Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

ف. أ. فاروقو هو تموله وكالة الحكومة الماليزية مجلس أمانة راكيات (مارا). شو لام متلقي لماري سكلودوفسكا كوري "زمالات فردية" (أفق 2020) (H2020-مسكاً-لو-2016). ك. ت. جمال تعترف بتمويل من مؤسسة ويلكوم ترست (WT103913) وبسرك (BB/J008656/1). المؤلفون أيضا يود أن يشكر الدكتور بول خزامي والدكتور ديفيد الخوف (قسم طب الجهاز التنفسي والحساسية، كوليدج لندن كينغز) توفير اليكتروبوراتور.

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

الحصول على عائد اكسوسومي لائق من الخلايا المزروعة، التي تكفي لعدة جولات من الدراسات في المختبر أو في الجسم الحي ، لا يزال يمثل تحديا. ووفقا للشركة المصنعة، ترمي قوارير مفاعل حيوي لإنتاج الأجسام المضادة، والبروتينات مع عالية الغلة من الثقافة من مختلف خطوط الخلايا مخلدة. وهذا يسمح للخلايا باستمرار إثراء الثقافة المتوسطة مع المنتج المطلوب، أسفر عن وسيلة مكيفة مركزة (سم) في الخلية-المقصورة. نظرياً، سيكون مفيداً في إنتاج اكسوسومي من خطوط الخلايا المختلفة نفس المفهوم، وتجلى الواقع استزراع هذه الخلايا في قوارير مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي40. إمدادات المواد المغذية للخزان المتوسطة الكبيرة باستمرار، وإزالة النفايات من حجرة الخلية من خلال غشاء شبه منفذ 10 كاتشين، السماح للثقافة فترات طويلة دون الحاجة إلى كمية كبيرة من المتوسط لتكون على اتصال بالخلايا، أو العادية قوارير المتغيرة، التي يمكن في نهاية المطاف إنقاذ التكلفة الإجمالية والعمل اكسوسومي عالية-حجم الإنتاج40. كما اتضح أن مورفولوجية والنمط الظاهري، فضلا عن وظائف إيمونومودولاتوري اكسوسوميس عزل الخلايا الثقافات قوارير مفاعل حيوي طويل الأجل مماثلة للتي مصدرها الخلايا المستزرعة في العادية 75 سم2 قوارير40. ولذلك سيساعد ثقافة أخرى خطوط خلية مخلدة كمصادر اكسوسومي في قارورة مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي بهم مع الحفاظ على سلامتهن والدالة. لا هذا النموذج من الثقافة ولكن لا ينطبق على الخلايا الأولية مع دورات شعبة محدودة، وتلك التي لا يمكن مثقف في كثافة عالية.
حيث يتم الحصاد سم أسبوعيا، وكانت ابدأ باساجيد الخلايا في الثقافة، يمكن الافتراض بأن الخلايا في قارورة مفاعل حيوي لا تنمو في أحادي الطبقة مثل ثقافة الخلية العادية. هم الأكثر احتمالاً تشكيل مجموعات مع مراكز نخرية، أو ببساطة فصل من السطح وتموت عند المتلاقية جداً لأحادي الطبقة الخلايا. الفحص البصري لحجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي لا يمكن تأكيد هذا الافتراض، ولكن ينعكس من خلال عدد كبير من الخلايا الميتة التي تم الحصول عليها أثناء الحصاد سم. إزالة منتظمة من الخلايا ملتصقة ضعيف وغير قادر على الاستمرار في قارورة مفاعل حيوي يمكن منع تراكم المواد المتعلقة شبه نفاذية الأغشية التي يمكن أن تؤثر سلبا على تبادل الغاز والمواد الغذائية والنفايات بين حجرة الخلية والمتوسطة الخزان، مما يسمح للثقافة المطولة في قوارير مفاعل حيوي > 6 أشهر40. وفي هذا السياق، هذا عدم انتظام نمو الخلايا في قوارير مفاعل حيوي مثالي كما يمكننا التكهن بأنه يقلد الحالة الفعلية للورم النمو في فيفو أوثق من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية، ومن المأمول أن اكسوسوميس ينتج سرطان خلايا في قارورة مفاعل حيوي سيكون أكثر مماثلة للتي تفرزها الأورام في فيفو. وهذا سيكون مفيداً بصورة خاصة في دراسات تبحث في دور اكسوسوميس المستمدة من ورم في تطور علم الأمراض السرطانية. اكسوسوميس المستمدة من الورم قد أبلغت إلى المنزل ارتباطاً وثيقا، وترتبط بشكل تفضيلي إلى تلك الأنسجة من أصل32، وذلك بعد اكسوسوميس المنتجة في نظام محاكاة بهم في فيفو الإنتاج المرغوب فيه أيضا في دراسات تبحث في استكشاف قدرة الاستهداف السلبي اكسوسوميس نانوكاريرس المخدرات.
وذكر نسبة P:P كمعلمة لتقييم نقاء اكسوسوميس المعزولة من تلويث البروتينات من المتوسط الثقافة من السوائل الفسيولوجية التي كان مصدرها اكسوسوميس41. نسبة P:P ± 1.7 × 10 8.310 ف/ميكروغرام تم الحصول عليها في هذه الدراسة يقع ضمن النطاق عالية النقاء المقترحة في الدراسة. ويبرز هذا النسبة خطر استخدام تركيز البروتين للتعبير عن العائد أو جرعة من اكسوسوميس معزولة أو المستخدمة في الدراسات النهائية على التوالي، كما لا يعكس هذا المبلغ الحقيقي من اكسوسوميس المتوفرة في العينة نظراً لمشكلة البروتين التلوث أثناء العزلة. الإدارة الوطنية للسياحة عن طريق الصكوك مثل نانوسايت، الذي يقيس تركيز اكسوسوميس من حيث عدد الجسيمات، طريقة أكثر منطقية وأكثر دقة لقياس اكسوسوميس.
