Name: identification of mouse and human antibody repertoires by next-generation sequencing
Uploaded: 2019-03-15T13:30:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing at JoVE.com

بتأييد هذا العمل بمنحه من أوسطي تحت رقم المنحة JP18fk0108011 (كو و SI) و JP18fm0208002 (TS وكو ويو)، ومعونات من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (15 ك 15159) إلى كو. ونشكر ياماغوتشي سايوري وساتوكو ساساكي للمساعدة التقنية القيمة. ونود أن نشكر اديتاجي (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية.

<ol>
	<li>Schroeder, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+and+divergence+in+the+development+and+expression+of+the+mouse+and+human+antibody+repertoires.">Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).</li><li>Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+generation+of+antibody+diversity.">Somatic generation of antibody diversity.</a> Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).</li><li>Georgiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+challenge+of+high-throughput+sequencing+of+the+antibody+repertoire.">The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire.</a> Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).</li><li>Lees, W. D., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Antibody+Repertoires+with+Next-Generation+Sequencing.">Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).</li><li>Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A., Fisher, D. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+zebrafish+antibody+repertoire.">High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire.</a> Science. 324 (5928), 807-810 (2009).</li><li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+description+of+antibody+heavy-chain+repertoires+in+humans.">High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans.</a> PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+in+the+germline+Ig+gene+repertoire+inferred+from+variable+region+gene+rearrangements.">Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.</a> Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).</li><li>Kono, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+antigen-responding+antibody+repertoires+by+using+next-generation+sequencing+and+confirming+them+through+antibody-gene+synthesis.">Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinism+and+stochasticity+during+maturation+of+the+zebrafish+antibody+repertoire.">Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distorted+antibody+repertoire+developed+in+the+absence+of+pre-B+cell+receptor+formation.">Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).</li><li>Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+verification+of+transcriptional+starting+sites+by+Deep-RACE.">High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE.</a> Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).</li><li>Yeku, O., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends+(RACE).">Rapid amplification of cDNA ends (RACE).</a> Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).</li><li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+template+switching:+a+SMART+approach+for+full-length+cDNA+library+construction.">Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).</li><li>Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+measurement+of+memory+B-cell+recall+using+antibody+repertoire+sequencing.">Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTer RACE 5&#8217;/3&#8217; Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).</li><li>. Perl Available from: <a target="_blank" href="https://perldoc.perl.org/">https://perldoc.perl.org/</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2016).</li><li>Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgBLAST:+an+immunoglobulin+variable+domain+sequence+analysis+tool.">IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).</li><li>. IgBLAST Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html</a> (2018)</li><li>Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=454+antibody+sequencing+-+error+characterization+and+correction.">454 antibody sequencing - error characterization and correction.</a> BMC Research Notes. 4, 404 (2011).</li><li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT,+the+international+ImMunoGeneTics+information+system.">IMGT, the international ImMunoGeneTics information system.</a> Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).</li><li>Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT((R))+tools+for+the+nucleotide+analysis+of+immunoglobulin+(IG)+and+T+cell+receptor+(TR)+V-(D)-J+repertoires,+polymorphisms,+and+IG+mutations:+IMGT/V-QUEST+and+IMGT/HighV-QUEST+for+NGS.">IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS.</a> Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).</li><li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+determination+of+the+diversity+of+a+combinatorial+antibody+library+gives+insight+into+the+human+immunoglobulin+repertoire.">Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , (2015).</li><li>Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+during+development+of+VH11++B+cells:+a+model+for+natural+autoantibody-producing+CD5++B+cells.">Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells.</a> Immunological Reviews. , 60-74 (2004).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

ويستخدم الأسلوب الموصوفة هنا خ ع للجيش الملكي النيبالي جسم تضخيم استخدام الأسلوب 5 '--سباق. على النقيض من الأساليب التي تستخدم منحط 5 '-Vح الجينات الإشعال، تتضخم مرناس كل فئة جسم بالتساوي باستخدام كبسولة تفجير الأمام العالمي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العقاقير كبسولة تفجير محددة لمنطقة الثابت 1 (CH1) من الجينات جسم مرجع التنميط لفئات محددة الغلوبولين المناعي. وهذا مفيد جداً لتشريح استجابة جسم فئة معينة، فضلا عن مقارنة ساذجة ومبدع المحصنين8،9.
