Name: implantation of hipsc-derived cardiac-muscle patches after myocardial injury in a guinea pig model
Uploaded: 2019-03-18T13:00:00
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Aucun financement n’a été reçu pour cette étude

Animaux a reçu tous les soins en conformité avec le Guide pour les principes des animaux de laboratoire, préparé par l’Institut des ressources animales de laboratoire et publié par le National Institutes of Health. Tous les protocoles d’animaux ont été approuvés par l’autorité locale responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Hamburg'' / Animal protocole # 109/16).
1. obtenir des animaux
<ol><li>Commercialement, obtenir des cochons d’Inde femelles ...

<ol>
	<li>Kirklin, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventh+INTERMACS+annual+report:+15,000+patients+and+counting.">Seventh INTERMACS annual report: 15,000 patients and counting.</a> The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 34, 1495-1504 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+studies+examining+mammalian+cardiomyocyte+DNA+synthesis.">Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis.</a> Circulation research. 83, 15-26 (1998).</li><li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).</li><li>Watanabe, T., Rautaharju, P. M., McDonald, T. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+survive+and+mature+in+the+mouse+heart+and+transiently+improve+function+after+myocardial+infarction.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction.</a> Stem cell research. 1, 9-24 (2007).</li><li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts.">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature medicine. 12, 452-458 (2006).</li><li>Johns, T. N., Olson, B. 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Il existe une variété de petits modèles animaux étudier l’effet que la transplantation de cellules exerce le cœur blessé9,10,11. Nous avons choisi un modèle de cobaye à cause de tous les petits animaux modèles sa (électro) physiologie ressemble plus étroitement à celui de l’homme. Les avantages des petits modèles animaux sont logement simple, coûts contrôlables et quelques groupes de travailleurs. En comparais...

Le nombre de patients atteints d’insuffisance cardiaque augmente dans notre population vieillissante. Pour l’insuffisance cardiaque terminale, orthotopic transplantation de coeur est l’option de traitement uniquement curatif. Cependant, en particulier dans les pays européens, il y a une pénurie de donneur d’organes croissante. Par conséquent, les autres traitements possibles sont nécessaires. Réalisations récentes en assistance circulatoire mécanique sont prometteurs, mais surtout à long terme exécutent, limitée par ses effets secondaires tels que saignements, thrombose de la pompe et des complications infectieuses1.
La capacité de régénération endogène du cœur humain adulte est extrêmement limitée. Par conséquent, des thérapies de régénération cardiaque pourraient devenir une option thérapeutique alternative pour terminale insuffisance cardiaque patients2,3. Différentes techniques y compris l’injection de cellules à base de cellules souches ou d’un tissu approches techniques ont été décrites3,4,5.
Les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC), ainsi que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent être efficacement différenciés à battant spontanément des cardiomyocytes humaine6, qui a été un succès majeur dans le domaine de la régénération cardiaque thérapies.
Pour remplacer le myocarde après un infarctus du myocarde et d’améliorer le fonctionnement d’un cœur défaillant, la survie d’un nombre adéquat de cardiomyocytes et leurs mécaniques et électriques de couplage avec le cœur natif est essentielle. Afin d’étudier le potentiel des thérapies régénératives cardiaques avec cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines, un modèle de recherche approprié est nécessaire. Le modèle idéal devrait être rentable et avoir un humain-comme la physiologie et l’électrophysiologie. Grands modèles animaux comme des cochons serait idéales de ce point de vue, toutefois, ces expériences sont très coûteux et grandes quantités de cardiomyocytes serait nécessaires pour remplacer un nombre pertinent de cardiomyocytes afin de pouvoir constater les effets sur la ventricule gauche fonction dans un modèle d’infarctus du myocarde de porc.
Pour répondre à des questions biologiques élémentaires vers la régénération cardiaque humaine axée sur la cellule, par exemple, la survie des cellules, vascularisation et couplage électrique, petits modèles animaux sont plus adaptées. De petits modèles animaux disponibles, le cobaye est l’espèce plus utiles, comparativement à des rats et des souris, car leur électrophysiologie ressemble plus étroitement à la situation dans les humains7. Dans ce modèle de cochon d’Inde, nous avons induit une cryoinjury transmurale du ventricule gauche. Une semaine après l’induction de l’implantation de l’infarctus du myocarde d’un three-dimensional, battant spontanément des hanches-cellulaire cardiomyocyte patch a été réalisée. La survie des cellules cardiomyocytes a été évaluée à 28 jours après l’implantation par l’examen histologique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Ventilator (VetFlo Dual Mode)</td>
			<td style="width:343px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Forene</td>
			<td style="width:343px;">abbvie</td>
			<td style="width:159px;">1000009819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Carprofen</td>
			<td style="width:343px;">Zoetis</td>
			<td style="width:159px;">256692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Atropin</td>
			<td style="width:343px;">Braun</td>
			<td style="width:159px;">PZN 00648037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Buprenorphin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Metal stamp</td>
			<td style="width:343px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Electric soldering iron</td>
			<td style="width:343px;">Claytools</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">3-0 prolene suture</td>
			<td style="width:343px;">Ethicon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">4-0 prolene suture</td>
			<td style="width:343px;">Ethicon</td>
			<td style="width:159px;">662SLH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">5-0 prolene suture</td>
			<td style="width:343px;">Ethicon</td>
			<td style="width:159px;">8710H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">8-0 prolene suture</td>
			<td style="width:343px;">Ethicon</td>
			<td style="width:159px;">8841H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten Carbide Scissor&#160;</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless sterilization Container</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 20890-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No.11652-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extra fine Graefe Forceps</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No.11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 11022-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halsted- Mosquito</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No.13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Baby Mixter</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)&#160;</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle Holder (Halsey)</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alm Retractor with Blumt Teeth</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 17008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissor</td>
			<td style="width:343px;">FST</td>
			<td>No. 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Compress 5x5</td>
			<td style="width:343px;">Fink + Walter</td>
			<td style="width:159px;">PZN 08821417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Venflon Pro Safety</td>
			<td style="width:343px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:159px;">PZN11123964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Cautery High Temp 2&#34;</td>
			<td style="width:343px;">Bovie Medical Corporation</td>
			<td style="width:159px;">0100607151011055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of hipsc-derived cardiac-muscle patches after myocardial injury in a guinea pig model