موازنة دقيقة للغاية أثناء إعداد محلول 25% في أكسيد الديوتريوم أمر حاسم بهذا الأسلوب عزلة على أساس كثافة. وقد اكسوسوميس مجموعة ضيقة من كثافة التعويم في محلول السكروز حتى إعداد دقيقة لوسادة السكروز سيتم الحد من تلوث من حويصلات غير اكسوسومال مثل الهيئات apoptotic أو حويصلات غولجي-مشتقة خلال عزل42. ينصح لا للحفاظ على بقايا محلول واستخدامه حتى بعد يوم واحد تجنبا لمخاطر عوامل التي يمكن أن تغير كثافته مثل فقدان أو إضافة المياه في الحل بالتبخر أو التكثيف في الهواء في الأنبوب. استخدام دوار البديل التدريجي ضروري أيضا أثناء الطرد المركزي على وسادة السكروز للسماح بالهجرة حتى من اكسوسوميس من مجلس الوزراء حل السكروز.
سحب الطرد المركزي بعد حل السكروز أيضا خطوة حساسة، وأنها تنطوي على إيجاد حل وسط بين تعظيم مقدار اكسوسوميس المستردة، وليس كثيرا أن البروتين من الثقافة المتوسطة عرض لسحب العينة اكسوسومي . هي الواجهة بين محلول السكروز والمتوسطة شرط فيها البروتينات من المتوسط الثقافة بجمع بعد الطرد المركزي، وعادة ما يمكن اعتباره حلقة بني داكن أن يجلس على الواجهة. في أيدينا، هو سحب 2 مل وسادة السكروز من الأولى 3 مل إضافة وحدة التخزين الأمثل الذي يتفق مع الحل التوفيقي المشار إليها أعلاه. الكميات المبينة في هذا البروتوكول للدوارات المحددة المستخدمة؛ ولذلك، فإنه ينصح لتحسين حجم السكروز سحب عند القياس أعلى أو أسفل وحدات التخزين لأنواع الدوارات المتاحة في مرافق مختلفة. من المهم أيضا تجنب حق المنطقة في وسط أسفل الأنبوبة عند سحب السكروز، هذا هو حيث سيتم الجسيمات من أعلى كثافة من السكروز الرواسب ويمكن عادة اعتبار بيليه البيض.
خطوة الغسيل بكمية كبيرة نسبيا من برنامج تلفزيوني يساعد على الحد من زيادة درجة التلوث البروتين خلال العزلة اكسوسومي41. هذه الخطوة ضروري أيضا في إزالة الزائدة السكروز من اكسوسوميس لتفادي الضرر ناضح اكسوسوميس أنفسهم أو الجزيئات الحيوية داخل التجويف اكسوسومال، فضلا عن الحد من خطر النمو البكتيرية أو الفطرية في الأسهم اكسوسومي. إعداد محلول السكروز في أكسيد الديوتريوم بدلاً من الماء يساعد على تقليل كمية السكروز اللازمة لتحقيق كثافة تعويم اكسوسومي للعزلة، ومن ثم تقليل خطر الضرر ناضح والتلوث الميكروبي. بعد الطرد المركزي الأول على وسادة السكروز، المحتوية على اكسوسومي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية طبقة السكروز سحب وإضافة إلى برنامج تلفزيوني ومعالجتها في اليوم التالي إذا واجهت مع ضيق الوقت.
على حد علمنا، نسبة المولى اكسوسومي/siRNA عاملاً هاما في تحديد كفاءة انهانسر. في هذا البروتوكول، استخدمنا 1:60 اكسوسومي إلى نسبة siRNA المولى. كما قدرة التغليف لأنواع مختلفة من اكسوسوميس مختلفة، ونحن نقترح بقوة هذا الأمثل على أساس حالة بحالة. ومع ذلك، يمكن كفاءة التغليف المقترح هنا دائماً معلمة لتحديد شروط انهانسر الأمثل.
وباﻹضافة إلى ذلك، تجميع siRNA يعتقد أن واحدة من المشاكل الأكثر شيوعاً في انهانسر. وقد ثبت أن انهانسر يمكن الحث على تجميع قوي من siRNA، مما يجعل من الصعب حتى إدخال اكسوسوميس. كثير من الأحيان عن طريق الخطأ تفسير المجموعات siRNA كما تغليف siRNA إلى اكسوسومي الضوابط المناسبة لذلك استخدمت في هذه الدراسة كتشكيل المجاميع siRNA أمر لا مفر منه خلال انهانسر28. وحسبت نسبة كفاءة التغليف لدينا طريقة تنقية باستخدام قيم طبيعية للتقليل من التأثير من مصادر أخرى مثل تجمعات الضوضاء واكسوسومي و siRNA الخلفية التي سوف يؤثر على موثوقية البيانات. استناداً إلى النتائج التي توصلنا إليها، كان هناك تجميعات siRNA لا يعتد بها مراعاة مراقبة العينة أي استخدام siRNA اليكتروبوراتيد والأمم المتحدة--اليكتروبوراتيد.
هذا البروتوكول قد أثبت نجاح تغليف siRNA إلى اكسوسوميس وإيصالها داخل الخلايا اللاحقة siRNA لسرطان الخلايا في المختبر. ولذلك، يمكن أن تكون أنواع مختلفة من اكسوسوميس من خطوط الخلايا المختلفة معزولة وتتميز باستخدام البروتوكول المقترح، وبعد ذلك محملة siRNA علاجية مختلفة لأنواع مختلفة من الأهداف النمطان أعرب عن الإفراط في أنواع مختلفة من السرطان. سيكون تطبيق مثيرة لاهتمام لاستكشاف siRNA التسليم والإقبال على كفاءة استخدام التباديل المختلفة من اكسوسومي مصدر-هدف خلية الزوج في المختبر. ويمكن أن يترجم هذا ثم إلى نماذج حيوانية لتقييم كفاءة عملية التسليم والفعالية العلاجية لتغليف siRNA اكسوسوميس المجراة في.

