Name: identification of mouse and human antibody repertoires by next-generation sequencing
Uploaded: 2019-03-15T13:30:00
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<ol>
	<li>Schroeder, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+and+divergence+in+the+development+and+expression+of+the+mouse+and+human+antibody+repertoires.">Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).</li><li>Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+generation+of+antibody+diversity.">Somatic generation of antibody diversity.</a> Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).</li><li>Georgiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+challenge+of+high-throughput+sequencing+of+the+antibody+repertoire.">The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire.</a> Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).</li><li>Lees, W. D., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Antibody+Repertoires+with+Next-Generation+Sequencing.">Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).</li><li>Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A., Fisher, D. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+zebrafish+antibody+repertoire.">High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire.</a> Science. 324 (5928), 807-810 (2009).</li><li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+description+of+antibody+heavy-chain+repertoires+in+humans.">High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans.</a> PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+in+the+germline+Ig+gene+repertoire+inferred+from+variable+region+gene+rearrangements.">Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.</a> Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).</li><li>Kono, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+antigen-responding+antibody+repertoires+by+using+next-generation+sequencing+and+confirming+them+through+antibody-gene+synthesis.">Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinism+and+stochasticity+during+maturation+of+the+zebrafish+antibody+repertoire.">Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distorted+antibody+repertoire+developed+in+the+absence+of+pre-B+cell+receptor+formation.">Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).</li><li>Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+verification+of+transcriptional+starting+sites+by+Deep-RACE.">High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE.</a> Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).</li><li>Yeku, O., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends+(RACE).">Rapid amplification of cDNA ends (RACE).</a> Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).</li><li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+template+switching:+a+SMART+approach+for+full-length+cDNA+library+construction.">Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).</li><li>Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+measurement+of+memory+B-cell+recall+using+antibody+repertoire+sequencing.">Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTer RACE 5&#8217;/3&#8217; Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).</li><li>. Perl Available from: <a target="_blank" href="https://perldoc.perl.org/">https://perldoc.perl.org/</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2016).</li><li>Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgBLAST:+an+immunoglobulin+variable+domain+sequence+analysis+tool.">IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).</li><li>. IgBLAST Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html</a> (2018)</li><li>Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=454+antibody+sequencing+-+error+characterization+and+correction.">454 antibody sequencing - error characterization and correction.</a> BMC Research Notes. 4, 404 (2011).</li><li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT,+the+international+ImMunoGeneTics+information+system.">IMGT, the international ImMunoGeneTics information system.</a> Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).</li><li>Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT((R))+tools+for+the+nucleotide+analysis+of+immunoglobulin+(IG)+and+T+cell+receptor+(TR)+V-(D)-J+repertoires,+polymorphisms,+and+IG+mutations:+IMGT/V-QUEST+and+IMGT/HighV-QUEST+for+NGS.">IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS.</a> Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).</li><li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+determination+of+the+diversity+of+a+combinatorial+antibody+library+gives+insight+into+the+human+immunoglobulin+repertoire.">Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , (2015).</li><li>Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+during+development+of+VH11++B+cells:+a+model+for+natural+autoantibody-producing+CD5++B+cells.">Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells.</a> Immunological Reviews. , 60-74 (2004).</li></ol>

लेखकों के हित का कोई विरोध प्रकट करना है.