En raison de la capacité de régénération limitée du cœur chez les mammifères adultes, infarctus du myocarde se traduit par une perte irréversible des cardiomyocytes. Cette perte de montants correspondants du muscle cardiaque masse peut conduire à l’insuffisance cardiaque. En plus de la transplantation cardiaque, il n’y a aucune option de traitement curatif pour l’insuffisance cardiaque terminale. En période de pénurie de donneurs d’organes, les modalités de traitement indépendant d’orgue sont nécessaires. Dispositifs d’assistance ventriculaire gauche sont une option thérapeutique prometteuse, mais surtout comme thérapie de destination, limitée par ses effets secondaires comme les accidents vasculaires cérébraux, les infections et les hémorragies. Ces dernières années, plusieurs stratégies de réparation cardiaque, y compris l’injection de cellules souches, cellules souches cardiaques ou ingénierie tissulaire myocardique ont été étudiées. Les améliorations récentes en biologie cellulaire permettent la différenciation de grandes quantités de cardiomyocytes provenant des cellules souches humaines pluripotentes induites (iPSC). Une des stratégies de réparation cardiaque actuellement en cours d’évaluation est de transplanter des tissus cardiaques artificielles. Coeur ingénierie tissulaire (ISE) est un réseau tridimensionnel cardiomyocyte créé in vitro, ayant des propriétés fonctionnelles du tissu cardiaque native. Nous avons créé ISE-patches de cardiomyocytes dérivé de hiPSC. Nous présentons ici un protocole pour l’induction de la cryoinjury de myocardique ventriculaire gauche chez un cobaye, suivi par l’implantation de hiPSC dérivés ise sur la paroi ventriculaire gauche.

Ce modèle de cochon d’Inde est un modèle approprié pour étudier la régénération cardiaque après que implantation de hiPSC dérivé d’ISE-patches. Elle conduit façon reproductible à transmurale grandes lésions myocardiques. Taille de la cicatrice est évaluée par histologie quatre semaines après le cryoinjury. Coloration trichrome de Mason révèle transmurale grandes cicatrices (Figure 2). Taille de la cicatrice était similaire entre un grand nombre d’animaux blessés, ce...

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Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Nous présentons ici un protocole pour l’induction de cryoinjury ventriculaire gauche, suivie de l’implantation d’un patch du muscle cardiaque, dérivée de cellules iPS humaines cardiomyocytes dans un modèle de cobaye.

Implantation des dérivés hiPSC myocarde patchs après lésion myocardique dans un modèle de cochon d’Inde

