Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

F. N. Faruqu er finansieret af den malaysiske regering agentur Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu er modtager af Marie Curie-Sklodowska individuelle stipendier (Horizon 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal anerkender finansiering fra BBSRC (BB/J008656/1) og Wellcome Trust (WT103913). Forfatterne vil også gerne takke Dr. Paul Lavender og Dr. David Fear (Institut for respiratorisk medicin og allergi, King's College London) for at give electroporator.

1. celle kultur i en bioreaktor kolbe
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig1.jpg"> Figur 1: kultur af celler i bioreaktor kolbe til produktion af exosome. (A) forenklet anatomi af bioreaktor kolben. (B) start kultur i bioreaktor kolben. Se Tabel af materialer for sammensætningen af normale og exosome-forarmet medium (C) høst aircondition medium (CM) og vedligeholdelse af kultur i bioreaktor kolben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol><li>Kultur HEK-293 celler i normal medium (Se Tabel af materialer; 5% CO2, 37 ° C) og udvide dem i 4 x T75 målekolber (indtil 90% sammenflydende).</li>
	<li>Våd membran bioreaktor kolbens ved at tilføje 50-100 mL af normale medium i den mellemstore reservoir af bioreaktor kolben.</li>
	<li>Indsamle alle HEK-293 celler fra 4 x T75 og resuspend dem i 15 mL af exosome-forarmet medium (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Tilføje HEK-293 cellesuspension til celle rum bioreaktor kolbens ved hjælp af en 20 mL sprøjte tilsluttet en stump fyld nål (Se Tabel af materialer), med omhu for at fjerne en boble, som kan have dannet.</li>
	<li>Fylde de mellemstore reservoir af bioreaktor kolben med normal medium op til 500 mL og holde kolbe i inkubator (5% CO2, 37 ° C) for en uge.</li>
</ol>2. konditioneret Medium (CM) høst fra bioreaktor kolbe
<ol><li>Efter 1 uge, kassere alle medium i den mellemstore reservoir af bioreaktor kolben.</li>
	<li>Fjerne alle medium i celle rum (dvs., CM) ved hjælp af en 20 mL sprøjte tilsluttet en stump fyld nål.</li>
	<li>Tilføje 50-100 mL af normale medium til medium-reservoiret.</li>
	<li>Tilsættes 15 mL exosome-forarmet medium til celle rum ved at fjerne den gamle medium og tilføje frisk exosome-forarmet medium ved hjælp af en 20 mL sprøjte tilsluttet en stump fyld nål.</li>
	<li>Fylde den medium reservoir af bioreaktor kolben med normal medium op til 500 mL og holde kolbe i inkubator (5% CO2, 37 ° C) for en anden uge. Bemærk: Kulturen kan videreføres i mere end et år. For trin 2.2 CM fra den første høst vil ikke blive brugt til exosome isolation og kasseres. For de 2nd og efterfølgende høst holdes CM til exosome isolation.</li>
</ol>3. Exosome Isolation på en saccharose pude
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig2.jpg"> Figur 2: isolering og karakterisering af exosomes. (A) før clearing høstede konditioneret medium (CM) fra døde celler og celle debris. (B) isolere exosomes fra CM til saccharose pude. C vask skridt til at fjerne saccharose og kontaminerende proteiner. (D) isolerede exosomes blev derefter udsat for fysisk-kemiske, biokemiske og morfologiske karakterisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol><li>Pre klart CM (fra trin 2.2) af differential centrifugering og filtrering, som følger.<ol>
