta viloutgången för höghastighetstryckklämman med hjälp av en PSI-manometer som är fäst vid huvudstegsutgången.För att bestämma det tryck som behövs för att stimulera hårknippen, applicera en teststimulans med en 0,125 och 0,25 volts utgång för 200-500 millisekunder. För varje teststimulans, mät avvikelsens avstånd av hårböjlarnas spetsar, kinocilien. Välj ett tryck som flyttar buntarna ett avstånd på cirka 5 mikrometer.Se till att spetsarna på kinocilian förblir i fokus hela tiden. För att förvärva enplansbilder, välj en stimulans att leverera under 80 ram förvärv, efter ram 30, på 3 sekunder. För att mäta mekanosensiaktiva kalciumsvar, fokusera på basen av de apikala hårknippen och starta bildförvärv.För att mäta presynaptiska kalcium svar, fokus vid basen av hårcellerna, och börja bild förvärv. Stegen för att visualisera spatiotemporal förändringar i GCaMP6S intensitet, inom en neuromast under simulering, beskrivs här. Tid representeras från vänster till höger enligt tidsstämpeln.Den översta raden visar fem av de fjorton temporala lagerplatser från en 70-frame GCaMP6S F bildsekvens. I den andra raden har baslinjen tagits bort från varje GCaMP6S F-binned-bild för att skapa delta F-bilder. I den tredje raden har delta F-bilder konverterats från grå skala, till red hot lookup-tabell.I den nedre raden har den tredje raden överlagats på F-bilderna i den översta raden. Medan du försöker denna procedur, är det viktigt att komma ihåg att se till att larven är fäst korrekt och att använda lämpliga kontroller, som beskrivs i manuskriptet för att utesluta rörelse artefakter från dina data. Att arbeta med alfa bungarotoxin kan vara farligt.Det är viktigt att vidta försiktighetsåtgärder, som att bära handskar när du hanterar den.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp inspelningar i Inre celler öronhår isolerad från Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Framhjärna Elektrofysiologiska inspelning i larver Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Aktivitet av bakre laterala linjen Afferent nervceller under simning i zebrafisk

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalbar modell för att studera effekterna av trubbig kraftskada hos vuxna zebrafiskar

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjärnans pericytkalcium och hemodynamisk avbildning hos transgena möss in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...