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

L’objectif de la méthode est d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’implantation de tissus cardiaques artificiels dans un petit modèle de cryoinfarction animale. L’avantage de cette méthode est qu’elle permet l’induction d’infarctus myocardiques relativement reproductibles avec des tailles d’infarctus stables. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, placez le cobaye anesthésié sur une plate-forme de réchauffement de 40 à 42 degrés Celsius dans la position supine.Appliquer l’onguent des yeux et raser et dépeter le thorax. Appliquer 25 degrés Celsius gel transducteur ultrasons à la peau exposée et placer le transducteur à partir d’un système d’échocardiographie sur le thorax pour acquérir des vues parasternal bidimensionnelles à long axe en mode B à partir du cou droit vers la jambe gauche au plan de la valve aortique avec une visualisation simultanée de l’apex ventricule gauche pour étudier la fonction ventriculaire gauche préopératoire. Tournez ensuite le transducteur à 90 degrés pour obtenir une vue courte en mode B de l’axe au niveau papillaire moyen.Une fois la dernière image obtenue, transférez le cobaye à la table chirurgicale et collez les membres dans une position d’aigle écartée. Désinfectez la peau exposée avec deux gommages séquentiels à base d’iode et 80% d’éthanol et faites une incision verticale de 1,5 centimètre dans la zone trachéale. Disséquez brutalement les muscles qui recouvrent la trachée.Lorsque la trachée peut être observée, perforer le tube d’air avec une canule IV de calibre 18 et insérer la partie flexible de la canule comme tube trachéal. Connectez le tube trachéal à un respirateur animal pour une ventilation continue pendant la procédure et comptez les espaces de nervures à partir du premier espace intercostal pour localiser le cinquième espace intercostal. Faire une incision horizontale de deux centimètres sur le cinquième espace intercostal sur le côté gauche du cobaye et enlever les tissus sous-cutanés avant de disséquer les muscles avec une électrocauterie jusqu’à ce que les muscles intercostals soient atteints.Disséquez doucement les muscles intercostals avec des pinces à épiler et de petits ciseaux jusqu’à ce que l’espace pleural soit atteint et que le poumon gauche puisse être visualisé. Insérez un rétracteur entre les côtes et ouvrez soigneusement le rétracteur jusqu’à ce qu’une bonne vue du cœur soit obtenue. Ouvrez le péricarde d’environ un centimètre dans la région de la paroi ventriculaire gauche antérieure et placez une compresse sur le poumon gauche pour protéger le poumon contre les dommages lors de l’induisant le cryoinjury du ventricule gauche.Ensuite, refroidissez la pointe d’un timbre métallique érodé avec un diamètre trans-sectionnel de 0,5 centimètre d’azote liquide pendant trois minutes avant d’appuyer sur la sonde sur la paroi antérieure gauche du cœur pendant 30 secondes. Ensuite, placez un fer à souiller électrique de 200 degrés Celsius à l’intérieur du timbre pour réchauffer le timbre afin que le métal puisse être retiré du tissu. Après la troisième application de timbre, retirez le rétracteur de l’espace intercostal et serrez le tube de sortie du ventilateur pendant deux secondes pour gonfler les poumons avec une pression maximale pour éviter l’atelectasie du poumon.Ensuite, fermez les côtes avec deux sutures 4-0, les muscles sur les côtes avec une suture 5-0 en cours d’exécution et la peau avec 5-0 suture points simples. Après avoir enlevé le tube trachéal, utilisez un seul 8-0 suture pour fermer le site de perforation à la trachée et fermer la plaie avec trois sutures point unique 5-0. Sept jours après le cryoinjury, enlever les sutures et faire une incision horizontale de deux centimètres de la peau dans la zone de cicatrice du côté latéral gauche et utiliser l’électrocautery pour disséquer doucement les adhérences pleurales supplémentaires.Ouvrez soigneusement l’espace pleural avec des ciseaux et insérez un éper répartiteur de nervures pour exposer le cœur. Identifiez visuellement la région de l’infarctus par sa couleur pâle par rapport au myocarde environnant sain et placez un patch machiné de tissu cardiaque au-dessus de la région d’infarctus. Sécurisez le patch avec deux 8-0 sutures des deux côtés dans la zone non infarctus du cœur et gonfler les poumons avec une pression pour éviter l’atelectasie des poumons.Retirez ensuite le rétracteur de l’espace intercostal et fermez l’animal comme démontré. Quatre semaines après implantation machinée de tissu cardiaque, exécutez l’échocardiographie transthoracice comme démontré pour évaluer des changements dans la fonction gauche de ventricule heures supplémentaires. La coloration trichrome mason quatre semaines après cryoinjury révèle de grandes cicatrices transmurales plus de 25% du myocarde ventriculaire gauche en moyenne.La coloration de dystrophine démontre de grandes greffes myocardiques qui ont partiellement re-musclé à la cicatrice et la coloration pour ku80 humain qui confirme l’origine humaine du myocarde nouvellement formé. La surveillance transthoracique d’échocardiographie du tissu machiné implanté de coeur indique une amélioration de la fraction gauche d’éjection de ventricule, du raccourcissement fractionnel de secteur, et d’une diminution du diamètre ventriculaire et diastolique gauche. Il est essentiel d’ouvrir soigneusement la cavité pleurale dans ce genre de re-faire opération que les adhérences entre la paroi thoracique et le ventricule gauche peut être présent et il ya un certain risque de blesser le myocarde ventriculaire gauche.Après l’implantation du tissu cardiaque artificiel, plusieurs méthodes peuvent être employées pour surveiller des changements dans la fraction ventriculaire gauche d’éjection. Outre l’échocardiographie, une mesure invasive des boucles de volume de pression peut être utilisée pour surveiller ces changements. Cette méthode permet d’étudier tous les aspects de l’implantation de tissus d’ingénierie humaine.Les conséquences fonctionnelles ainsi que les risques potentiels comme les arythmies peuvent être évalués dans ce modèle petit animal.

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