شرك الأسلوب الأكثر احتمالاً ندرة رسائل تضخيم الغلوبولين المناعي. عمق جسم المرجع التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول إلى حد كبير يعتمد على التضخيم PCR هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2. تغيير نسب كدنا القالب والإشعال في الخطوات 3.2.1 أو 3.2.2 ينصح بشدة إذا لم يتم الحصول بشكل صحيح على عمق مرجع ممارسات مجلس الأمن،.
وبصفة عامة، هي حوالي 20% القراءات الأجسام المضادة التي تنتجها خ ع تسلسلات غامضة21. حتى مع إنشاء "طرق التصحيح"، 5-10% تبقى غامضة3. ولذلك، نحن، تحليل التسلسل وتصفية يقرأ الخام التي تحتوي على تسلسلات التوقيع المقابلة لمناطق ثابتة الغلوبولين المناعي (CμH1، Cγ1H1، Cγ2cH1، إلخ.). ومن ثم تحليل فرط الطفرات الجسدية يحتاج الفحص الدقيق.
واحد أوجه القصور في هذا الأسلوب هو أن جسم ثقيل وزوج سلسلة الخفيفة غير قادر على الاستدلال. ومن ثم رأي المرجع التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ليس كلي. ومع ذلك، من الممكن لتقريب أزواج كبار بالتحليل الإحصائي ل البيانات10. أيضا، وطريقة جديدة لتسلسل أزواج الغلوبولين المناعي وقد أفادت مؤخرا3،4.
استخرجت في تسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna الإخراج استناداً إلى وجود الغلوبولين المناعي مورثة تسلسل التوقيع. تم تقييم الجين الخامس ود ي ثم تم المشروح شرائح وإنتاجية الخامس (د) ي ترتيبات جديدة. منطقة تحديد التكامل 3 (CDR3) كما كان المشروح متواليات. وقدمت هذه الفحوص المنتظمة لتسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna مفيد23،22،الخادم إيمجت/هيغف--كويست24. ومع ذلك، بناء خط أنابيب معالجة إليه بميزة لتحليل البيانات التجريبية كبيرة. خط الأنابيب مخصصة لكل غرض من الممكن إعداد باستخدام مستقل إيجبلاست البروتوكول19. هذا النهج يحتاج محو الأمية البرمجة الأساسية ولكن مفيد جداً لتحليلات مفصلة للنظام المناعي. خطوط الأنابيب ووصف أمثلة لبروتوكول مخصص (الشكل 2).
يقرأ العدد من الأجسام المضادة النسبي لكمية الأجسام المضادة الكشف في العينة، مما يعكس مكونات نظام الأجسام المضادة في جسم تعطي الوقت النقاط5،،من825. الأسلوب الموصوفة هنا يعطي رأي العين طائر من دستور الخامس (د) ي مرجع جسم استخدام البحث والتطوير البرامج8،،من1826.
العالمية ويرى مبدع الأجسام المضادة IgM الفئران فردية ساذجة كشفت فدج-الشخصية مصانة عاليا بالمقارنة مع تلك التي IgG1 أو IgG2c8. وذكر أن مجموعات فدج من الزرد غير ناضجة جداً النمطية9. وفي المقابل، يقال البشرية فدج تركيبات منحرفة جداً6. هي العالية حافظ فدج-التشكيلات الجانبية القطعية في الخلايا من السذاجة ب التحديد ربما ولدت أما بانحراف فدج-ترتيبات جديدة أو السلبية مع السيارات-مولدات المضادات في الجسم. على سبيل المثال، IGHV11-2 يتم التعبير عن تفضيلي في مرجع IgM الجنين27 وهيمنة هذا يعزى إلى أوتوريكتيفيتي IGHV11-2 ضد الكريات الحمراء مسن27. من المثير للاهتمام، IGHV11-2 هو أيضا مرجع الرئيسية الأكثر شيوعاً في تحليلنا المنشورة سابقا من السذاجة IgM8.
الأسلوب الموصوفة هنا مفيد لفك رموز مبدع جسم مستضد المستجيبة من خلال تحليل الفضاء جسم-مرجع ممارسات مجلس الأمن التي تم إنشاؤها في الهيئات كل على حدة، تجنب إغفال غير مقصود من جسم الرئيسية مبدع8، جامعاً 10. يسمح هذا الأسلوب أيضا دراسة مفصلة جسم شبكة دينامية، مما ييسر تسارع اكتشاف أجسام مضادة واقية ضد الناشئة حديثا ومسببات الأمراض.