اكسوسوميس نوع فرعي حويصلات خارج الخلية (EV) تتراوح بين 50-200 نانومتر في القطر، ويفرز بواسطة مختلف أنواع الخلايا مثل الخلايا المناعية1،2، خلايا السرطان3،،من45، 6 والخلايا الجذعية7. وقد أظهرت أيضا اكسوسوميس أن يكون حاضرا في مختلف السوائل الفيزيولوجية8،،،من910،11. أن الجمع بين القدرة الكامنة من اكسوسوميس على تحمل مختلف الجزيئات الحيوية (مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات)12،،من1314 والإنجاز الفعال لهذه الجزيئات الحيوية في الخلايا المتلقية 15 , 16 , 17 اجتذب اهتماما لامكاناتهم كمقياس نانو المخدرات تسليم ناقلات. مختلف الجزيئات الصغيرة التي تخدم كما قد أثبتت تحميلها بنجاح إلى اكسوسوميس العقاقير المضادة للسرطان والالتهابات وتسليمها إلى هدف خلايا18،،من1920، 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27-من المثير للاهتمام، الأحماض النووية مثل siRNA،من2829 وميكرورنا30 أيضا تم تحميلها بنجاح في اكسوسوميس عن طريق انهانسر وتسليمها إلى الخلايا المستهدفة.
في الآونة الأخيرة، اكتسب الجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني]) عن طريق رنا التدخل الصغيرة (siRNA) مزيدا من الاهتمام كآلية المفضل في إسكات الجينات نظراً لخصوصية عالية وتأثير قوي، والحد الأدنى من الآثار الجانبية وسهولة siRNA توليف28، 29. سيرناس جزيئات الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل تتراوح ما بين 19 إلى 25 النيوكليوتيدات في طول هذه المشغلات الخاصة بتسلسل الحفاز مرناً ضربة قاضية. نظراً للوزن الجزيئي كبير وطبيعة بوليانيونيك، هو السلبي الإقبال siRNA عارية في خلايا أعاقت28،29. كما أنها لا يمكن siRNA عاريا بالحقن إلى الدوران الجهازي بسبب التدهور السريع بالبلازما نوكليسيس31. وهكذا، سيساعد تغليف siRNA في nanocarrier الإنجاز الفعال والإقبال على siRNA في الخلايا الهدف.
اكسوسوميس نظام مثالي لتغليف siRNA هيكلها يتكون من نواة جوفاء، مائي يلفها ببلير فسفوليبيد. اكسوسوميس استقرار جيدة في الدم بل لها أيضا خصائص استهداف الطبيعية لتسليم الوظيفية الحمض النووي الريبي في الخلايا32. أظهرت الدراسة التي أجرتها ألفاريز-ارفيتي وآخرون بنجاح إيصال siRNA لأدمغة الفئران باستخدام إجراء هندسة عكسية اكسوسوميس مع تقريبا لا مضاعفات31. هو الافتراض بأن العلاج القائم على اكسوسومي نسبيا أكثر أماناً من العلاجات الأخرى كما لا النسخ المتماثل اكسوسوميس اندوجينوسلي كما أن الخلايا وذلك لا يحمل خصائص المنتشر15.
أبلغ عن أساليب مختلفة لعزل اكسوسوميس من زراعة الخلايا أو السوائل الفيزيولوجية بنجاح. يستخدم الأسلوب الأكثر شعبية تنبيذ فائق لبيليه اكسوسوميس من انطلاق المواد31،32،33. هذا الأسلوب يمكن أن تكون قاسية جداً على اكسوسوميس والبروتينات رواسب المشارك من العينة عادة. الجمع بين تنبيذ فائق مع فصل القائم على كثافة مثل التدرجات السكروز أصبحت أكثر شيوعاً، للحد من تلوث البروتين وغير اكسوسومال في19،اكسوسوميس معزولة34. حجم الاستبعاد اللوني (SEC) تسمح بفصل اكسوسوميس عن أنواع أخرى من حويصلات خارج الخلية (EV) بحجم ويمكن أن يؤدي أيضا إلى تلوث الحد الأدنى من البروتين غير محدودة بمقدار صغير من ابتداء من المواد فإنه يمكن معالجة35، 36. يستخدم إيمونوافينيتي التقاط الخرز المغلفة بالأجسام المضادة التي تربط بالبروتينات السطحية اكسوسومال مثل تيتراسبانينس أو علامة الخلية المحددة الأخرى التي تتيح التقاط محددة من اكسوسوميس بدلاً من المركبات الكهربائية أو غيرها من البروتينات، فضلا عن عزل السكان الفرعية اكسوسوميس من كل العينات، ولكن مرة أخرى محدودة بمقدار ابتداء من المواد و تكلفة36،37. هطول الأمطار على أساس البوليمر من اكسوسوميس اعتادت أن تكون شعبية جداً، ولكن نظراً هطول الأمطار بدلاً من النفط خام، فإنه يؤدي إلى أعلى غير اكسوسومال حويصلة والبروتين تلوث38،39.
أبلغ انهانسر لعدم الكفاءة، كأسلوب لتحميل اكسوسوميس مع siRNA بسبب بروتين التجميع15،،من2831. النهج القائم على تعداء أظهرت أن يكون تحميل أفضل كفاءة واستقرار البروتين، ولكن غير مرغوب فيه بسبب سميتها والآثار الجانبية لوكلاء تعداء في تغيير الجينات الخلوية التعبير28. وهكذا، انهانسر قد استخدمت على نطاق واسع في تحميل siRNA في اكسوسوميس، وطريقة أكثر أماناً. ومع ذلك، طريقة تغليف أمثل يلزم إنشاء بغية تسليم كميات كافية من siRNA إلى الموقع المستهدف لضربة قاضية جينات قوية.
هنا، فإننا نقترح بروتوكولا عزلة اكسوسومي استخدام المستندة إلى كثافة تنبيذ فائق على مجرد واحد 25% (w/w) سكروز وسادة أعدت في أكسيد الديوتريوم، بدلاً من أن تدرج كثافة سكروز. هذا هو أسلوب فعال من حيث التكلفة التي تلتف إعداد التدرج كثافة شاقة ويتيح تجهيز كميات كبيرة من ابتداء من المواد، ولكن النتائج في اكسوسوميس سليمة عالية الغلة ونقاء مناسبة لتحميل اللاحقة مع siRNA. تم تحميله إلى اكسوسوميس "الكلي الجنينية البشرية" خلايا (خلايا HEK-293) المتأتية عن طريق انهانسر siRNA غير محددة مترافق Atto655 نيون وتسليمها إلى الخلايا السرطانية البشرية غدية البنكرياس (PANC-1) في المختبر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