<li>Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten ind i et nyt rør og kassér pelleten. Gentag dette centrifugering trin endnu engang, at inddrive supernatanten og kassere pelleten.</li>
		<li>Centrifugeres supernatanten fra trin 3.1.1 ved 2.000 x g i 15 min. og 4 ° C og derefter kasseres pellet. Filtrere den gendannede supernatanten engang gennem 0,22 µm filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Under pre clearing, forberede 25% (w/w) rørsukkeropløsning i deuteriumoxid præcist vejer ud 1.9 g (± 0,001 g) af saccharose i en universal rør, og derefter topping med deuteriumoxid indtil vægten når 7,6 g (± 0,001 g).</li>
	<li>Fyld op en ultracentrifuge tube (Se Tabel af materialer) med 22,5 mL af pre-ryddet CM. fyldes op CM til 22,5 mL med 0,22 µm-filtreret PBS hvis den aktuelle diskenhed er mindre end der.</li>
	<li>Sted et glas pipetteres (Se Tabel af materialer) i røret, og gennem det, tilsættes 3 mL saccharose således at løsningen danner et separat lag under en CM.</li>
	<li>Omhyggeligt sted rør indeholdende lagdelt CM/rørsukkeropløsning ned i spanden af en swing-out rotor (Se Tabel af materialer), og fastgør spanden ind i rotoren.</li>
	<li>Placere rotoren i ultracentrifuge (Se Tabel af materialer) og spin på 100.000 x g for 1,5 h ved 4 ° C.</li>
	<li>Indsamle 2 mL af saccharose lag og tilføje dette til en ultracentrifuge flaske (Se Tabel af materialer) indeholdende 20 mL filtreret PBS for en vask trin.</li>
	<li>Sted rør ind i en fast vinkel rotor (Se Tabel af materialer) og spin på 100.000 x g for 1,5 h ved 4 ° C.</li>
	<li>Forsigtigt fjerne supernatanten med 10 mL serologisk pipette og resuspenderes med 400 µL filtreret PBS. Holde exosome bestand på 4 ° C eller-80 ° C for kortsigtede og langsigtede oplagring henholdsvis.</li>
</ol>4. karakterisering af Exosome størrelse og udbytte af nanopartikel Tracking analyse (NTA)
<ol><li>Gør 1:1, 000-1:50, 000 fortyndinger af exosome lager i 1 mL (minimum 750 µL) volumen for at opnå 20-80 partikler i rammen visning af NTA instrument (Se Tabel af materialer) display.</li>
	<li>Injicere den fortyndede exosome bestand i NTA instrument prøve salen ved hjælp af en 1 mL sprøjte, og Indsæt temperatursonden af et termometer i temperatur sondens åbning.</li>
	<li>Indstille NTA software (Se Tabel af materialer) til optagelse som følger: 3 standard målinger, 30 s hver, manuel temperatur indstilling ukontrolleret; og Indtast fortyndingsfaktoren under fanen Avanceret .</li>
	<li>Angive kameraet til 13 og køre scriptet opsamling på NTA software, indsprøjte en frisk parti af prøven og indtastning af temperaturen i prøve salen når du bliver spurgt efter hver læsning.</li>
	<li>Indstil tærsklen til 4 for den efterfølgende analyse del, og Bemærk modal gennemsnitsstørrelse og partikel koncentration af exosome materiel fra målingerne.</li>
</ol>5. karakterisering af Exosome renhed af partikel: Protein Ratio bestemmelse
<ol><li>Foranstaltning exosome bestand af en bicinchoninic syre (BCA) protein assay proteinindhold kit (Se Tabel af materialer) som følger.<ol>
<li>Forberede den definerede standarder.
