Name: isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי Grants-in-Aid עבור Scientific Research (C) (להעניק מספר: 25461644), מדענים צעירים (B) (להעניק מספרים: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) של JSPS KAKENHI.

השימוש האנושי דגימות במחקר זה היה אושרו על ידי הוועדה האתית של קובי לתואר שני בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת (אישור מס ' 1370 ו 1694), לפי ההנחיות שאושרו.
1. בידוד והתרבות של UC-MSCs
הערה: UC-MSCs היו מבודדים בהצלחה, תרבותי, ונחשפו המורחב (יותר מאשר מעבר מספר 4) של יות...

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues.">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells:+Revisiting+History,+Concepts,+and+Assays.">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li><li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Mesenchymal&amp;#34;+stem+cells.">34;Mesenchymal&amp;#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li><li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferative+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+umbilical+cord+and+bone+marrow.">Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.</a> Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).</li><li>Manochantr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+amnion,+placenta,+Wharton's+jelly+and+umbilical+cord.">Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.</a> Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).</li><li>Arutyunyan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+Cord+as+Prospective+Source+for+Mesenchymal+Stem+Cell-Based+Therapy.">Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy.</a> Stem Cells International. 6901286, (2016).</li><li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Wharton's+Jelly:+The+Rich,+but+Enigmatic,+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells.">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li><li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant.">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation.">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751 (2017).</li><li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord.">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li><li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate.">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method.">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li><li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods.">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li><li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells.">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow.">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li><li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults.">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li></ol>

MSCs ניתן לבודד מתוך מגוון של רקמות, הטרוגניות אוכלוסיית תאים שעושים אקספרס לא כל הסמנים פנוטיפי אותו. כאן, אנחנו המתוארים פרוטוקול מנחה דיסקציה של ה-UC ואוסף מתינוקות לידה מוקדמת והמונח ומאפשרת בידוד והתרבות של UC-MSCs. בעקבות פרוטוקול זה, יש בהצלחה בודדנו UC-MSCs העומדים של קריטריונים ISCT<sup class="xref"...

גזע mesenchymal (MSCs) במקור מבודדים, מאופיין של מח העצם (מוניטור)1,2 אבל ניתן להשיג ממגוון רחב של רקמות לרבות רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה תוספות עוברית 3. MSCs מזוהים אוכלוסיה הטרוגנית התא יכול להתרבות, להבדיל לתוך adipocytes, osteocytes ו- chondrocytes. בנוסף, MSCs להחזיק את היכולת להעביר אל אתרי הפציעה, לדכא, לווסת את תגובות מערכת החיסון, ו לשפץ ולתקן פציעה. כיום, MSCs ממקורות שונים משכו עניין הולך וגובר כמקור לטיפול תא נגד מספר מחלות עיקשות, לרבות שתל – מול – מארח מחלות, אוטם מוחי4,5 .
אמנם המקור הכי מאופיין היטב של MSCs מוניטור, invasiveness של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל עוברית תוספות כגון שליה, דם טבורי (UCB), ואת חבל הטבור (UC) יש יתרונות כולל פחות אתית חששות לגבי התפשטות מדגם וחזק ובידול קיבולת6 , 7. בין תוספות בעובר זה יימחקו בדרך כלל כאל פסולת רפואית, UCB, UC נחשבים איבר בעובר, בעוד השליה נחשב fetomaternal. בנוסף, השליה ו- UCB צריכים להיות שנדגמו, שנאספו ברגע המדויק של היילוד משלוח, ואילו השליה, UC ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד לאחר הלידה היילוד. בהתאם לכך, UC הוא מקור MSC מבטיח תא טיפול8,9.
UC האנושי מתחיל לפתח עם הרחבה הדרגתית של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של ההיריון, ממשיך לגדול עד 50-60 ס מ אורך, ניתן לבודד במהלך כל תקופת היילוד משלוח10. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, אנו משתמשים UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים הריונית בגילאים שונים11,12. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולאפיין UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1455px;" width="1455">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">50mL plastic tube</td>
			<td style="width:336px;">AS One Coporation, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Violamo 1-3500-22</td>
			<td style="width:312px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">12-well plate</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3815-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">60mm dish</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (100 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Alpha MEM</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">135-15175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Reduced serum medium</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td>
			<td style="width:379px;">OPTI-MEM Gibco 31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Gibco 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PBS</td>
			<td style="width:336px;">Takara BIO, Shiga,Japan</td>
			<td style="width:379px;">T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Purified enzyme blends</td>
			<td style="width:336px;">Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:379px;">Liberase DH Research Grade 05401054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347497</td>
			<td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">340364</td>
			<td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555822</td>
			<td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555483</td>
			<td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">550257</td>
			<td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555596</td>
			<td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">560839</td>
			<td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347367</td>
			<td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555749</td>
			<td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555574</td>
			<td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555743</td>
			<td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Viability dye</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">Fixable Viability Stain 450 562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:336px;">Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Block Ace UKB80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSAria&#160; III Cell Sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM software</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Adipogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Osteogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chondrogenic differentiation medium&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:336px;">Polyscience, Warrigton, PA</td>
			<td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Arizarin Red S</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Toluidine Blue</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">198161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Microscope</td>
			<td style="width:336px;">Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants

גזע mesenchymal (MSCs) יש הפוטנציאל הטיפולי ניכרת ולמשוך עניין גובר בתחום הביו-רפואי. MSCs הן במקור מבודדים מ מח עצם (מוניטור) ואז שנרכשה מן הרקמות כולל רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה של תוספות בעובר השיליה, כגון דם טבורי (UCB), ושל חבל הטבור (UC). MSCs הם אוכלוסיה הטרוגנית תא עם יכולת הדבקות (1) פלסטיק בתנאים סטנדרטיים תרבות, סמן (2) משטח הביטוי של CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– פנוטיפים /HLA-DR– –, בידול trilineage (3) לתוך adipocytes, osteocytes, chondrocytes, כיום שהוגדרו על-ידי האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולר (ISCT). אמנם המקור הנפוצה ביותר של MSCs מוניטור, העיקרון החודרני של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל UC יש יתרונות כגון התפשטות נמרצת וקיבולת בידול. אין שום חשש מוסרי UC דגימה, בדרך כלל נחשב פסולת רפואית. UC האנושי מתחיל לפתח עם המשך צמיחה של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של הריון, ממשיך לגדול עד שהגיע 50-60 ס מ אורך, וזה יכול להיות מבודדת במהלך תקופת משלוח כל יילוד. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, השתמשנו UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים בגילאים שונים הריונית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

ההליכים מאוסף UC לתרבות MSC מסוכמות באיור1. UC של 5-10 ס"מ אורך ניתן לאסוף מ לכל תינוק שנולד מועברים על ידי קיסרי. UC מתחיל להתפתח בגיל 4-8 שבועות של ההיריון, ממשיך לגדול עד 50-60 ס מ אורך, כמוצג באיור2. ישנם שני העורקים (א), אחד וריד (V), כבל רירית (CL) וג'לי (W...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

בידוד ואפיון של האדם נגזר הטבור בתאי גזע Mesenchymal של לידה מוקדמת ותינוקות המונח