حويصلات خارج الخلية، في اكسوسوميس معينة، قد اكتسبت في الآونة الأخيرة الاهتمام كالمخدرات رواية ناقلات التسليم نظراً لأصل بيولوجي، ووفرة، والقدرة الذاتية في التسليم بين الخلايا من الجزيئات الحيوية المختلفة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا عزل لتحقيق المردود العالي ودرجة نقاء عالية من اكسوسوميس لإيصال siRNA. تستزرع خلايا "الكلي الجنينية" البشرية (الخلايا HEK-293) في قوارير مفاعل حيوي وحصاد الثقافة طافية (الممتلكات المشار إليها كوسيلة مشروطة) على أساس أسبوعي للسماح لإثراء اكسوسوميس HEK-293. قبل إلغاء تحديد الخلايا الميتة والحطام الخلوية بالطرد المركزي التفاضلي المتوسطة مكيفة (سم) وهي تتعرض تنبيذ فائق على وسادة سكروز تليها خطوة غسيل، جمع في اكسوسوميس. تتميز اكسوسوميس HEK-293 معزولة للتعبير علامة الغلة ومورفولوجيا واكسوسومال نانوحبيبات تتبع التحليل الكمي البروتين والمجهر الإلكتروني والتدفق الخلوي، على التوالي. تم تحميله صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، المسمى فلوريسسينتلي مع Atto655، في اكسوسوميس انهانسر ويتم إزالة siRNA الزائدة عن طريق الترشيح هلام. ويؤكد الإقبال الخلية في الخلايا السرطانية PANC-1، بعد 24 ساعة في الحضانة عند 37 درجة مئوية، التدفق الخلوي. اكسوسوميس HEK-293 من 107.0 شمال البحر الأبيض المتوسط ± 8.2 في القطر. اكسوسومي الغلة والجسيمات للبروتين نسبة نسبة (P:P) هي 6.99 ± 0.22 × 1012 الجسيمات مليلتر والجسيمات10 ± 8.3 1.7 × 10/ميكروغرام، على التوالي. يتم تغليف كفاءة siRNA في اكسوسوميس ~ 10-20%. أربعين بالمائة الخلايا إظهار إشارات إيجابية ل Atto655 في 24 ساعة بعد انتهاء الحضانة. وفي الختام، عزل اكسوسومي بواسطة تنبيذ فائق على وسادة السكروز يوفر مزيجاً من محصول جيد والنقاء. يمكن تحميلها بنجاح في اكسوسوميس التي انهانسر siRNA وتسليمها في وقت لاحق إلى الخلايا السرطانية في المختبر. ويوفر هذا البروتوكول إجراءات موحدة لتطوير اكسوسوميس محملة siRNA للتسليم الفعال للخلايا السرطانية.

