Name: isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Grants-in-Aid para Scientific Research (C) (número de concessão: 25461644) e jovens cientistas (B) (conceder números: 15 19614 K, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

O uso de amostras humanas para este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da Kobe University Graduate School of Medicine (SVGW 1370 e 1694) e conduzido de acordo com as diretrizes aprovadas.
1. isolamento e cultura de UC-MSCs
Nota: UC-MSCs foram isolados com sucesso, culta, e expandido (mais do que o número de passagem 4) de mais de 200 UCs sujeitos ao presente protocolo. Entre mais de 200 UCs, 100% mostraram bem sucedido isolamento UC-MSC, meno...

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	<li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues.">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li><li>Caplan, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells:+Revisiting+History,+Concepts,+and+Assays.">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li><li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Mesenchymal&amp;#34;+stem+cells.">34;Mesenchymal&amp;#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li><li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. 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E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Wharton's+Jelly:+The+Rich,+but+Enigmatic,+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells.">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li><li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant.">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).</li><li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation.">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751 (2017).</li><li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord.">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li><li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate.">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method.">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li><li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods.">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li><li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells.">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow.">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li><li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults.">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li></ol>

MSCs podem ser isoladas em uma variedade de tecidos e são uma população heterogênea de células que fazer express não todos os marcadores fenotípicos mesmos. Aqui, nós esboçamos um protocolo que orienta a coleta e a dissecação da UC de infantes prematuros e de termo e permite o isolamento e cultura de UC-MSCs. Na sequência deste protocolo, isolamos com êxito o UC-MSCs que cumprir os critérios ISCT19 de fetos/recém-nascidos entregues às 19-40 semanas de gestação e demonstrou que el...

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são originalmente isoladas e caracterizado da medula óssea (BM)1,2 , mas também pode ser obtidas de uma grande variedade de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais 3. MSCs são reconhecidos como uma população heterogênea de células que pode se proliferar e se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. Além disso, o MSCs possuem a capacidade de migrar para locais de ferimento, suprimir e modulam respostas imunes e remodelar e reparar a lesão. Atualmente, MSCs de diferentes fontes têm atraído interesse crescente como fonte de terapia celular contra uma série de doenças intratáveis, incluindo doença do enxerto - versus - hospedeiro, infarto do miocárdio e infarto cerebral4,5 .
Embora BM é a fonte mais bem caracterizada do MSCs, a invasão de aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtido a partir de apêndices fetais, tais como a placenta, o sangue do cordão umbilical (UCB), e do cordão umbilical (UC) têm vantagens, incluindo preocupações menos éticas de amostragem e robusta de proliferação e diferenciação de capacidade6 , 7. entre fetais apêndices que geralmente são descartadas como resíduos hospitalares, UCB e UC são considerados um órgão fetal, enquanto a placenta é considerado síndrome. Além disso, placenta e UCB precisam ser amostrados e recolhidos no momento da entrega do recém-nascido, Considerando que a placenta e UC podem ser coletadas e processadas após a entrega do recém-nascido. Nesse sentido, UC é uma fonte promissora de MSC para celular terapia8,9.
UC humana começa a desenvolver com a progressiva expansão da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação, continua a crescer até 50-60 cm de comprimento e pode ser isolado durante todo o prazo de entrega recém-nascido10. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional11,12. Neste protocolo, descrevemos como isolar e caracterizar UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1455px;" width="1455">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">50mL plastic tube</td>
			<td style="width:336px;">AS One Coporation, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Violamo 1-3500-22</td>
			<td style="width:312px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">12-well plate</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3815-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">60mm dish</td>
			<td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Iwaki 3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (100 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Falcon 35-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Alpha MEM</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">135-15175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Reduced serum medium</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td>
			<td style="width:379px;">OPTI-MEM Gibco 31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:336px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&#160;</td>
			<td style="width:379px;">Gibco 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:336px;">Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PBS</td>
			<td style="width:336px;">Takara BIO, Shiga,Japan</td>
			<td style="width:379px;">T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Purified enzyme blends</td>
			<td style="width:336px;">Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:379px;">Liberase DH Research Grade 05401054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347497</td>
			<td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">340364</td>
			<td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555822</td>
			<td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555483</td>
			<td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">550257</td>
			<td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555596</td>
			<td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">560839</td>
			<td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">347367</td>
			<td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555749</td>
			<td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555574</td>
			<td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">555743</td>
			<td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Viability dye</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:379px;">Fixable Viability Stain 450 562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:336px;">Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">Block Ace UKB80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSAria&#160; III Cell Sorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">FCM software</td>
			<td style="width:336px;">BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>BD FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Adipogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Osteogenic differentiation medium</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chondrogenic differentiation medium&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:336px;">Polyscience, Warrigton, PA</td>
			<td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Arizarin Red S</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Toluidine Blue</td>
			<td style="width:336px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:379px;">198161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:428px;">Microscope</td>
			<td style="width:336px;">Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td style="width:379px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from preterm and term infants

Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm considerável potencial terapêutico e atrair o interesse crescente no campo biomédico. MSCs são originalmente isolados caracteriza-se da medula óssea (BM), e adquiridos a partir de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais, tais como a placenta, sangue do cordão umbilical (UCB) e do cordão umbilical (UC). MSCs são uma população heterogênea de células com capacidade para (1) a adesão ao plástico em condições de cultura padrão, expressão do marcador (2) superfície de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenótipos de /HLA-DR– –e (3) trilineage diferenciação em adipócitos, condrócitos, como atualmente definidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) e osteócitos. Embora BM é a fonte mais amplamente utilizada de MSCs, a natureza invasiva da aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtidos a partir da UC tem vantagens tais como a capacidade de diferenciação e proliferação vigorosa. Não há nenhuma preocupação ética para amostragem de UC, como é normalmente considerado como lixo hospitalar. UC humana começa a desenvolver-se com o contínuo crescimento da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até atingir 50 a 60 cm de comprimento, e pode ser isolado durante o período de entrega todo recém-nascido. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização da UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Os procedimentos de coleta de UC à cultura MSC são resumidos na Figura 1. UC de aproximadamente 5 a 10 cm de comprimento pode ser coletada de todos os recém-nascidos entregados por cesárea. UC começa a desenvolver-se em 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até 50-60 cm de comprimento, como mostrado na Figura 2. Existem duas artérias (A), (V) de uma veia, forro de cabo (CL) e geleia de Wharton (WJ) em UC, conforme...

