Name: isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (giver nummer: 25461644) og unge forskere (B) (tildele numre: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) af JSPS KAKENHI.

Brugen af menneskelige prøver for denne undersøgelse blev godkendt af det etiske udvalg af Kobe University Graduate School of Medicine (godkendelse no. 1370 og 1694) og udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. isolering og kultur af UC-MSCs
Bemærk: UC-MSCs har været succesfuldt isolerede, kulturperler, og udvidet (mere end passage nummer 4) fra mere end 200 UCs udsat for denne protokol. Blandt mere end 200 UCs, 100% har vist ...

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues.">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells:+Revisiting+History,+Concepts,+and+Assays.">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li><li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Mesenchymal&amp;#34;+stem+cells.">34;Mesenchymal&amp;#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li><li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferative+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+umbilical+cord+and+bone+marrow.">Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.</a> Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).</li><li>Manochantr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+amnion,+placenta,+Wharton's+jelly+and+umbilical+cord.">Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.</a> Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).</li><li>Arutyunyan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+Cord+as+Prospective+Source+for+Mesenchymal+Stem+Cell-Based+Therapy.">Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy.</a> Stem Cells International. 6901286, (2016).</li><li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Wharton's+Jelly:+The+Rich,+but+Enigmatic,+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells.">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li><li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant.">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation.">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751 (2017).</li><li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord.">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li><li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate.">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method.">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li><li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods.">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li><li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells.">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow.">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li><li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults.">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li></ol>

MSC'er kan isoleres fra en række forskellige væv og er heterogene befolkning af celler, der gør ikke alle express de samme fænotypiske markører. Her, skitseret vi en protokol, der guider indsamling og dissektion af UC fra præmature og udtrykket spædbørn og muliggør isolation og kultur af UC-MSCs. Efter denne protokol, har vi med succes isoleret UC-MSC'er, der opfylder ISCT kriterier19 fra fostre/spædbørn leveret på 19-40 uger af drægtigheden og demonstreret, at de repræsenterer nogle...

Mesenchymale stamceller (msc) er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM)1,2 , men kan også fås fra en bred vifte af væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng 3. MSCs er anerkendt som en heterogen celle population, der kan formere sig og differentiere i adipocytter, osteocytes og chondrocytter. Derudover MSCs besidder evnen til at overflytte til steder af skade, undertrykke og modulere immunrespons, ombygge og reparere skaden. I øjeblikket MSCs fra forskellige kilder har tiltrukket sig stigende interesse som en kilde til celleterapi mod en række genstridig sygdomme, herunder graft - versus klovesyge vært, myokardieinfarkt og cerebral infarkt4,5 .
Selvom BM er den mest godt karakteriseret kilde af MSC'er, begrænser invasionsevne af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod føtal MSCs fremstillet af føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB), og navlestrengen (UC) har fordele, herunder mindre etiske bekymringer med hensyn til prøveudtagning og robust spredning og differentiering kapacitet6 , 7. blandt føtal vedhæng, der som regel kasseres som medicinsk affald, UCB og UC betragtes en føtal orgel, mens placenta anses for fetomaternal. Derudover skal moderkagen og UCB stikprøven og indsamlet på det nøjagtige tidspunkt for nyfødte levering, der henviser til, at moderkagen og UC kan indsamles og behandles efter nyfødte levering. UC er derfor en lovende MSC-kilde til celle terapi8,9.
Menneskelige UC begynder at udvikle med gradvis udvidelse af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtigheden, fortsætter med at vokse indtil 50-60 cm i længden og kan isoleres i hele perioden af nyfødte levering10. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, bruger vi UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre11,12. I denne protokol beskriver vi hvordan man isolerer og karakteriserer UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1455px;" width="1455">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">50mL plastic tube</td>
			<td style="width:336px;">AS One Coporation, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Violamo 1-3500-22</td>
			<td style="width:312px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">12-well plate</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3815-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">60mm dish</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (100 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Alpha MEM</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">135-15175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Reduced serum medium</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td>
			<td style="width:379px;">OPTI-MEM Gibco 31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Gibco 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PBS</td>
			<td style="width:336px;">Takara BIO, Shiga,Japan</td>
			<td style="width:379px;">T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Purified enzyme blends</td>
			<td style="width:336px;">Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:379px;">Liberase DH Research Grade 05401054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347497</td>
			<td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">340364</td>
			<td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555822</td>
			<td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555483</td>
			<td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">550257</td>
			<td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555596</td>
			<td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">560839</td>
			<td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347367</td>
			<td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555749</td>
			<td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555574</td>
			<td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555743</td>
			<td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Viability dye</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">Fixable Viability Stain 450 562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:336px;">Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Block Ace UKB80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSAria&#160; III Cell Sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM software</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Adipogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Osteogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chondrogenic differentiation medium&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:336px;">Polyscience, Warrigton, PA</td>
			<td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Arizarin Red S</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Toluidine Blue</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">198161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Microscope</td>
			<td style="width:336px;">Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants

Mesenchymale stamceller (msc) har betydelige terapeutiske potentiale og tiltrække voksende interesse for det biomedicinske område. MSC'er er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM), så erhvervet fra væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB) og navlestrengen (UC). MSC'er er en heterogen celle population med kapacitet for (1) overholdelse af plast i standard dyrkningsbetingelser, (2) overflade markør udtryk for CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fænotyper, og (3) trilineage differentiering adipocytter, osteocytes og chondrocytter, som i øjeblikket er defineret af International Society for cellulære terapi (ISCT). Selvom BM er den mest udbredte kilde til MSC'er, begrænser den invasive art af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod har føtal MSCs fremstillet af UC fordele såsom kraftige spredning og differentiering kapacitet. Der er ingen etiske bekymring for UC prøveudtagning, som det er typisk betragtes som medicinsk affald. Menneskelige UC begynder at udvikle med fortsat vækst af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtighedsperioden og holder vokser indtil nå 50-60 cm i længden, og det kan isoleres i den hele nyfødte leveringsperiode. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, har vi brugt UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

Procedurer fra UC samling til MSC kultur er sammenfattet i figur 1. UC ca 5-10 cm i længden kan indsamles fra alle nyfødte leveret ved kejsersnit. UC begynder at udvikle på 4-8 uger af drægtighedsperioden og fortsætter med at vokse indtil 50-60 cm i længde, som vist i figur 2. Der er to arterier (A), en vene (V), ledning foring (CL) og Wharton's Jelly (WJ) i UC, som afbilledet i figur 3 og <str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolering og karakterisering af menneskelige navlestrengen-afledte mesenkymale stamceller fra præmature og fødte spædbørn