विधि यहां वर्णित एंटीबॉडी आरएनए के लिए NGS का इस्तेमाल 5 '-दौड़ विधि का उपयोग प्रवर्धित । के विपरीत विधियों का उपयोग करें कि अपभ्रष् ट 5 '-VH जीन primers, प्रत्येक एंटीबॉडी वर्ग के mrnas समान रूप से परिलक्षित होते है सार्वभौमिक आगे primers का उपयोग कर । इसके अलावा, एंटीसेंस के उपयोग के लिए विशिष्ट प्राइमरों स्थिरांक-क्षेत्र 1 (CH1) एंटीबॉडी जीन के विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन कक्षाओं के प्रदर्शनों की रूपरेखा सक्षम बनाता है । यह वर्ग विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया विदारक के लिए बहुत फायदेमंद है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में भोली और प्रतिरक्षित repertoires8,9की तुलना के लिए ।
इस विधि का सबसे संभावित रूप से होने वाला नुकसान प्रवर्धित इम्युनेस्टोबुलिन संदेशों की कमी है । इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एंटीबॉडी रिपरटॉयर की गहराई काफी हद तक चरण ३.१ और ३.२ में वर्णित पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करती है । यदि रिपरटॉयर गहराई ठीक से प्राप्त नहीं है, कदम 3.2.1 या 3.2.2 में टेम्पलेट cdna और प्राइमरों के अनुपात में परिवर्तन दृढ़ता से सिफारिश की है.
आम तौर पर, NGS द्वारा उत्पादित एंटीबॉडी पढ़ता का लगभग 20% अस्पष्ट दृश्यों21हैं । यहां तक कि स्थापित "सुधार विधियों" के साथ, 5-10% अस्पष्ट3रहते हैं । इसलिए हम, अनुक्रम और फ़िल्टर्ड कच्चे हस्ताक्षर इम्युनोग्लोबुलिन निरंतर क्षेत्रों (cμh1, Cγ1H1, Cγ2cH1, आदि) के अनुरूप दृश्यों युक्त पढ़ता विश्लेषण किया । इसलिए दैहिक हाइपर-म्यूटेशन के विश्लेषण के लिए सावधान परीक्षाओं की जरूरत होती है.
इस विधि की सीमाओं में से एक यह है कि इम्युनोग्लोबुलिन भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़ी inferred करने में असमर्थ है । इसलिए इस विधि द्वारा प्राप्त प्रदर्शनों की दृष्टि समग्र नहीं है । हालांकि, यह डेटा10के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा शीर्ष रैंकिंग जोड़े अनुमानित करने के लिए संभव है । इसके अलावा, इम्युनोग्लोबुलिन जोड़े अनुक्रम करने के लिए एक उपंयास विधि हाल ही में3,4की सूचना दी थी ।
इम्युनोग्लोबुलिन आउटपुट में अनुक्रम. fna डेटा इम्युनोग्लोबुलिन जीन हस्ताक्षर दृश्यों की उपस्थिति के आधार पर निकाले गए. इसके बाद वी, डी, और जे जीन सेगमेंट को एनोटेटेड किया गया और वी (डी) जे पुनर्व्यवस्था की उत्पादकता का आकलन किया गया. पूरकता-निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) दृश्यों को भी एनोटेटेड किया गया । . fna डेटा में इम्युनोग्लोबुलिन दृश्यों की इन व्यवस्थित परीक्षाओं के लिए उपयोगी imgt/highv-क्वेस्ट सर्वर22,23,24द्वारा प्रदान किए गए थे । हालांकि, एक स्वचालित प्रसंस्करण पाइप लाइन के निर्माण के लिए बड़े प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण करने के लिए योग्यता है । पाइपलाइन प्रत्येक उद्देश्य के लिए अनुकूलित स्टैंडअलोन IgBLAST प्रोटोकॉल19का उपयोग करके स्थापित करने के लिए संभव है । यह दृष्टिकोण बुनियादी प्रोग्रामिंग साक्षरता की जरूरत है, लेकिन इम्युनोग्लोबुलिन प्रणाली का विस्तृत विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी है । वर्णित पाइपलाइनों अनुकूलित प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के उदाहरण हैं ।
एंटीबॉडी पढ़ता की संख्या नमूना में एंटीबॉडी rnas की राशि के लिए आनुपातिक है, प्रतिरशि के घटकों को दर्शाते समय अंक5,8,25पर एंटीबॉडी सिस्टम । यहां वर्णित विधि वी (डी) जंमू एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची का उपयोग कर के एक पक्षी के नेत्र देख देता है आर कार्यक्रम8,18,26।
व्यक्तिगत भोली चूहों के IgM एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की वैश्विक दृष्टि से IgG1 या IgG2c8के उन लोगों की तुलना में एक अत्यधिक संरक्षित vdj-प्रोफ़ाइल का पता चला । यह बताया गया है कि अपरिपक्व zebrafish के vdj संयोजन अत्यधिक टकसाली9रहे हैं । इसके विपरीत, मानव VDJ संयोजन करने के लिए अत्यधिक विषम6सूचित कर रहे हैं. भोले बी कोशिकाओं में अत्यधिक संरक्षित निर्धारणात्मक VDJ-प्रोफाइल शायद या तो विषम VDJ द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं-rearrangements या ऑटो के साथ नकारात्मक चयन-शरीर में प्रस्तुत एंटीजन. उदाहरण के लिए, IGHV11-2 भ्रूण igm प्रदर्शनों की क्रिया27 में बेहतर ढंग से व्यक्त की है और इस प्रबलता IGHV11 की autoreactivity के लिए जिंमेदार ठहराया है-2 सेनेसेंट एरिथ्रोसाइट्स के खिलाफ27। दिलचस्प है, IGHV11-2 भी भोले IgM8के हमारे पहले प्रकाशित विश्लेषण में सबसे आम प्रमुख प्रदर्शनों की खबर थी ।
यहां वर्णित विधि एंटीबॉडी-रिपरटॉयर व्यक्तिगत निकायों में उत्पन्न अंतरिक्ष का विश्लेषण करके antigen-उत्तरदायी एंटीबॉडी रिपरटोअर्स गूढ़ रहस्य के लिए उपयोगी है, कुंजी एंटीबॉडी प्रदर्शनों की जाँच8के असावधानीवश चूक से बचने, 10. इस विधि भी विस्तृत एंटीबॉडी नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा है, जो नए उभरते रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षात्मक एंटीबॉडी की त्वरित खोज की सुविधा होगी की अनुमति देता है ।