ويرد في الجدول 1توصيف الفيزيائية اكسوسوميس المعزولة من الخلايا HEK-293 (Exo HEK-293). وكان حجم تقاس باستخدام نانوحبيبات تتبع أداة التحليل (NTA) 107.0 ± 8.2 نانومتر. اكسوسومي العائد من الخلايا HEK-293، وتحليلها أيضا باستخدام أداة الإدارة الوطنية للسياحة، التي كانت 6.99 ± 0.22 × 1012 ف مليلتر من مل ~ 24 سم (التي تم الحصول عليها من جولتين من الحصاد). وكان نقاء "أكسو" HEK-293 بحساب نسبة الجسيمات للبروتين (P:P) تقييم 8.3 ± 1.7 × 1010 ف/ميكروغرام.
توزيع حجم معزولة HEK-293 "أكسو" يرد في الشكل 3 ألف. وأظهر التحليل المورفولوجي باستخدام مجهر إلكتروني (TEM) Exo HEK-293 كانت هياكل كروية قليلاً فوق 100 نانومتر في الحجم (الشكل 3B). هذه النتيجة تتفق مع ذلك من قياس جاتا (الشكل 3A). Exo HEK-293 معزولة كانت إيجابية بالنسبة CD81 و CD9 و CD63، وعلامات متعارف عليه يستخدم لتعريف حويصلات اكسوسوميس (الشكل 3).
لتنقية اكسوسوميس استخدام حجم الاستبعاد اللوني (الشكل 4)، استرداد النسبة المئوية اكسوسوميس تم حسابها بقسمة عدد الجسيمات اكسوسومي مجموع المستردة في 10 الكسور جمعها (F0-F9) مع اكسوسومي الأولى عدد الجسيمات المستخدمة، بينما نسبة استرداد siRNA تم حسابها بقسمة كثافة مجموع الأسفار التي تم الحصول عليها من F3 و F4 و F5 مع كثافة مجموع الأسفار التي تم الحصول عليها من جميع الكسور 10 التي تم جمعها. استعادة اكسوسومي و siRNA بعد تنقية حسبت ك 75.0% و 80.4 في المائة، على التوالي. وكان كفاءة تغليف siRNA في اكسوسوميس ~ 10-20%، محسوبة باستخدام siRNA القياسية المنحنى المنشأ (الشكل 4).
وأظهر تحليل نوعي للإقبال في المختبر على اكسوسوميس محملة بنيون Atto655-siRNA بالتدفق الخلوي أن PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس تسجيل التحول الأكبر في إشارة الفلورية (الشكل 5A) . PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس تسجيل نسبة أعلى من السكان إيجابية بالنسبة Atto655 إشارة (39.4 في المائة) مقارنة بأن تعامل مع تفريغ اكسوسوميس و siRNA خليط (0.56%)، مما يؤكد الملاحظة أعلاه ( الشكل 5B). درجة امتصاص الخلوية من siRNA (معبراً عنها كحظيرة الفرق في قيم الكثافة (MFI) الأسفار يعني من أن الخلايا غير المعالجة) ولوحظ أيضا أن يكون أعلى بكثير في PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس (مؤسسة مونتانيار حظيرة الفرق = 5.1) مقارنة بأن تعامل مع خليط اكسوسومي-siRNA (مؤسسة مونتانيار إضعاف الفرق = 1.1) (الشكل 5). أظهرت هذه الملاحظات أن كانت مستوعبة اكسوسوميس siRNA مغلفة بالخلايا PANC-1 وأن سلموا فعلياً في siRNA إينتراسيلولارلي.