		<ol>
<li>Forbered standarden for den højeste koncentration (500 µg/mL) ved at tilføje 45 µL af BSA stamopløsning (2 mg/mL – findes i analysen kit) til et microcentrifuge rør, og gøre det op til 180 µL med PBS.</li>
			<li>Fylde 8 microcentrifuge rør med 90 µL af PBS.</li>
			<li>Serielle fortyndinger (faktor: 0,5) ved at tage 90 µL fra den højeste BSA standard og tilføjer det i 1st microcentrifuge tube med PBS (mix godt), og derefter tager 90 µL fra dette rør og føje det til 2nd microcentrifuge tube.</li>
			<li>Gentag dette indtil 7 microcentrifuge røret. 8. røret bliver bare PBS (dvs. tomt: 0 µg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forberede exosome prøver ved 1:2 fortynding af prøver med PBS i en samlet maengde paa 90 µL (45 µL af prøven, 45 µL af PBS).</li>
		<li>Forberede BCA arbejder reagens mix.<ol>
<li>Beregning af det samlede volumen af BCA arbejder reagens mix behov (50 µL pr. brønd i dubletter, herunder standarder).</li>
			<li>Bland de enkelte BCA reagenser efter følgende forhold: 25 dele reagens A: 24 dele reagens B: 1 del reagens C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Udføre analyse og analyse.<ol>
<li>Tilføje 40 µL af hver standard og exosome prøve, der tilberedes over i en brønd på en 96-brønd plade (dubletter for hver standard og prøve). Bemærk: Da dette er en kolorimetrisk assay, ordentlig pipettering teknik er afgørende for at opnå nøjagtige resultater. Ændre pipetter efter tilføjer hver standard/prøve replikeres i hver af brøndene</li>
			<li>Tilsæt 50 µL af protein analysen arbejder reagens blandes ind i hver brønd og Inkuber plade ved 37 ° C i 30 min. Bemærk: For at minimere afvigelser mellem replikater, tilføje protein assay arbejder reagens i 1st replikeres i en standard/stikprøve, efterfulgt af 2nd replikat af den samme prøve/standard, før du føjer det til 1st kopiere en anden prøve/standard.</li>
			<li>Absorbansen måles på 562 nm på i pladelæseren (Se Tabel af materialer).</li>
			<li>Afbilde en standardkurve fra absorbans værdier af standarderne, og træne protein koncentrationen i hver prøve ved hjælp af ligningen for kurven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne partikel: protein-forhold ved at dividere exosome udbytte opnået tidligere med proteinkoncentration exosome bestanden målt over.</li>
</ol>6. karakterisering af Exosomal markør udtryk ved flowcytometri
<ol><li>Inkuber 40 µL af exosomes (≥1x1011 partikler/mL) med 10 µL af aldehyd/sulfat latex perler (ufortyndet fra lager) i 15 min. ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Tilsæt 5 µL af 100 µM BSA løsning (Se Tabel af materialer) til exosome-perle blandingen for at opnå en 10 mM slutkoncentration og Inkuber i 15 min. ved RT.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL PBS og inkuberes i 75 min. ved RT i et microcentrifuge rør med mild uro på en vuggende shaker (~ 150 rpm).</li>
	<li>Centrifugeres suspension på 580 x g i 5 min på RT og supernatanten.</li>
	<li>Resuspenderes med 1 mL 100 mM glycin løsning (Se Tabel af materialer) og der inkuberes i 30 min. ved RT.</li>
	<li>Der centrifugeres suspension for 5 min på 580 x g. udsmid supernatanten og resuspenderes med 1 mL 3% FBS/PBS (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Gentag trinnet vask og resuspenderes i 350 µL af 3% FBS/PBS.</li>
	<li>Opdele suspension i 7 rør, hvert indeholdende 50 µL af suspension og inkuberes dem med fluorophore-konjugerede anti-CD81, anti-CD9 og anti-CD63 antistoffer og deres tilsvarende isotype kontrol (1:10 fortynding), henholdsvis i 45 min. ved 4 ° C. Hold 1 rør som en unstained kontrol, men undergår den samme forarbejdning.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af 3% FBS/PBS til hver tube, centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.</li>