एंटीबॉडी प्रणाली अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली की बुनियादी बातों में से एक है । यह अत्यधिक अपने विशाल विविधता, ठीक प्रतिजन मांयता विशिष्टता के कारण रोगजनकों आक्रमण के खिलाफ शक्तिशाली है, और प्रतिजन विशिष्ट बी कोशिकाओं के क्लोनी विस्तार । एंटीबॉडी उत्पादक बी कोशिकाओं के प्रदर्शनों की एक एकल व्यक्ति1में 1015 से अधिक होने का अनुमान है । इस अपार विविधता इम्युनोग्लोबुलिन आनुवंशिक loci2में vdj जीन पुनर्संयोजन की मदद से उत्पंन होता है । पूरे बी सेल रिपरटोअर्स और antigen-प्रतिरक्षण के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तन का विवरण इसलिए चुनौतीपूर्ण है, लेकिन आक्रमण रोगजनकों के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है ।
उनकी खगोलीय विविधता के कारण बी सेल रिपरटोअर्स को ब्लैक बॉक्स माना गया है; हालांकि, ngs प्रौद्योगिकी के आगमन उनकी जटिलता3,4के एक बढ़ाया समझ के लिए सफलताओं सक्षम है । पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स सफलतापूर्वक विश्लेषण किया गया है, सबसे पहले zebrafish में5, फिर6चूहों, और मनुष्यों6,7. हालांकि NGS अब अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, समानताएं और व्यक्तिगत जानवरों के बीच एंटीबॉडी रिपरटोअर्स में मतभेदों के बुनियादी विश्लेषण की कमी है ।
चूहों में, यह बताया गया है कि IgM repertoires लगभग व्यक्तियों के बीच समान हैं, जबकि IgG1 और IgG2c के उन व्यक्तियों के बीच काफी अलग हैं8. वी के अलावा जीन उपयोग प्रोफ़ाइल, भोली परिधीय बी कोशिकाओं में VDJ-प्रोफाइल की मनाया आवृत्ति अत्यधिक8व्यक्तियों के बीच समान है । VDJ-क्षेत्र के अमीनो एसिड दृश्यों का विश्लेषण भी अलग चूहों में एक ही जंक्शन दृश्यों की घटना से अधिक बार पहले सोचा था कि8दिखाया । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एंटीबॉडी प्रदर्शनों की प्रक्रिया के गठन के लिए तंत्र के बजाय प्रसंभाव्य5,8,9निर्धारणात्मक हो सकता है । चूहों में एंटीबॉडी प्रदर्शनों की क्रिया विकास की प्रक्रिया को भी सफलतापूर्वक NGS का उपयोग करने के लिए और अधिक विस्तार से एंटीबॉडी प्रतिरक्षा प्रणाली को उजागर करने के लिए NGS की क्षमता को उजागर विश्लेषण किया गया है10।
इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और एक वैश्विक स्तर पर एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की रिपोर्ट का विश्लेषण ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL Strip Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0452</td>
			<td>120 strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>DNA-035</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Systems</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA /2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-00256</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, NuSieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-02606</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (-)&#8220;Nissui&#8221;</td>
			<td>NISSUI&#160;</td>
			<td>08192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>50/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ling lock tube 1.7 mL</td>
			<td>BM EQUIPMENT</td>
			<td>BM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ling lock tube 2.0 mL</td>
			<td>BM EQUIPMENT</td>
			<td>BM-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>500 cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-03275</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>500 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer RACE 5&#8217;/3&#8217; Kit&#160;</td>
			<td>Clontech&#160;</td>
			<td>634858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq Hot Start Version&#160;</td>
			<td>Takara Bio Inc.&#160;</td>
			<td>RR006A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>AmbionThermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear qPCR Caps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0866</td>
			<td>120 strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of mouse and human antibody repertoires by next-generation sequencing

एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन मांयता की अपार अनुकूलनशीलता अर्जित प्रतिरक्षा प्रणाली का आधार है । आणविक अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा एंटीबॉडी के विशाल प्रदर्शनों की प्रक्रिया के उत्पादन अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ के बावजूद, यह अभी तक एक पूर्ण एंटीबॉडी प्रदर्शनों की दर के एक वैश्विक दृष्टिकोण पर पहुंचने के लिए संभव नहीं किया गया है । विशेष रूप से, बी सेल रिपरटोयर्स एंटीबॉडी क्लोन की उनकी खगोलीय संख्या की वजह से एक ब्लैक बॉक्स के रूप में माना गया है । हालांकि, अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों सफलताओं को सक्षम करने के लिए बी सेल प्रदर्शनों की संख्या के बारे में हमारी समझ में वृद्धि कर रहे हैं । इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और पूरे व्यक्तिगत माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स विश्लेषण । प्रतिरक्षा अंगों से, मानव में चूहों और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में तिल्ली से प्रतिनिधित्व, कुल आरएनए तैयार किया गया था, रिवर्स transcribed, और 5 '-दौड़ विधि का उपयोग कर प्रवर्धित. एंटीबॉडी वर्ग विशिष्ट निरंतर डोमेन के लिए एक यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और एंटीसेंस प्राइमरों का प्रयोग, एंटीबॉडी mRNAs समान रूप से एंटीबॉडी आबादी में उनकी आवृत्तियों को दर्शाती अनुपात में परिलक्षित थे । amplicons अगली पीढ़ी अनुक्रमण (ngs), प्रतिरक्षा नमूना प्रति 10 से अधिक5 एंटीबॉडी दृश्यों से उपज द्वारा अनुक्रम थे । हम एंटीबॉडी अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन वी सहित (डी) जे जीन-खंड एनोटेशन, एक पक्षी है एंटीबॉडी प्रदर्शनों की श्रृंखला के नेत्र दृश्य, और हमारे कंप्यूटेशनल तरीकों ।

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Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

यहां, हम विश्लेषण और संरचना और पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स के गठन के दृश्य के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । यह एंटीबॉडी आरएनए के विशाल दृश्यों का अधिग्रहण अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग शामिल है ।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की पहचान