نظام الأجسام المضادة واحد من المبادئ الأساسية لنظام المناعة المكتسبة. أنها قوية للغاية ضد غزو الجراثيم بسبب تنوعها واسعة، مستضد غرامة الاعتراف بخصوصية، والتوسع في الاستنساخ من خلايا ب حدة مستضد. مرجع الخلايا المنتجة للأجسام المضادة ب يقدر بأكثر من 1015 في كل واحدة1. يتم إنشاء هذا التنوع الهائل بمساعدة فدج المورثات جزئ في المكاني الوراثي الغلوبولين المناعي2. وصف مبدع بالخليه بأكملها وعلى التغيرات الدينامية في الاستجابة للتحصين مستضد فصعبة ولكن ضرورية لفهم كامل لاستجابة الأجسام المضادة ضد غزو العوامل الممرضة.
بسبب تنوعها الفلكية، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود؛ ومع ذلك، قد مكن ظهور التكنولوجيا خ ع اختراقات لفهم أفضل لما تعقد3،4. مبدع جسم كله قد تم بنجاح تحليلها، أولاً في الزرد5، ثم من الفئران،6، والبشر6،7. على الرغم من أن خ ع أصبحت الآن أداة قوية في دراسة الاستجابة المناعية التكيفية، تفتقر إلى التحليلات الأساسية لأوجه التشابه والاختلاف في جسم مبدع بين الحيوانات الفردية.
في الفئران، أفيد بأن مبدع IgM تكاد تكون متطابقة بين الأفراد، بينما IgG1 و IgG2c تختلف اختلافاً كبيرا بين الأفراد8. بالإضافة إلى استخدام الجين الخامس الشخصية، تواتر فدج-الشخصية في السذاجة الطرفية ب خلايا الملاحظة متشابهة جداً بين الأفراد8. تحليل سلاسل الأحماض الأمينية فدج-المنطقة كما أظهرت حدوث نفس تسلسل هالة في الفئران مختلفة أكثر بكثير مما سبق الفكر8في كثير من الأحيان. تشير هذه النتائج إلى أن الآليات اللازمة لتشكيل جسم مرجع يمكن أن تكون قطعية بدلاً من العشوائية5،،من89. عملية التنمية مرجع الأجسام المضادة في الفئران قد أيضا تم بنجاح تحليل استخدام خ ع لزيادة تسليط الضوء على إمكانات خ ع للكشف عن الأجسام المضادة المناعي في التفصيل10.
في هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل جسم مرجع ممارسات مجلس الأمن على الصعيد عالمي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL Strip Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0452</td>
			<td>120 strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>DNA-035</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Systems</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA /2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-00256</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, NuSieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-02606</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (-)&#8220;Nissui&#8221;</td>
			<td>NISSUI&#160;</td>
			<td>08192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>50/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ling lock tube 1.7 mL</td>
			<td>BM EQUIPMENT</td>
			<td>BM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ling lock tube 2.0 mL</td>
			<td>BM EQUIPMENT</td>
			<td>BM-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>500 cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-03275</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>500 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer RACE 5&#8217;/3&#8217; Kit&#160;</td>
			<td>Clontech&#160;</td>
			<td>634858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq Hot Start Version&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.&#160;</td>
			<td>RR006A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>AmbionThermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear qPCR Caps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0866</td>
			<td>120 strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of mouse and human antibody repertoires by next-generation sequencing

التكيف الهائلة مستضد الاعتراف بالأجسام المضادة هو الأساس لنظام المناعة المكتسبة. على الرغم من فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء إنتاج مرجع الشاسعة من الأجسام المضادة بالمناعة المكتسبة، لم ممكن للتوصل إلى رؤية عالمية لمرجع جسم كاملة. على وجه الخصوص، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود بسبب عددها الفلكية من جسم الحيوانات المستنسخة. ومع ذلك، تمكن تقنيات الجيل التالي تسلسل اختراقات لزيادة فهمنا لمرجع الخلية ب. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل الماوس الفردية كاملة ومبدع جسم الإنسان. من أجهزة المناعة، بالإسم من الطحال في الفئران وخلايا الدم المحيطية وحيدات النوى في البشر، ومجموع الجيش الملكي النيبالي كان مستعدا، عكس نسخها، والتوسع في استخدام أسلوب 5 '--سباق. استخدام تمهيدي إلى الأمام عالمي والعقاقير كبسولة تفجير للمجالات جسم ثابت فئة معينة، تم تضخيم مرناس جسم موحد بنسب تعكس تلك الترددات في جسم السكان. كانت متسلسلة أمبليكونس من الجيل التالي التسلسل (خ ع)، مما أسفر عن أكثر من 10 تسلسلات جسم5 كل عينة المناعية. يصف لنا البروتوكولات لتحاليل تسلسل جسم بما في ذلك الشرح الخامس (د) ي-جين-الجزء، عرضاً بديعا لمرجع الأجسام المضادة، ولدينا طرق حسابية.