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> الشكل 3: الكيمياء الحيوية وتحليل مورفولوجيا اكسوسوميس HEK-293- (أ) حجم توزيع اكسوسوميس HEK-293 باستخدام تحليل تتبع نانوحبيبات (NTA). المنحنى يبين الرسم بياني فرضه من 3 مختلفة يلتقط في 30 ثانية الفاصل مع المناطق الحمراء تدل على الانحراف المعياري بين القياسات (n = 3). (ب) انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) صور السذاجة اكسوسوميس HEK-293. شريط الحجم: 100 نانومتر. (ج) الكشف عن علامات اكسوسومال CD81 و CD9 و CD63 باستخدام التدفق الخلوي في اكسوسوميس HEK-293. اكسوسوميس اقترنت إلى ألدهيد/سلفات الخرز مطاط قبل الكشف. في وقت لاحق تم الملون مجمع اكسوسومي-الخرز مع الأجسام المضادة CD81 و CD9 المضادة ومكافحة CD63 fluorophore مترافق. يتم التعبير عن درجة من تعبير العلامات كحظيرة الفرق في الأسفار متوسط قيم الكثافة (MFI) من أن عنصر التحكم (مجمع اكسوسومي-الخرز الملون مع ايستب المقابلة). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> الشكل 4: اكسوسومي تنقية بوست-انهانسر. (أ) شطف التشكيلات الجانبية (F0-F9) من اكسوسوميس Atto655-siRNA واليكتروبوراتيد باستخدام حجم الاستبعاد تشورماتوجرافي. (ب) الإدارة الوطنية للسياحة التحليل Atto655-siRNA واكسوسومي من F0 إلى F9 استخدام حجم الاستبعاد تشورماتوجرافي. (ج) المعايرة منحنى Atto655 المسمى siRNA. تم الحصول على كثافة الأسفار بقارئ لوحة في ت/م: 640-10/680 نانومتر؛ اكتساب 2800. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> الرقم 5: استيعاب الخلوية لتغليف siRNA اكسوسوميس في خلايا PANC-1 في 4 ﻫ. (أ) رسوم بيانية تقارن امتصاص الخلوية لتفريغ اكسوسوميس + خليط siRNA وتغليف siRNA اكسوسوميس. (ب) مقارنة الإقبال على تفريغ اكسوسوميس + خليط siRNA في ح 4 بالأرض بسيودوكولور. (ج) إضعاف الفرق يعني في الأسفار (مؤسسة مونتانيار) قيم الكثافة للعينات التي تم اختبارها مقارنة بالخلايا غير المعالجة. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3. ف < 0.001. NS: ليس كبيرا. تم استخدام ANOVA في اتجاه واحد للتحليل الإحصائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>اكسوسومي</td>
			<td>حجم1، 2 (نيو مكسيكو)</td>
			<td>العائد1,2,3 (p/mL)</td>
			<td>[بروتين] 2، 4 (ميكروغرام/مل)</td>
			<td>الجسيمات للبروتين (P:P) نسبة5 (p/ميكروغرام)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-293</td>
			<td>107.0 ± 8.2</td>
			<td>± 6.99 0.22 × 1012
</td>
			<td>84.3 ± 9.8</td>
			<td>8.3 ± 1.7 × 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
Measured 1 استخدام نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA الصك) 2 يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3 3 تم الحصول على عائد بالمتوسطة مكيفة الخلايا المجمعة من جولتين من الحصاد من قوارير مفاعل حيوي (~ 24 مل) ميسوريد 4 باستخدام مجموعة أدوات مقايسة البروتين 5 القيمة التي تم الحصول عليها باستخدام الصيغة: نسبة P:P = العائد/[بروتين]</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: توصيف الفيزيائية من اكسوسوميس.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"