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

इस वीडियो में, हम वैश्विक स्तर पर एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करते हैं। व्यक्तियों में पूरे बी सेल प्रदर्शनों और प्रतिरक्षा उत्तेजना के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तनों का वर्णन करना संभव है। इस विधि को उभरते वायरल संक्रमणों के रोगियों से रोगीय नमूनों का विश्लेषण करने और संक्रमण के रोगजनकों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है।आवेदन के लिए सबसे रोमांचक क्षेत्रों में से एक एक टीका नियंत्रण है। वैक्सीन प्रभावकारिता वैक्सीन प्रशासित व्यक्तियों में वैश्विक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची की गतिशीलता का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है। व्यक्ति इस विधि के लिए नए हैं पीसीआर शर्तों को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि एंटीबॉडी जीन प्रवर्धन की दक्षता शुरू करने वाली सामग्रियों के प्रकारों पर निर्भर करती है।इम्यूनोग्लोबुलिन एम्प्लिकलन की पहचान के लिए फ्ला-चेर। इन कार्यों को नेत्रहीन रूप से प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मिस सायरी यामागुची और श्री हंबिंग Xue, एक तकनीशियन और मेरी प्रयोगशाला से स्नातक छात्र होगा ।इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, एक आठ सप्ताह पुराने C57 काले छह माउस से ऊतक विच्छेदन और यह PBS के दो मिलीलीटर के साथ एक स्टेनलेस स्टील जाल के माध्यम से पारित करने के लिए फैलाया कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए । सेल सस्पेंशन को दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और सेंट्रलाइज में ६०० बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर करें । सुपरनेट को छोड़ दें और गोली में ACK lysing बफर के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें।ऊतक में लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करने के लिए दो मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रत्येक धोने के लिए पीबीएस के तीन मिलीलीटर का उपयोग करके ऊतक कोशिकाओं को तीन बार धोएं। सेंट्रलाइज फिर से ६०० बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ।सुपरनेट को त्यागें और पेलेट और भंवर में फिनोल/ग्वानिडीन आइसोथिओसायनेट रिएजेंट के 800 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें। पांच मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इसके बाद क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोलीटर डालें और 15 सेकंड तक मैन्युअल रूप से हिलाएं।दो मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । चरणों को अलग करने के लिए 12, 000 बार जी और 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। ऊपरी जलीय चरण को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।70% इथेनॉल की एक मात्रा जोड़ें। भंवर संक्षेप में और सिलिका स्पिन कॉलम के लिए इस मिश्रण को लागू करें। 30 से 100 माइक्रोलीटर पानी के साथ आरएनए को एल्यूट करें।इसके बाद, प्रारंभिक आरएनए एकाग्रता को क्वांटिटेट करने के लिए फ्लोरोमीटर का उपयोग करें। शुद्ध आरएनए को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 5'रेस सीडीएस प्राइमर और स्मार्ट-पीसीआर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करके कुल आरएनए टेम्पलेट के दो से 10 माइक्रोग्राम तक पहली-स्ट्रैंड सीडीएनए को संश्लेषित करें।माउस इम्यूनोग्लोबुलिन के लिए, पीसीआर उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज के साथ सीडीएनए को बढ़ाती है, जो टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और इम्यूनोग्लोबुलिन वर्ग-विशिष्ट रिवर्स प्राइमर का उपयोग करती है। मानव इम्यूनोग्लोबुलिन के लिए, टैग दृश्यों के साथ यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और इम्यूनोग्लोबुलिन वर्ग-विशिष्ट रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके पहली पीसीआर करें। इंडेक्स सीक्वेंस प्राइमर का उपयोग करके दूसरी पीसीआर द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए इंडेक्स सीक्वेंस शामिल करें।इसके बाद, 2% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पादों में से किसी भी इलेक्ट्रोफोरेस। एक यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर डीएनए बैंड की कल्पना करें और 600 और 800 बेस जोड़े के बीच व्यापक बैंड वाले जेल स्लाइस को उत्पादित करें। जेल स्लाइस के 10 मिलीग्राम प्रति झिल्ली-बाध्यकारी समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।50 से 65 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और इनक्यूबेट जब तक जेल स्लाइस पूरी तरह से भंग। फिर, सिलिका झिल्ली स्पिन कॉलम पर जेल समाधान स्थानांतरित करें। एक बार कॉलम को धोने के बफर के साथ धोएं और डीएनए को नाभिक मुक्त पानी के ५० माइक्रोलीटर के साथ एल्यूट करें ।फ्लोरोमीटर का उपयोग करके, शुद्ध एम्प्लिकलन की मात्रा निर्धारित करें और प्रत्येक इम्यूनोग्लोबुलिन वर्ग से एम्प्लिकलन को एनजीएस अनुक्रमण के लिए समान मात्रा में पूल करें। इसके बाद, पुस्तकालयों के आकार और एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए डीएनए आकार चिप के साथ माइक्रोकैपिलरी आधारित इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें। पुस्तकालयों को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित अनुक्रमण रन की एक नमूना स्प्रेडशीट उत्पन्न करें। इसके बाद, एक अभिकर्ता कारतूस और पुस्तकालयों गल। सोडियम हाइड्रोक्साइड का 0.2 सामान्य समाधान बनाएं और वांछित मोलर सांद्रता प्राप्त करने के लिए पुस्तकालयों को पतला करें।