חבל הטבור אנושי (UC) ניתן להשיג במהלך תקופת הלידה כתוצאה מונח לידה מוקדמת, ולאחר postterm משלוח. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-derived בתאי גזע mesenchymal (UC-MSCs) מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בדיון של UCMSC, כגון המקור הטוב ביותר של USMSC לטיפול בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד עקבי והתפשטות נמרצת של UCMSC מתינוקות טרום טווח ומונחים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון טיפול במחלות עקשניות.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך הדיון של UCMSC, זה יכול להיות מיושם גם על מקורות MSC אחרים, כגון רקמת שומן, סינוביום, עור, עיסת שיניים, וכן הלאה. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה כי יש כל כך הרבה וריאציה בשלבים של ניתוח טבור ובידוד תאי גזע mesenchymal. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלבים אלה קשה ללמוד כי יש כמה נקודות נוטה להתעלם.כדי להתחיל לנתח את חבל הטבור, הכינו תחילה מגש מתכת, מספריים מעוקרים ומדפים, עשרה פיפלטות מיליליטר, פיפלטות 25 מיליליטר ושתי מנות תרביית רקמה 60 מ"מ. מחממים תערובות אנזימים מטוהרות PBS, 500 מיליליטר של מדיום בינוני ותרבותי מופחת בסרום, לטמפרטורת החדר. הסר חבל טבור מבודד בעבר מצינור 50 מיליליטר ב- ALPHA MEM, והצב אותו במגש הפלסטיק.לשקול את חבל הטבור, ולאחר מכן להשתמש במספריים מעוקל לנתח חמישה גרם של חבל הטבור. כדי לעקר את חבל הטבור, השתמש פיפטי עשרה מיליליטר לשפוך עשרה מיליליטר של 70 אחוז אתנול על זה. לאחר מכן לשטוף את החוט פעמיים על ידי הוספת עשרה מיליליטר של PBS עם פיפיטר עשרה מיליליטר.מניחים את חבל הטבור שטוף בצלחת תרבית רקמת 60 מילימטר מעוקרת ומוסיפים עשרה מיליליטר מופחת סרום בינוני ו 0.5 מיליליטר תערובות אנזים מטוהרים. השתמש במספריים מעוקרים ומדפים כדי לחתוך את החוט לחתיכות של שניים עד שלושה מילימטרים. מניחים את המנה בממרח פחמן דו חמצני חמישה אחוזים וחממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן חותכים את החלקים המתעכלים חלקית לחתיכות קטנות יותר, ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5 אחוז פחמן דו חמצני עד הומוגני הופך צמיג. לבסוף, ודא כי הומוגנית זורם בקלות דרך פיפטה 25 מיליליטר. ראשית להכין ארבעה, 50 צינורות פלסטיק מיליליטר בבקבוק 500 מיליליטר של מדיום תרבות.השתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי לחלק את חוט הטבור homogenate לשתיים, 50 צינורות פלסטיק מיליליטר עם כ 7.5 מיליליטר בכל צינור. לאחר מכן מוסיפים 20 מיליליטר של מדיום תרבות לתוך כל צינור ומערבבים היטב. לאסוף כל הומוגנט עם פיפט 25 מיליליטר ולסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר להציב על גבי צינור אוסף חדש 50 מיליליטר.צנטריפוגה שני צינורות עם filtrates ב 1000g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה גמורה, בזהירות שאף את העל-טבעי והשליך אותו. מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום תרבות לכל צינור, ולהשעות מחדש את כדורי התא.העבר את ההשעיה התא לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה 5 אחוז פחמן דו חמצני. כדי לתרבת את UCMSC של, לחמם את PBS, טריפסין EDTA, ותרבות בינונית, לטמפרטורת החדר. כאשר תאים מחוברים לצלחת, להסיר את המדיום, ולשטוף פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS כדי להסיר פסולת ותאי דם אדומים.מוסיפים את מדיום התרבות ואת האינקובט ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של חמישה אחוזים פחמן דו חמצני. החלף את המדיום פעמיים בשבוע, ותרבת את התאים עד שהם מגיעים 90 עד 100 אחוז confluency. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS, להוסיף 0.5 מיליליטר של טריפסין EDTA, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד עשר דקות.כאשר התאים הופכים מעוגלים ומנותקים, מוסיפים תשעה מיליליטר של מדיום תרבותי, ומערבבים היטב כדי להשבית טריפסין. מוסיפים את מתלי התא לצלחת חדשה של 100 מ"מ. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5 אחוז פחמן דו חמצני אינקובטור עד שהם מגיעים 90 עד 100 אחוז confluency.חזור על טריפסיניזציה וחלוקה לשתי צלחות חדשות, עד הקטע העשירי. ביטוי סמן פני השטח של UCMSC's שימש כקריטריון לאפיון שלהם. כאשר הם דגירה עם נוגדנים מתאימים ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, הם נמצאו חיוביים עבור סמני החתימה של MSC, אבל שלילי עבור מקרופאג מונוציטים, שלילי עבור תא גזע hematapoietic ותא אפיתל, שלילי עבור תא B, שלילי עבור לויקוציטים פאן, ושלילי עבור סמנים מורכבים היסטו-תאימות העיקריים.כדי להעריך את יכולת ההבחנה של מיון של USCMSC מפגים ומונח תינוקות, התאים היו המושרים כדי להבדיל לתוך adipocytes, osteocytes, ו chondrocytes. UCMSC של הבדיל בהצלחה לכל שלושת הסוגים של תאים mesodermal המאשר את יכולת ההבחנה שלהם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ישנם ארבעה שלבים קריטיים.חותכים את החוט לחתיכות של שניים עד שלושה סנטימטרים, חותכים לחתיכות קטנות יותר, מוודאים שההומוגנטי זורם בקלות דרך פיפטה של 25 מיליליטר, ומסננים את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...