	<li>Resuspenderes med 200-400 µL af 3% FBS/PBS og analysere eksempel på flow-Flowcytometret (Se Tabel af materialer) under de rette kanaler.</li>
</ol>7. karakterisering af Exosome morfologi af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM)
<ol><li>Fix exosome vandig dispersioner i passende koncentrationer som 1010 p/mL ved fastsættelsen af løsning (Se Tabel af materialer) i 15 min.</li>
	<li>Prøver på 300 mesh carbon belagt kobber gitre og overlade til luft tørre.</li>
	<li>Negativt pletten prøver med 0,22 µm-filtreret vandig uranyl acetat (Se Tabel af materialer) i 4 min. efterfulgt af to 50% methanol/H2O vask (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Luft tørre prøven.</li>
	<li>Observere prøver under TEM (Se Tabel af materialer). Angiv den accelererende spænding på 80 kV og spot størrelse på 2. Brug objektive blænde med alle prøver.</li>
</ol>8. siRNA indkapsling i Exosomes af elektroporation
<ol><li>Pre chill elektroporation kuvette (Se Tabel af materialer) på is i 30 min før elektroporation.</li>
	<li>Mix 7.0 µg for exosomes (32 µL fra 7 x 1012 p/mL lager i PBS) med 0,33 µg siRNA (12 µL fra 2 µM lager i RNase-fri vand) i microcentrifuge rør. Fyldes op til 150 µL med citronsyre buffer (Se Tabel af materialer). Exosome at siRNA molære forhold er 1:60 i dette tilfælde.</li>
	<li>Overfør blandingen til elektroporation kuvette. Cap kuvette og placere den i kuvette indehaveren af electroporator (Se Tabel af materialer). Dreje dreje hjulet 180° med uret. Bemærk: Hjulet skal slås helt til låst position, for at kuvette kontakte elektroderne.</li>
	<li>Vælg den ønskede elektroporation program (f.eks. X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, osv.) og start elektroporation ved at trykke på knappen Start . Bemærk: En vellykket puls er indiceret ved at vise "OK" på displayet.</li>
	<li>En gang electroporated, fjerne kuvette efter vender tilbage hjul 180° mod uret. Trække eksemplet fra kuvette med den plast pipette til videreforarbejdning.</li>
</ol>9. fjernelse af gratis siRNA brug størrelse udstødelse kromatografi (sek)
<ol><li>Blandingen henstår kolonnen SEK (2,9 cm [H] x 1,3 cm [W]; Se Tabel af materialer) ved at passere 3,5 mL PBS, filtreret to gange.</li>
	<li>Opløse 150 μl af electroporated prøven i 350 μl af filtrerede PBS og overføre dette til kolonnen sekund til at udføre gratis siRNA fjernelse.</li>
	<li>Indsamle de første 500 μL brøkdel der elueres fra kolonnen (F0).</li>
	<li>Tilsæt 500 μL af filtrerede PBS til kolonnen og indsamle de næste 500 μL brøkdel (F1).</li>
	<li>Gentag ovenstående trin, indtil 10 x 500 μL fraktioner (op til F9) alt er indsamlet. F1 og F2 bør indeholde de siRNA-indkapslede exosomes.</li>
	<li>Kolonnen udvaskes med filtreret PBS (to gange, i det mindste) til at fjerne enhver prøve rester.</li>
</ol>10. in Vitro optagelsen af siRNA-Loaded Exosomes PANC-1 celler
<ol><li>Frø PANC-1 celler i 24-godt flad bund plader (Se Tabel af materialer) med en tæthed på 50.000 celler pr godt 24 timer før optagelsen studere og inkuberes celler i inkubator (5% CO2, 37 ° C).</li>
	<li>Electroporate HEK-293 exosomes (7,0 μg) med Atto655-siRNA (0,33 μg) pr. trin 8.</li>
	<li>Rense electroporated exosome pr trin 9 og resuspend i 100 μL af PBS.</li>
	<li>Tilsæt 50 μL af electroporated exosomes til PANC-1 celle og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 til 4 h.</li>
	<li>Indsamle celler efter inkubation.</li>