مبدع الضد من الماوس
يمكن الحصول على منظور مرجع جسم مورين ككل من الخلايا أو الأنسجة مثل الطحال، ونخاع العظام، والعقدة الليمفاوية، أو الدم. ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية IgM، IgG1، IgG2c، وإعطاء الغلوبولين المناعي مبدع سلسلة الخفيفة (IgL) من طحال ماوس ساذج. ويرد موجز لقراءة الأرقام في الجدول 3. على سبيل المثال، ما يلي: 166,175/475,144 الواردة محددة IgM التوقيع تسلسل (الجدول 2) ويقرأ 133,371/166,175 كانت فدج-الإنتاجية الاستدلال إيجبلاست19.
ويبين الشكل 3 ملف تعريف مرجع لإعادة ترتيب فدج من 3D-فدج-الأرض، الذي يمثل حجم كل الكرة العدد النسبي لما يلي؛ وبعبارة أخرى، عدد مرناس جسم بأكمله ب الخلايا. مش ثلاثي الأبعاد يتكون من 110 إيغف، إيغد 12، وإيغج 4، الذي يتم محاذاته إلى تعكس ترتيبها على الصبغي. وباﻹضافة إلى ذلك، جمعت الجينات مبهمة يسندها إيجبلاست بشكل منفصل في الموضع الأخير لكل خط إيغف وإيغد وإيغج، مما أدى إلى عقد 7,215 في متوازي المستطيلات.
أيضا، هو مبين في الشكل 3 هو مؤامرة 2D الجيش اليوغوسﻻفي عرض التشكيل الجانبي لإعادة ترتيب الجيش اليوغوسﻻفي في مرجع IgL. ويمثل طول كل شريط في هذه المؤامرة العدد النسبي لما يلي. ويمثل المحور السيني 101 IGLVκ و 3 IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 4 IGLJκ و 3 IGLJλ الجينات. يتم تمثيل في أونانوتاتيد الخامس-ي-الجينات وعلى الشريط الحدودي اليمنى.
منطقة تحديد التكامل 3 (CDR3) تعطي تسلسل هذه القراءة المنتجة، التي تؤدي إلى غالبية خصوصية مستضد ملزمة، في النواتج إيجبلاست. CDR3 تسلسل يمكن تحليلها إحصائيا، بما في ذلك replicates البيولوجية أو التقنية، كما هو موضح سابقا8،10.
مبدع جسم الإنسان
يمكن تحليلها من منظور مرجع جسم الإنسان ككل من مختلف الأنسجة بما في ذلك خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو الأنسجة المرضية. ويبين الشكل 4 نتائج تمثيلية من IgM، مجموع مفتش (IgG1 و IgG2، IgG3 و IgG4)، ومجموع إيغا (IgA1 و IgA2) وفريق الخبراء الحكومي الدولي و IgD IgL مبدع من ببمكس العادية. ويرد موجز لقراءة الأرقام في الجدول 3. على سبيل المثال، ما يلي: 90,238/1,582,754 الواردة تسلسل التوقيع IgM على حدة ويقرأ 67,896/90,238 كانت فدج الإنتاجية.
الشخصية مرجع لإعادة ترتيب فدج المعروضة في 3D--فدج-مؤامرة الذي يمثل حجم كل الكرة العدد النسبي لما يلي؛ وبعبارة أخرى، عدد مرناس جسم من أسرة ببمكس (الشكل 4). مش ثلاثي الأبعاد يتكون من إيغف 56 و 27 إيغد إيغج 6، الانحياز في ترتيب ظهورها في الكروموسوم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تمثيل الجينات مبهمة يسندها إيجبلاست كل على حدة في الموضع الأخير لكل خط إيغف وإيغد وإيغج، مما أدى إلى عقد 11,172 في متوازي المستطيلات.