اكسوسومي جيل جديد من حاملات تسليم المخدرات. وأنشأنا بروتوكولا عزلة اكسوسومي مع عالية الغلة والنقاء لتسليم siRNA. ونحن أيضا مغلفة المسمى فلوريسسينتلي غير محددة siRNA في اكسوسوميس والتحقيق استيعاب الخلوية لتحميل siRNA اكسوسوميس في الخلايا السرطانية.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

حصاد exosome المخصب المتوسطة مكيفة من الخلايا المستزرعة في قارورة حيوية والعزلة من قبل sucrose وسادة فائقة التركيز يؤدي إلى إعداد الإزداد من ارتفاع الغلة مع الحد الأدنى من البروتينات الملوثة أو الحويصلات غير exosomal. باستخدام وسادة السكروز واحدة أعدت في أكسيد الديوتريوم يتحايل على إعداد شاقة من التدرج السكروز متقطع ويقلل من كمية السكروز اللازمة لتحقيق الكثافة المطلوبة. فعال في تسليم في المختبر من siRNA تغليف في exosomes أعدت في هذا البروتوكول يسلط الضوء على إمكانات هذا النظام كجيل جديد من العلاج التدخل الحمض النووي الريبي على أساس سرطان البنكرياس.للبدء، الخلايا لثقافة HEK-293 في الوسط العادي، كما هو موضح في المخطوطة. توسيع الخلايا إلى أربع قارورة T75، وتنمو حتى تصل إلى 90٪التقاء. لإعداد قارورة مفاعل حيوي، إضافة 50 إلى 100 ملليلتر من المتوسط العادي في الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي لتبلل الغشاء.جمع جميع خلايا HEK-293 من قارورة T75 الأربعة، وإعادة تعليقها في 15 ملليلتر من الوسيلة المنضبة exosome في أنبوب الطرد المركزي. ثم، استخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة لإضافة بعناية هذا التعليق الخلية إلى حجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي. ثم، ملء الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية، تصل إلى 500 ملليلتر، واحتضانه في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع.بعد أسبوع واحد من الحضانة، وإزالة كل المتوسطة من خزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي عن طريق صب بها. باستخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة، قم بإزالة كل الوسط من حجرة الخلية. ثم، إضافة 50 إلى 100 ملليلتر من المتوسط العادي إلى الخزان المتوسط و 15 ملليلتر من المتوسط الطازج المنضب إلى مقصورة الخلية باستخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة.ثم، ملء الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية تصل إلى 500 ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع آخر. لمسح مسبق المتوسطة المُحَطَّطة التي تم جمعها، يتمّ طرد مركزي عند 500 مرة ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.نقل المابير في أنبوب جديد، والتخلص من بيليه. بعد تكرار هذه الخطوة الطرد المركزي مع مستردة، استرداد عظمى مرة أخرى والتخلص من بيليه. ثم، الطرد المركزي مُسترد فوق في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة و أربع درجات مئوية.الحفاظ على عظمى، والتخلص من بيليه. تصفية المابير مرة واحدة من خلال مرشح 22 ميكرومتر تعلق على حقنة 20 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي جديد. وفي الوقت نفسه، لإعداد محلول السكروز 25٪في أكسيد الديوتيريوم، تزن بدقة 1.9 غرام من السكروز في أنبوب عالمي.ثم يضاف أكسيد الديوتيريوم حتى يصل الوزن إلى 7.6 جرام. ثم، ملء أنبوب فائقة الوضوح مع 22.5 ملليلتر من المتوسطة مكيفة تطهيرها مسبقا. ضع ماصة زجاجية في الأنبوب.إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول السكروز من خلال ماصة بحيث يشكل الحل طبقة منفصلة تحت المتوسطة مكيفة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على محلول متوسط / سكروز مكيف بالطبقات بعناية في دلو دوار متأرجح. تأمين دلو في الدوار.ضع الدوار في الrifuge فائقة التركيز، وتدور في 100، 000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. جمع ملليلترين من طبقة السكروز من الأنبوب، ملليلتر واحد في وقت واحد باستخدام ماصة P1000، مع طرف تعلق على طرف 10 ميكرولتر، وإضافته إلى زجاجة الطرد الفائق التي تحتوي على 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها للغسيل. ضع الأنبوب في دوار ثابت الزاوية، وطاردة مركزية عند 100،000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.استخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لإزالة بعناية افرنح. Resuspend بيليه مع 400 microliters من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها. قبل البدء في الكهربة، قبل ابرد cuvette الكهربائي على الجليد لمدة 30 دقيقة.