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Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na deliberação da UCMSC, como a melhor fonte de USMSC para terapia celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento consistente e a proliferação vigorosa da UCMSC a partir de bebês pré-termo e termo. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças intratáveis.Embora este método possa fornecer uma visão sobre a deliberação da UCMSC, ele também pode ser aplicado a outras fontes do MSC, como tecido adiposo, sinodio, pele, polpa dentária, e assim por diante. Geralmente, um novo indivíduo neste método lutará porque há tanta variação nas etapas de dissecção umbilical e isolamento de células-tronco mesenquimais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois esses passos são difíceis de aprender porque há vários pontos propensos a serem negligenciados.Para começar a dissecar o cordão umbilical, primeiro prepare uma bandeja de metal, tesoura esterilizada e fórceps, dez pipetas mililitros, pipetas de 25 mililitros e dois pratos de cultura tecidual de 60 milímetros. Aqueça misturas de enzimas purificadas pbs, um 500 mililitro de meio soro reduzido médio e cultura média, à temperatura ambiente. Remova o cordão umbilical previamente isolado de um tubo de 50 mililitros em alfa MEM e coloque-o na bandeja de plástico.Pese o cordão umbilical e use uma tesoura esterilizada para dissecar cinco gramas do cabo. Para esterilizar o cordão umbilical, use 10 mililitros de pipeta para despejar dez mililitros de 70% de etanol sobre ele. Em seguida, lave o cabo duas vezes adicionando dez mililitros de PBS com pipeta de dez mililitros.Coloque o cordão umbilical lavado no prato esterilizado de cultura tecidual de 60 milímetros e adicione dez mililitros reduzidos de soro médio e 0,5 mililitros purificados misturas de enzimas. Use tesouras esterilizadas e fórceps para cortar o cordão em pedaços de dois a três milímetros. Coloque o prato em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, corte os pedaços parcialmente digeridos em pedaços menores, e incuba-os a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% até que a homogeneidade se torne viscosa. Por fim, certifique-se de que o homogene de homogeneiza facilmente através de uma pipeta de 25 mililitros. Primeiro prepare quatro tubos de plástico de 50 mililitros em uma garrafa de 500 mililitros de cultura média.Use uma pipeta de 25 mililitros para dividir o cordão umbilical homogeneizar em dois tubos plásticos de 50 mililitros com aproximadamente 7,5 mililitros em cada tubo. Em seguida, adicione 20 mililitros de cultura em cada tubo e misture bem. Colete cada homogene de homogeneidade com pipeta de 25 mililitros e filtro através de um filtro de célula de 100 micrômetros colocado em cima de um novo tubo de coleta de 50 mililitros.Centrifugar dois tubos com filtrados a 1000g por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de terminar a centrifugação, aspire cuidadosamente o supernasce e descarte-o. Adicione cinco mililitros de cultura em cada tubo e suspenda as pelotas celulares.Transfira a suspensão celular para uma nova placa de 60 milímetros e cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Para cultivar os UCMSC's, aquecer o PBS, o EDTA de tripla e cultura média, à temperatura ambiente. Quando as células estiverem presas à placa, remova o meio e lave duas vezes com cinco mililitros de PBS para remover detritos e glóbulos vermelhos.Adicione o meio de cultura e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Substitua o meio duas vezes por semana, e cultue as células até atingirem 90 a 100% de confluência. Em seguida, lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS, adicione 0,5 mililitros de trippsina EDTA e incuba a 37 graus Celsius por cinco a dez minutos.Quando as células se tornarem arredondadas e separadas, adicione nove mililitros de cultura média, e misture bem para inativar trippsina. Adicione a suspensão da célula em uma nova placa de 100 milímetros. Cresça as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% até atingirem 90 a 100% de confluência.Repita a trippsinização e divida em duas novas placas, até a décima passagem. A expressão de marcador de superfície dos UCMSC's foi utilizada como critério para sua caracterização. Quando incubados com anticorpos apropriados e analisados por citometria de fluxo, foram encontrados positivos para marcadores de assinatura do MSC, mas negativos para macrófago monocito, negativo para célula-tronco hematapoiética e célula efitelial, negativo para célula B, negativo para leucócitos pan, e negativo para grandes marcadores complexos de histocompatibilidade.Para avaliar a capacidade de diferenciação trilineagem dos USCMSC's de bebês prematuros e termo, as células foram induzidas a se diferenciar em adipócitos, osteocitos e condrócitos. A UCMSC se diferenciou com sucesso em todos os três tipos de células mesodérmicas confirmando sua capacidade de diferenciação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que existem quatro passos críticos.Cortando o cabo em pedaços de dois a três centímetros, cortando em pedaços menores, certificando-se de que o homogeneato flui facilmente através de uma pipeta de 25 mililitros, e filtrando o homogeneizar através de um filtro celular de 100 micrômetros.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...