	<li>Cellerne vaskes med 1 mL steril PBS og resuspend i 200 μl af PBS i polystyren runde-nederste rør (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Analysere celler ved flow forskellige (Se Tabel af materialer) med 10.000 begivenheder erhvervet pr. prøve. Bemærk: FN-electroporated exosome-siRNA blanding prøver og ubehandlede celler med filtreret PBS blev brugt som kontrol.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

At opnå en anstændig exosome udbytte fra dyrkede celler, er som er nok til flere runder in vitro eller i vivo undersøgelser, stadig en udfordring. Ifølge producenten, var bioreaktor kolberne beregnet til produktion af antistoffer og proteiner med højt udbytte fra kultur af forskellige udødeliggjort cellelinjer. Dette tillader cellerne at løbende berige næringssubstratet med den ønskede vare, hvilket resulterer i en koncentreret konditioneret medium (CM) i celle-rum. Teoretisk set, det samme koncept ville være gavnlige i exosome produktion fra forskellige cellelinjer, og faktisk dyrkning af disse celler i bioreaktor kolber blev demonstreret for markant at øge exosome udbytte40. Den store mellemstore reservoir kontinuerligt leverer næringsstoffer til og fjerner affald fra celle rum via en 10 kDa semipermeabel membran, giver langvarig kultur uden at kræve en stor mængde af medium til at være i kontakt med cellerne, eller regelmæssig kolber ændring, som kan i sidste ende spare de samlede omkostninger og arbejdskraft af høj-skala exosome produktion40. Det blev også påvist, at morfologi, fænotype samt immunmodulerende funktioner af exosomes isoleret celler langsigtede bioreaktor kolber kulturer der ligner der stammer fra celler dyrkes i regelmæssig 75 cm2 kolber40. Kultur af andre udødeliggjort cellelinjer som exosome kilder i bioreaktor kolben vil derfor bidrage til at øge deres exosome udbytte samtidig bevare deres integritet og funktion. Denne form for kultur er imidlertid ikke relevant for primærelementer med begrænset division cyklusser, og dem, der ikke kan være kulturperler i høj densitet.
Da høsten af CM foregår ugentligt, og cellerne i kulturen blev aldrig passaged, kan det antages, at cellerne i bioreaktor kolben ikke vokser i en éncellelag som den regelmæssige cellekultur. De er mest tilbøjelige til at danne klynger med nekrotisk centre, eller blot løsne sig fra overfladen og dø når cellerne er også sammenflydende for en éncellelag. Besigtigelse af celle til kabinen bioreaktor kolbens er ikke muligt at bekræfte denne antagelse, men afspejles af det store antal døde celler fremstillet under CM høst. Regelmæssig fjernelse af dårligt tilhænger og ikke-levedygtige celler fra bioreaktor kolben kan forhindre ophobning af materialer på den semipermeable membran, der kan påvirke udvekslingen af gas, næringsstoffer og affald mellem celle rum og mediet reservoir, således at langvarig kultur i bioreaktor kolberne for > 6 måneder40. I denne forbindelse, denne ikke-formelle rigtighed cellevækst i bioreaktor kolberne er ideel som vi spekulere at den efterligner den faktiske tilstand af tumor vækst i vivo tættere end konventionelle éncellelag cellekultur, og det er håbet, at exosomes produceret af kræft celler i bioreaktor kolben ville være mere ligner der udskilles af tumorer in vivo. Dette vil være særligt gavnligt i undersøgelser, der ser ind i rollen som tumor-afledte exosomes i progressionen af tumor patologi. Tumor-afledte exosomes er blevet rapporteret til uløseligt og fortrinsvis hjem til deres væv af oprindelse32, derfor har exosomes produceret i et system, der efterligner deres i vivo produktion ville også være ønskeligt i undersøgelser, der ser på at udforske den passive målretning evne af exosomes som lægemiddel nanocarriers.