اخلط سبعة ميكروجرامات من الإكسوسومات مع 33 ميكروغرام من الـ سيرنا في أنبوب ميكروسنتريفوغ. إضافة حمض الستريك العازلة لتحقيق حجم 150 ميكروليتر. يُضاف خليط الإزسوس-سيرنا إلى الكوفيت الكهربائي باستخدام ماصة بلاستيكية، وارفع الغطاء عن الكوفييت.ضع الكوفيت في الاتجاه الصحيح في حامل cuvette من electroporator ، وتناوب عجلة الدوران من 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة. حدد البرنامج المطلوب، واضغط على الزر ابدأ لبدء electroporation. سوف تشير الشاشة إلى نبضة ناجحة.ثم، بدوره إلى الوراء عجلة 180 درجة عكس عقارب الساعة، وإزالة cuvette. استخدام ماصة بلاستيكية لإزالة العينة من cuvette في أنبوب جديد microcentrifuge. إبقاء أنبوب على الجليد أو في الثلاجة قبل مزيد من المعالجة، إذا لم تستخدم على الفور.لبدء إزالة سرنا الحرة، وتمرير 3.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها من خلال العمود الكروموغرافيا استبعاد حجم مرتين لتكميله. ثم، قم بحل 150 ميكرولترات من عينة كهربائية في 350 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها، ونقلها إلى عمود لجنة الأوراق المالية والبورصة. جمع أول 500 ميكرولتر الكسر مائل من العمود في أنبوب microfuge، ووضع علامة على أنها F0. ثم ، إضافة 500 microliters من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها إلى العمود.جمع الكسر التالي، ووضع علامة على أنه F1. كرر إضافة برنامج تلفزيوني وجمع كسور elution حتى يتم جمع ما مجموعه 10 500-microliter الكسور، أو حتى F9. وأخيراً، لإزالة أي بقايا عينة، قم بغسل العمود بمقسم PBS مرتين على الأقل، ثم تابع التجارب، كما هو موضح في المخطوطة. أظهر التحليل المورفولوجي باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال أن الهك-293 exosomes كانت هياكل كروية أكبر قليلا من 100 نانومتر.هذه النتيجة تتفق مع ذلك من قياس تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، والتي أظهرت أيضا حجم توزيع الاكسوسومات. وعلاوة على ذلك، كانت إيجابية لعلامات exosomal CD81، CD9، و CD63. تم حساب النسبة المئوية لاسترداد السوسات النقية باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم والنسبة المئوية لاسترداد الرنا كما هو موضح في المخطوطة.وكان الانتعاش بعد تنقية الإكسوسوم 75٪ باستخدام منحنى معيار سيرنا، وكفاءة تغليف سيرنا في الإكسوسيات كان يحسب ليكون حوالي 10 إلى 20٪ تحليل تدفق الخلايا cytometry النوعية من امتصاص في المختبر من exosomes محملة الفلورسنت Atto655-siRNA أظهرت أن الخلايا PANC-1 تعامل مع exosomes مغلفة من سيرنا كان أكبر تحول في الفلور. وقد تأكد ذلك من خلال النتيجة التي وجدت أن الخلايا PANC-1 المعالجة مع exosomes المغلفة من سيرنا سجلت نسبة أعلى من السكان إيجابية لإشارة Atto655 مقارنة بتلك المعالجة مع exosomes تفريغ وخليط سيرنا. وكان امتصاص الخلوية من سيرنا أيضا أعلى بكثير في خلايا PANC-1 تعامل مع exosomes سيرنا المغلفة مقارنة مع تلك المعالجة مع خليط اكسوزووم-سيرنا، مما يؤكد أن exosomes سيرنا مغلفة تم استيعابها من قبل الخلايا PANC-1 وأنها تسليم فعال سيرنا داخل الخلايا.من المهم أن تزن السكروز وأكسيد الديوتيريوم بدقة شديدة عند إعداد محلول السكروز، ودائما استخدام محلول السكروز الطازج لتجنب تغيير الكثافة أثناء التخزين. يمكن إجراء المجهر Confocal من أجل مزيد من التحقق من استيعاب siRNA مغلفة في exosomes في الخلايا ودراسة الاتجار داخل الخلايا بعد امتصاص الخلوية. يسمح لنا هذا البروتوكول بتقييم الضربة القاضية الخاصة بالجينات من الـ siRNA التي يتم توصيلها بواسطة exosome وتعمل كأداة للتحقق من صحة الهدف الجديد في علاج السرطان القائم على تدخل الحمض النووي الريبي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

فيروس تقديم أدلة كريسبر للبروستاتا موريني لتحوير الجينات

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

في الجسم الحي توصيل الجينات إلى الخلايا الظهارية الثديية للفأر من خلال الحقن الثديي داخل القناة

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

تحليل Multiomics ل TMEM200A كمؤشر حيوي شامل للسرطان

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي النخوي إلى تعدد القدرات

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines (Video) | JoVE 

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells (Video) | JoVE 

القياس الكمي للحمض النووي الريبوزي المرسال في خلايا سرطان المعدة الغدي المنقولة TMEM200A siRNA