التشكيل الجانبي لإعادة ترتيب الجيش اليوغوسﻻفي في مرجع IgL يرد في 2D-VJ-مؤامرة الذي يمثل طول كل شريط العدد النسبي لما يلي (الشكل 4). ويمثل المحور السيني 41 IGLVκ و 32 IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 5 IGLJκ و 5 IGLJλ الجينات. الأمم المتحدة المشروح الخامس-ي-الجينات وممثله في الشريط الحدودي اليمنى.
وترد في تسلسل CDR3 البشرية في إيجبلاست النواتج ويمكن تحليلها إحصائيا كما هو موضح سابقا8،10.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الطبقة الغلوبولين المناعي</td>
			<td>معنى</td>
			<td>أنتيسينسي</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ماوس سلاسل ثقيلة الغلوبولين المناعي (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>أجتكاجتككتكككااتجتك</td>
			<td>جاكاتتججاجاكتجاكت</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG1</td>
			<td>آآآكجاكاكككككاتكتجتك</td>
			<td>جاكاجاتججججتجتكجتتت</td>
		</tr>
<tr>
<td>(IgG1 المتغير)</td>
			<td>آآآكاكاكككككاتكاجتك</td>
			<td>جاكتجاتججججتجتجتتت</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2c</td>
			<td>آآآكاكاجككككاتكجتك</td>
			<td>جاككجاتجججكتجتجتتت</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG3</td>
			<td>جتجاتكككجتجاتاتكجكت</td>
			<td>أجككجاتاتكاكججاتكاك</td>
		</tr>
<tr>
<td>إيغا</td>
			<td>تكككتجتكككتجكتجكاج</td>
			<td>تكككتجتكككتجكتجكاج</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ماوس الغلوبولين المناعي سلاسل خفيفة (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>كتجتاتككاتكتكككاككاتككاجتجاجك</td>
			<td>جكتكاكتجاتجتججاجاتجاتاكاج</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1</td>
			<td>تجتتككاككتككتكتجاجاجكتكجاج</td>
			<td>كتكجاجكتكتكاجاجاجتجااكا</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ2</td>
			<td>تجتتككاككتككتكتجاجاجكتكاج</td>
			<td>كتجاجكتككتكاجاجاجتجااكا</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3</td>
			<td>تجتتككاككتككككتجاجاجكتككاج</td>
			<td>كتجاجكتككتكاجججاجتجااكا</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ4</td>
			<td>تجتكككاككتككتكتجاجاجكتكاج</td>
			<td>كتتجاجكتكتكاجاجاجتججاكا</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">سلاسل ثقيلة الغلوبولين المناعي البشري</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>ججاجتجكاتككجككككاك</td>
			<td>جتجججكجاتجكاكتككك</td>
		</tr>
<tr>
<td>مفتش</td>
			<td>جكتككاككاججكككاتك</td>
			<td>جاتججكككتجتجاجك</td>
		</tr>
<tr>
<td>إيغا</td>
			<td>جكاتككككجاككاجككككا</td>
			<td>جاككجاتجججكتجتجتتت</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgD</td>
			<td>جكاكككاككاجكتككجا</td>
			<td>تككجاجككتجتججتجك</td>
		</tr>
<tr>
<td>فريق الخبراء الحكومي الدولي</td>
			<td>جككتككاكاكاجاجكككاتك</td>
			<td>جاتججكتكتجتجتجاجك</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الغلوبولين المناعي البشري سلاسل خفيفة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>أكتجتجكتجكاككاتكتجك</td>
			<td>جكاجاتجتجكاجككاكاجت</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1، 2, 6</td>
			<td>جتكاكتكتجتكككجكككتك</td>
			<td>جاججكججاكاجاجتجاك</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3, 7</td>
			<td>جتكاكتكتجتكككاكككتك</td>
			<td>جاججتججاكاجاجتجاك</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: موجز لتسلسل التوقيع الغلوبولين المناعي

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>فائق الماوس</td>
			<td>مجموع ما يلي:</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>IgG2c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الإدخال</td>
			<td>475,144</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية</td>
			<td></td>
			<td>166,175</td>
			<td>229,671</td>
			<td>36,628</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>فدج الإنتاجية</td>
			<td></td>
			<td>133,371</td>
			<td>196,583</td>
			<td>31,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgL الماوس</td>
			<td>مجموع ما يلي:</td>
			<td>إيجكابا</td>
			<td>إيجلامبدا</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الإدخال</td>
			<td>527,668</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية</td>
			<td></td>
			<td>178,948</td>