P:P forholdet blev rapporteret som en parameter til vurdering af renheden af isolerede exosomes fra forurener proteiner fra næringssubstratet af fysiologiske væsker som exosomes blev indkøbt fra41. P:P forholdet mellem 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg indhentet i denne undersøgelse falder inden for området høj renhed foreslås i undersøgelsen. Dette forhold understreger faren ved hjælp af proteinkoncentration udtrykke udbytte eller dosis af exosomes isoleret eller anvendes i undersøgelser, nedstrøms henholdsvis, som det ikke afspejler det sande antal exosomes tilgængelige i stikprøven givet problemet med protein forurening under dyrkning. NTA via instrumenter såsom NanoSight, som måler koncentrationen af exosomes i partikel antallet, er en mere fornuftig og præcis måde af kvantificere exosomes.
Meget præcis vejning under udarbejdelsen af 25% rørsukkeropløsning deuteriumoxid er afgørende, da denne metode er en massefylde-baserede isolering. Exosomes har en temmelig smal vifte af flotation tæthed i rørsukkeropløsning så præcis forberedelse af saccharose pude vil reducere forurening af ikke-exosomal vesikler såsom apoptotiske organer eller fremstillet på basis af Golgi vesikler under isolation42. Det tilrådes ikke at holde sidesten rørsukkeropløsning og bruger det selv efter en dag for at undgå risikoen for faktorer, der kan ændre dets massefylde f.eks tab eller tilsætning af vand i løsningen af enten fordampning eller kondensering af luften i røret. Brug af en swing-out rotoren er også væsentlige under centrifugering på saccharose pude til at tillade endda overflytning af exosomes fra CM til rørsukkeropløsning.
Fratagelse af saccharose løsning efter centrifugering er også en delikat skridt, og det drejer sig om at finde et kompromis mellem maksimere mængden af exosomes inddrives, og ikke for meget at protein fra dyrkningsmediet er introduceret til exosome prøven udtages . Grænsefladen mellem rørsukkeropløsning og mediet, betingelse er hvor proteiner fra næringssubstratet ville indsamle efter centrifugering, og kan normalt ses som en mørk brun ring, der sidder på grænsefladen. I vores hænder er hævning 2 mL af saccharose pude fra de oprindelige 3 mL tilsat den optimale volumen, der er enig med det kompromis, der er nævnt ovenfor. De mængder, der er beskrevet i denne protokol er for de specifikke rotorer anvendes; Derfor, det tilrådes at optimere mængden saccharose trækkes tilbage når skalering opad eller nedad diskenheder for typerne af rotorer findes i forskellige faciliteter. Det er også vigtigt at undgå lige på midten af bunden af røret, når trække saccharose, da dette er hvor partikler af højere tæthed end saccharose bliver sediment og kan normalt ses som en off-white pellet.
Trinnet vask med en forholdsvis stor mængde af PBS hjælper til yderligere for at reducere graden af protein forurening under exosome isolation41. Dette trin er også afgørende for at fjerne overskydende saccharose fra exosomes for at undgå osmotisk skader på exosomes selv eller biomolekyler i exosomal lumen, samt reducere risikoen for bakteriel og/eller svampe vækst på exosome lager. Forberede rørsukkeropløsning i deuteriumoxid snarere end vand hjælper med at reducere mængden af sakkarose for at opnå exosome flotation tæthed for isolation, dermed mindske risikoen for både osmotisk skader og mikrobiel kontaminering. Efter den første centrifugering på saccharose pude, exosome-holdige saccharose lag trukket tilbage og føjet til PBS kan opbevares ved 4 ° C og behandles den følgende dag hvis konfronteret med tidspresset.
Til bedste af vores viden er exosome/siRNA kindtand forholdet en vigtig faktor for effektiviteten af elektroporation. I denne protokol brugte vi 1:60 som exosome at siRNA molære forhold. Som indkapsling mulighed for forskellige typer af exosomes er forskellige, anbefaler vi kraftigt at optimeres på et sag til sag grundlag. Indkapsling effektivitet foreslået heri kan dog altid være en parameter for at vælge de optimale elektroporation betingelser.