Menneskelige navlestrengen (UC) kan fås i den perinatale periode som følge af præmature, sigt og postterm levering. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-afledte mesenkymale stamceller (UC-MSCs) fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål i behandlingen af UCMSC, såsom den bedste kilde til USMSC til celleterapi. Den største fordel ved denne teknik er, at det muliggør konsekvent isolering og kraftig spredning af UCMSC fra præ-term og sigt spædbørn. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af uhåndterlige sygdomme.Selv om denne metode kan give indsigt i behandlingen af UCMSC, det kan også anvendes på andre MSC kilder, såsom fedtvæv, synovium, hud, dental pulp, og så videre. Generelt en individuel ny til denne metode vil kæmpe, fordi der er så mange variationer i trinene i navlestrengen dissektion og mesenkymal stamcelleisolering. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da disse trin er vanskelige at lære, fordi der er flere punkter tilbøjelige til at blive overset.For at begynde dissekere navlestrengen, først forberede en metal bakke, steriliseret saks, og scef, ti milliliter pipetter, 25 milliliter pipetter, og to 60 millimeter væv kultur retter. Varm OP PBS renset enzym blandinger, en 500 milliliter reduceret serum medium og kultur medium, til stuetemperatur. Fjern tidligere isolerede navlestreng fra en 50 milliliter rør i alpha MEM, og læg den i plastbakken.Vej navlestrengen, og derefter bruge steriliseret saks til at dissekere fem gram af ledningen. For at sterilisere navlestrengen, bruge ti milliliter pipette til at hælde ti milliliter 70 procent ethanol over det. Vask derefter ledningen to gange ved at tilsætte ti milliliter PBS med ti milliliter pipette.Den vaskede navlestreng skal sættes i den steriliserede 60 millimeter vævskulturskål og der tilsættes ti milliliter reduceret serummedium og 0,5 milliliter rensede enzymblandinger. Brug steriliseret saks og kraft anstrengelser til at skære ledningen i to til tre millimeter stykker. Placer fadet i en fem procent kuldioxid inkubator og inkubere ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Skær derefter de delvist fordøjede stykker i mindre stykker, og inkuber dem ved 37 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator, indtil homogenen bliver tyktflydende. Endelig skal du sørge for, at homogenatet let strømmer gennem en 25 milliliter pipette. Først forberede fire, 50 milliliter plastrør i en 500 milliliter flaske kultur medium.Brug en 25 milliliterpipette til at opdele navlestrengen homogenisere i to, 50 milliliter plastrør med ca. 7,5 milliliter i hvert rør. Derefter tilsættes 20 milliliter kulturmedium i hvert rør og bland godt. Hver homogener opsamler med 25 milliliterpipette, og der filtreres gennem en 100 mikrometercellestuder, der er placeret oven på et nyt 50 milliliteropsamlingsrør.Centrifuge to rør med filtrater ved 1000g i fem minutter ved stuetemperatur. Efter færdig centrifugering, omhyggeligt aspirere supernatant og kassér det. Tilføj fem milliliter kultur medium til hvert rør, og re-suspendere celle pellets.Overfør cellesuspensionen til en ny 60 millimeter plade og kultur ved 37 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator. At kultur UCMSC's, varme PBS, trypsin EDTA, og kultur medium, til stuetemperatur. Når cellerne er fastgjort til pladen, skal du fjerne mediet og vaske to gange med fem milliliter PBS for at fjerne snavs og røde blodlegemer.Tilsæt kultur medium og inkubere ved 37 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator. Udskift mediet to gange om ugen, og kultur cellerne, indtil de når 90 til 100 procent sammenløb. Derefter vaskes cellerne to gange med fem milliliter PBS, tilsæt 0,5 milliliter trypsin EDTA, og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem til ti minutter.Når celler bliver afrundet og løsrevet, tilsættes ni milliliter kulturmedium, og bland godt for at inaktivere trypsin. Tilsæt cellesuspensionen til en ny 100 millimeter plade. Dyrk cellerne ved 37 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator, indtil de når 90 til 100 procent sammenløb.Gentag trypsinisering og dividere i to nye plader, indtil den tiende passage. Overflademarkørudtryk af UCMSC'er blev brugt som kriterium for deres karakterisering. Når de blev inkuberet med passende antistoffer og analyseret af flowcytometri, blev de fundet positive for MSC's signaturmarkører, men negative for monocyt makrofag, negativ for hematapoietiske stamceller og ephithelial celle, negativ for B-celle, negativ for pan leukocytter og negativ for større histocompatibility komplekse markører.For at evaluere trilineage differentiering kapacitet USCMSC's fra præmature og sigt spædbørn, cellerne blev induceret til at differentiere i adipocytter, osteocytter, og chondrocytter. UCMSC's held differentieret i alle tre typer af mesodermale celler bekræfter deres differentiering kapacitet. Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske, at der er fire kritiske trin.Skæring ledningen i to til tre centimeter stykker, skære i mindre stykker, og sørg for, at homogenatet flyder let gennem en 25 milliliter pipette, og filtrering homogenate gennem en 100 mikrometer celle si.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolering af humane mesenchymale stamceller, og deres dyrkning på det porøse Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering og kvantitativ Immuncytokemisk karakterisering af primære myogene celler og fibroblaster fra human skeletmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolation og udvidelse af mesenchymstamceller / stromacellers afledt af humane Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiering af humane mesenkymale stamceller i funktionel Cardiomyocyte-lignende celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolation i Endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolering og karakterisering af Cardiac mesenchymale stromale celler fra Endomyocardial Bioptic prøver af Arrhythmogenic kardiomyopati patienter

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...