			<td>21,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجيش اليوغوسﻻفي الإنتاجية</td>
			<td></td>
			<td>160,924</td>
			<td>16,988</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الإنسان فائق</td>
			<td>مجموع ما يلي:</td>
			<td>IgM</td>
			<td>مفتش</td>
			<td>إيغا</td>
			<td>IgD</td>
			<td>فريق الخبراء الحكومي الدولي</td>
		</tr>
<tr>
<td>الإدخال</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية</td>
			<td></td>
			<td>90,238</td>
			<td>5,298</td>
			<td>94,061</td>
			<td>75,549</td>
			<td>2,932</td>
		</tr>
<tr>
<td>فدج الإنتاجية</td>
			<td></td>
			<td>67,896</td>
			<td>2,775</td>
			<td>78,203</td>
			<td>56,495</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgL البشرية</td>
			<td>مجموع ما يلي:</td>
			<td>إيجكابا</td>
			<td>إيجلامبدا</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الإدخال</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية</td>
			<td></td>
			<td>120,316</td>
			<td>64,148</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجيش اليوغوسﻻفي الإنتاجية</td>
			<td></td>
			<td>97,169</td>
			<td>52,324</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: موجز لقراءة الأرقام في التجارب
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig1.jpg"> رقم 1: التمثيل التخطيطي لتسلسل الاستراتيجية لتحليل مبدع الأجسام المضادة في الفئران الفردية- (A) الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المناعية أو الأنسجة تم نسخها من الاتجاه المعاكس وتضخيم PCR باستخدام الدليل العالمي إلى الأمام، وعكس الغلوبولين المناعي فئة معينة كبسولة تفجير. أمبليكونس من كل فئة الغلوبولين المناعي المجمعة والمقدمة لتسلسل الجيل القادم. (ب) يتطابق البيولوجية مثل الطحال من الفئران C57BL/6 يعاملون كما يلي: الكشف التام من تنقيته من عينات الطحال، وتم تضخيم كدناس 5 '--سباق استخدام التمهيدي عالمي وجسم فئة معينة التمهيدي. ثم أنها قدمت لتسلسل الجيل المقبل بوصفها كبسولة تفجير للفئران الفردية. أجزاء من هذا الرقم يتم تكييفها من8 مع الإذن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig2.jpg"> رقم 2: التخطيطي لمخطط انسيابي تجهيز البيانات لتحليل مبدع الأجسام المضادة في الفئران الفردية- تم تجهيز ما يلي أمبليكون التي تم الحصول عليها بعد تسلسل الجيل القادم كما يلي: تم التحقق من تسلسل قراءة (1) لوجود جسم تسلسل التوقيع فئة معينة؛ (2) وبحثت تسلسل الخامس، د، والجين ي الأجزاء باستخدام إيمجت/حايف-كويست و/أو إيجبلاست؛ (3) وقد جمعت التسلسل التي تحتوي على مفترق فدج إنتاجية؛ (4)، وقد استخدمت هذه التسلسلات لتحليل ميزات مرجع ممارسات مجلس الأمن عموما، CDR3، وما إلى ذلك <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig3.jpg"> الشكل 3: التصور البيانات العالمية للماوس جسم مبدع. كانت تصور الملامح مرجع الشامل لكل فئة جسم من 3D-فدج-المؤامرة. ويمثل المحور السيني 110 إيغف الجينات أمر على كروموسوم. Y-و z المحور المحور يمثل إيغد 12 و 4 إيغج الجينات، على التوالي. ويمثل حجم المجالات على كل عقده عدد القراءات. مجالات حمراء: الجينات الخامس ود ي الأمم المتحدة المشروح. IgL قراءة تظهر التوزيعات في 2D-VJ-مؤامرة الذي يمثل طول كل شريط العدد النسبي لما يلي. ويمثل المحور السيني 101 x IGLVκ و 3 x IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 4 x IGLJκ و 3 x IGLJλ الجينات. يتم تمثيل الجينات V و J الأمم المتحدة المشروح في الشريط الحدودي حق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig4.jpg"> الشكل 4: التصور البيانات العالمية لجسم الإنسان مبدع. كانت تصور الملامح مرجع الشامل لكل فئة جسم من 3D-فدج-المؤامرة. ويمثل المحور السيني 56 جينات إيغف أمر على كروموسوم. Y-و z المحور المحور يمثل إيغد 27 و 6 إيغج الجينات، على التوالي. ويمثل حجم المجالات على كل عقده عدد القراءات. مجالات حمراء: الجينات الخامس ود ي الأمم المتحدة المشروح. هي صفت يقرأ IgL في 2D-VJ-المؤامرة التي يمثل طول كل شريط العدد النسبي من ما يلي. المحور السيني يمثل 41 x IGLVκ و 32 x IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 5 x IGLJκ و 5 x IGLJλ الجينات. الأمم المتحدة المشروح الخامس-ي-الجينات وممثله في الشريط الحدودي اليمنى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات للتحليل والتصور للهيكل والدستور لجسم كله مبدع. وهذا ينطوي على الحصول على تسلسل واسعة لاستخدام الجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي جسم.