Derudover menes sammenlægning af siRNA at være en af de mest almindelige problem i elektroporation. Det er bevist, at elektroporation kan fremkalde stærke sammenlægning af siRNA, hvilket gør det endnu sværere at komme ind exosomes. siRNA sammenlægninger er ofte fejlagtigt fortolkes som indkapsling af siRNA i exosome derfor ordentlig kontrol blev anvendt i denne undersøgelse som dannelsen af siRNA aggregater er uundgåelig i løbet af elektroporation28. Procentdel indkapsling effektiviteten af vores rensning metode blev beregnet ved hjælp af normaliserede værdier for at minimere påvirkning fra andre kilder såsom baggrund støj, exosome og siRNA sammenlægninger, som ville påvirke datapålidelighed. Baseret på vores resultater, var der ubetydelig siRNA sammenlægninger observeret i den kontrol prøve dvs. ved hjælp af electroporated og un-electroporated siRNA.
Denne protokol har vist siRNA indkapsling i exosomes og deres efterfølgende intracellulære levering af siRNA til kræft celler in vitro. Forskellige typer af exosomes fra forskellige cellelinjer kan derfor være isoleret og karakteriseret ved hjælp af den foreslåede protokol og efterfølgende fyldt med forskellige terapeutiske siRNA for forskellige typer af muterede mål over udtrykt i forskellige kræftformer. Et interessant program ville være at udforske siRNA levering og optagelse effektivitet ved hjælp af forskellige permutationer af exosome kilde-mål celle par in vitro. Dette kan derefter oversættes til dyremodeller for at vurdere effektiviteten af både levering og terapeutisk effektivitet af siRNA-indkapslede exosomes in vivo.

Exosomes er en undertype af ekstracellulære vesikler (EV) spænder fra 50-200 nm i diameter, udskilles af forskellige celletyper såsom immunceller1,2, kræftceller3,4,5, 6 og stilk celler7. Exosomes har også vist sig at være til stede i forskellige fysiologiske væsker8,9,10,11. Kombinationen af exosomes iboende evne til at bære forskellige biomolekyler (fx, RNA og proteiner)12,13,14 og effektiv levering af disse biomolekyler i modtagerens celler 15 , 16 , 17 tiltrukket interesse for deres potentiale som nano-skala drug delivery vektorer. Forskellige små molekyler, der tjener som anti-cancer og anti-inflammatoriske lægemidler har vist sig for at være korrekt indlæst i exosomes og leveret til target celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. det er interessant, nukleinsyrer som siRNA28,29 og mikroRNA30 også er succesfuldt indlæst i exosomes via elektroporation og leveret til target-cellerne.
For nylig, RNA interferens (RNAi) via små interfererende RNA (siRNA) har fået større interesse som den foretrukne mekanisme i genhæmning på grund af sin høje specificitet, potent virkning, minimale bivirkninger og lethed af siRNA syntese28, 29. siRNAs er dobbelt-strenget RNA molekyler spænder fra 19 til 25 nukleotider i længde at udløsere sekvens-specifikke katalytisk mRNA knockdown. På grund af dens store molekylvægt og polyanionic karakter er passiv optagelsen af nøgne siRNA ind i cellerne hindret28,29. Det er heller ikke muligt for nøgen siRNA til at blive injiceret i systemisk cirkulation på grund af hurtig nedbrydning af plasma nukleaser31. Således ville indkapsling af siRNA i en nanocarrier støtte effektiv levering og optagelsen af siRNA i target-cellerne.