फिर, प्रवाह कोशिका को कुल्ला और सुखा लें और पतला और विकृत पुस्तकालय समाधान के 600 माइक्रोलीटर को रिएजेंट कारतूस के कुएं में जोड़ें, और अनुक्रमण रन शुरू करें। एक पूरी तरह से एक मुरीन एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची का एक परिप्रेक्ष्य तिल्ली, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड, या रक्त जैसे कोशिकाओं या ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता है। एक भोले माउस तिल्ली से आईजीएम, आईजीजी 1, आईजीजी 2सी और इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन रिस्पोयर के प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाए गए हैं।3 डी वी (डी) जे प्लॉट द्वारा वी (डी) जे पुनर्व्यवस्था में, प्रत्येक गेंद का आकार पढ़ता है की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । दूसरे शब्दों में, यह पूरे बी कोशिकाओं में एंटीबॉडी mRNAs की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । 3डी जाल में ११० इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन वी जीन, 12 इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन डी जीन और चार इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन जे जीन होते हैं, जो गुणसूत्र पर उनके आदेश को प्रतिबिंबित करने के लिए गठबंधन करते हैं ।2डी वीजे प्लॉट आइजीएल प्रदर्शनों की सूची में वीजे पुनर्व्यवस्था की प्रोफाइल दिखाता है । प्रत्येक बार की लंबाई पढ़ता है की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। एक्स-एक्सिस १०१ इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन वी-कापा जीन, और तीन इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन वी-लैम्ब्डा जीन का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-एक्सिस चार इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन जे-कापा जीन, और तीन इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन जे-लैम्ब्डा जीन का प्रतिनिधित्व करता है ।एक पूरे के रूप में एक मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची का एक परिप्रेक्ष्य परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं या रोग ऊतकों सहित विभिन्न ऊतकों से विश्लेषण किया जा सकता है। सामान्य परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से आईजीएम, टोटल आईजीजी, टोटल आईजीए, आईजीडी, आईजीई और आईजीएल प्रदर्शनकारी के प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाए जाते हैं। मुरीन मॉडल की तरह, वी (डी) जे पुनर्व्यवस्था का प्रदर्शनों की सूची प्रोफ़ाइल 3 डी वी (डी) जे प्लॉट पर दिखाया गया है जिसमें प्रत्येक गेंद का आकार पढ़ता है की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है ।3 डी जाल में 56 इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन वी जीन, 27 इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन डी जीन, और छह इम्यूनोग्लोबुलिन हैवी चेन जे जीन होते हैं, जो गुणसूत्र पर दिखाई देने वाले क्रम में गठबंधन करते हैं। आईजीएल प्रदर्शनों की सूची में वीजे पुनर्व्यवस्था की प्रोफाइल 2डी वीजे प्लॉट में दर्शाई गई है जिसमें प्रत्येक बार की लंबाई पढ़ने की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करती है। एक्स-एक्सिस ४१ इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन वी-कप्पा जीन, और ३२ इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन वी-लैम्ब्डा जीन का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-एक्सिस पांच इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन जे-कापा जीन, और पांच इम्यूनोग्लोबुलिन लाइट चेन जे-लैम्ब्डा जीन का प्रतिनिधित्व करता है ।इस प्रोटोकॉल की अध्ययन सामग्री में, प्रवाह साइटोमेट्री या यहां तक कि पैथोलॉजिकल नमूनों के क्रायोसेक्शन द्वारा थोड़ी संख्या में सॉर्ट कोशिकाएं उपयोग करने योग्य हैं। हालांकि, पीसीआर शर्तों का सावधानीपूर्वक अनुकूलन आवश्यक होगा। क्योंकि इस प्रोटोकॉल की आउटपुट जानकारी बहुत बड़ी है, बायोइन्फॉर्मेटिक्स साक्षरता एंटीबॉडी नेटवर्क की संरचना खोजने में मदद करेगी।कि प्रतिरक्षा प्रणाली की गहरी समझ के लिए अप्रतिम नेतृत्व करेंगे ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

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Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

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विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

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म्यूरीन लिम्फोसाइट लेबलिंग द्वारा<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर के लिए लक्ष्य निर्धारण<em&gt; में विवो</em&gt; पीईटी / सी टी द्वारा सेल तस्करी

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

पेप्टाइड स्कैनिंग की मदद से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी मान्यता प्राप्त लीनियर बी-सेल मिलान की पहचान

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

अगली पीढ़ी Electroporation द्वारा प्राथमिक मानव Th17 कोशिकाओं में छोटे आरएनए अभिकर्मक

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...