تحديد الماوس وجسم الإنسان مبدع بتسلسل الجيل المقبل

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

في هذا الفيديو، نحن وصف طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل ذخيرة الأجسام المضادة على المستوى العالمي. من الممكن وصف ذخيرة الخلية B بأكملها لدى الأفراد وتغيراتها الديناميكية استجابة للتحفيز المناعي. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل العينات المرضية من المرضى من العدوى الفيروسية الناشئة والحصول على البيانات مع نظرة غير مسبوقة في التسبب في العدوى.ومن أكثر المجالات إثارة في هذا التطبيق هو مكافحة اللقاحات. يمكن تقييم فعالية اللقاح من خلال تحليل ديناميات ذخيرة الأجسام المضادة العالمية لدى الأفراد الذين يُدارون باللقاحات. الفرد جديدة لهذه الطريقة قد تحتاج إلى تحسين شروط PCR لأن كفاءة تضخيم الجينات المضادة للأجسام يعتمد على أنواع المواد الأولية.Fla-cher لتحديد الأمبلونات المناعية. من المهم إظهار هذه الإجراءات بصريا. وسوف يكون إثبات الإجراء الآنسة سايوري ياماغوتشي والسيد هانبينغ شيويه، وهو فني وطالب دراسات عليا من مختبري.لبدء هذا الإجراء، تشريح الأنسجة من ثمانية أسابيع من ماوس أسود C57 وتمريرها من خلال شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني للحصول على الخلايا المتناثرة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentuge ميليلتر اثنين وطاردة مركزية في 600 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة 800 ميكرولترات من ACK lysing العازلة إلى بيليه.احتضان على الجليد لمدة دقيقتين لخلود خلايا الدم الحمراء في الأنسجة. بعد ذلك ، قم بغسل خلايا الأنسجة ثلاث مرات باستخدام ثلاثة ملليلترات من PBS لكل غسل. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تجاهل supernatant وإضافة 800 ميكرولتردات من الفينول / guanidine isothiocyanate كاشف إلى بيليه ودوامة تماما. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم ويهز يدويا لمدة 15 ثانية.احتضان في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لفصل المراحل. نقل المرحلة مائي العلوي إلى أنبوب جديد.إضافة حجم واحد من 70٪ الإيثانول. دوامة لفترة وجيزة وتطبيق هذا الخليط على العمود تدور السيليكا. Elute الجيش الملكي النيبالي مع 30 إلى 100 ميكرولترتر من الماء.بعد ذلك، استخدمي مقياس الفلور لكميات تركيز الحمض النووي الريبي الأولي. تخزين RNA المنقى في ناقص 80 درجة مئوية. أولا، توليف cDNA أول حبلا من اثنين إلى 10 ميكروغرام من مجموع RNA قالب باستخدام 5'RACE CDS التمهيدي وOLIGONUcleotide سمارت-PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.بالنسبة للغلوبولين المناعي للماوس، يضخّم PCR cDNA مع بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة، وذلك باستخدام التمهيدي الأمامي الشامل والغلوبولين المناعي الخاص بالطبقات، كما هو موضح في بروتوكول النص. بالنسبة للغلوبولين المناعي البشري، قم بإجراء أول PCR باستخدام التمهيدي الأمامي الشامل والغلوبولين من فئة محددة مع تسلسلات العلامات. تضمين تسلسلات الفهرس لكل عينة بواسطة PCR الثانية باستخدام التمهيديات تسلسل الفهرس.بعد ذلك، electrophorese أي من المنتجات PCR على هلام agarose 2٪. تصور نطاقات الحمض النووي على transilluminator UV واستئصال شريحة هلام تحتوي على النطاق العريض بين 600 و 800 أزواج قاعدة. إضافة 10 ميكرولترات من محلول ملزم للأغشية لكل 10 ملليغرام من شريحة هلام.مزيج واحتضان في 50 إلى 65 درجة مئوية حتى شرائح هلام تذوب تماما. ثم، نقل حل هلام على عمود تدور غشاء السيليكا. غسل العمود مرة واحدة مع عازلة الغسيل و elute الحمض النووي مع 50 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى.باستخدام الفلور، وتحديد كمي amplicons المنقى وتجمع amplicons من كل فئة من الغلوبولين المناعي في كميات متساوية لتسلسل NGS. بعد ذلك، استخدم كهرباء تعتمد على الكابيل المجهري مع رقاقة التحجيم للحمض النووي لتحديد حجم المكتبات وتركيزها. تخزين المكتبات في ناقص 20 درجة مئوية.أولاً، قم بإنشاء جدول بيانات عينة من تشغيل التسلسل كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، اذيب خرطوشة الكاشف والمكتبات. جعل الحل الطبيعي 0.2 من هيدروكسيد الصوديوم وتمييع المكتبات للحصول على التركيزات الولي المطلوب.ثم شطف وتجفيف الخلية تدفق وإضافة 600 ميكرولترات من حل مكتبة مخففة ومشوهة في بئر خرطوشة الكاشف، والبدء في تشغيل تسلسل. يمكن الحصول على منظور لذخيرة الأجسام المضادة للورين ككل من خلايا أو أنسجة مثل الطحال أو نخاع العظم أو العقدة الليمفاوية أو الدم. تظهر هنا نتائج تمثيلية لـ IgM وIgG1 وIgG2c وسلسلة الغلوبولين المناعية الخفيفة من طحال الماوس الساذج.في V(D) J إعادة ترتيب بواسطة 3D V (D) J مؤامرة، حجم كل كرة يمثل العدد النسبي من يقرأ. وبعبارة أخرى، فإنه يمثل عدد من الأجسام المضادة mRNAs في الخلايا B كاملة. تتكون الشبكة ثلاثية الأبعاد من 110 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة V، و12 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة D، وأربعة جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة مناعية J، والتي تتماشى لتعكس ترتيبها على الكروموسوم.تُظهر مؤامرة VJ 2D ملف إعادة ترتيب VJ في ذخيرة IGL. يمثل طول كل شريط عدد القراءات النسبي. ويمثل المحور X 101 من سلسلة الضوء مناعية الغلوبولين V-كابا الجينات, وثلاثة الجينات V-لامدا سلسلة الضوء مناعية, ويمثل المحور Y أربعة الجينات J-كابا سلسلة الضوء المناعية, وثلاثة الجينات J-لامدا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي.يمكن تحليل منظور لذخيرة الأجسام المضادة البشرية ككل من أنسجة مختلفة بما في ذلك خلايا الدم أحادية النواكل المحيطية أو الأنسجة المرضية. تظهر هنا النتائج التمثيلية لـ IgM، وإجمالي IgG، وإجمالي IgA، وIgD، وIgE، وIgL من خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية الطبيعية. مثل نموذج murine ، يظهر ملف تعريف ذخيرة من V (D) J إعادة ترتيب على 3D V(D) J مؤامرة فيها حجم كل كرة يمثل العدد النسبي من القراءات.تتكون الشبكة ثلاثية الأبعاد من 56 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة V ، و 27 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة D ، وستة جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة مناعية J ، تتماشى في الترتيب الذي تظهر عليه على الكروموسوم. يتم تصوير ملف إعادة ترتيب VJ في مرجع IgL في مؤامرة VJ 2D حيث يمثل طول كل شريط العدد النسبي من القراءات. ويمثل المحور X 41 من سلسلة الضوء مناعية الغلوبولين V-كابا الجينات, و 32 مناعيا سلسلة الضوء V-لامدا الجينات, ويمثل المحور Y خمسة الجينات J-كابا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي, وخمسة الجينات J-لامدا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي.في المواد الدراسية لهذا البروتوكول ، وعدد قليل من الخلايا فرزها عن طريق تدفق الخلايا أو حتى بكيريف العينات المرضية قابلة للاستخدام. ومع ذلك، سيكون من الضروري تحسين ظروف نظام PCR بعناية. لأن المعلومات الناتجة من هذا البروتوكول ضخمة ، ومحو الأمية المعلوماتية الحيوية من شأنه أن يساعد على العثور على هيكل شبكة الأجسام المضادة.وهذا من شأنه أن يؤدي إلى فهم عميق للجهاز المناعي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...