Exosomes er et ideelt system til siRNA indkapsling som sin struktur er sammensat af en hule, vandig core omsluttet af en phospholipid tolagede. Exosomes ikke blot har god stabilitet i blodet men også har naturlige målretning egenskaber at levere funktionelle RNA i celler32. Undersøgelse foretaget af Alvarez-Erviti et al. med succes demonstreret effektiv levering af siRNA til hjernen hos mus bruger manipuleret exosomes med næsten ingen komplikationer31. Det er en hypotese, exosome-baseret terapi er forholdsvis mere sikkert end andre behandlingsformer som exosomes ikke replikere endogent, da cellerne ønsker og derfor ikke udviser metastatisk egenskaber15.
Forskellige metoder er blevet rapporteret med held isolere exosomes fra enten cellekultur eller fysiologiske væsker. Den mest populære metode bruger ultracentrifugering for at sammenpresse exosomes fra start materiale31,32,33. Denne metode kan være ganske hårde på exosomes og normalt Co bundfald proteiner fra prøven. Kombinere ultracentrifugering med en massefylde-baseret adskillelse som saccharose forløb bliver mere almindeligt, at reducere protein og ikke-exosomal kontaminering i isolerede exosomes19,34. Størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) giver mulighed for adskillelse af exosomes fra andre typer af ekstracellulære vesikler (EV) ved størrelse og kan også resultere i minimal protein forurening men er begrænset af lille mængde starter materiale det kan behandle35, 36. Immunoaffinity opsamling bruger perler belagt med antistoffer, der bindes til exosomal overflade proteiner som tetraspanins eller andre celle-specifikke markør, der giver mulighed for specifikke erobringen af exosomes i stedet for evt- eller andre proteiner, samt isolere delpopulation af exosomes fra hele prøver, men igen er begrænset af mængden af start materiale og er dyre36,37. Polymer-baserede udfældning af exosomes plejede at være populære også, men da det er en temmelig rå nedbør, det fører til en højere ikke-exosomal vesikel og protein forurening38,39.
Elektroporation er blevet rapporteret til dens ineffektivitet som en metode til at indlæse exosomes med siRNA på grund af protein sammenlægning15,28,31. Transfektion-baserede tilgange blev påvist for at have bedre lastning effektivitet og protein stabilitet, men er uønskede på grund af dens toksicitet og bivirkninger af Transfektion agenter at ændre cellulære gen expression28. Således har elektroporation været mere udbredt i siRNA ilægning i exosomes, da det er en sikrere metode. Men en optimeret encapsulation metode skal indføres for at levere tilstrækkelige mængder af siRNA til mål-webstedet til en potent gen knockdown.
Her foreslår vi en exosome isolation protokol bruger tæthed-baserede ultracentrifugering på bare en enkelt 25% (w/w) saccharose pude forberedt i deuteriumoxid, snarere end et saccharose tæthed farveforløb. Dette er en omkostningseffektiv metode, der omgår den møjsommelige tæthed gradient forberedelse og tillader behandling af store mængder af starter materiale, men resulterer i intakt exosomes af højt udbytte og renhed egnet til efterfølgende indlæsning med siRNA. Fluorescerende Atto655-konjugeret uspecifikke siRNA blev indlæst i menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293 celler) afledt exosomes via elektroporation og leveret til menneskelige i bugspytkirtlen adenocarcinom (PANC-1) kræftceller in vitro-.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

Ekstracellulære vesikler, i særlige exosomes, har for nylig fået interesse som roman stof levering vektorer på grund af deres biologiske oprindelse, overflod og iboende evne i intercellulære levering af forskellige biomolekyler. Dette arbejde etablerer en isolation protokol for at opnå høj ydelse og høj renhed af exosomes for siRNA levering. Menneskelige embryonale nyreceller (HEK-293 celler) er kulturperler i bioreaktor kolber og kultur supernatanten (hereon omtalt som konditioneret medium) er høstet på ugentlig basis at tillade berigelse af HEK-293 exosomes. Konditioneret medium (CM) er pre ryddet af døde celler og celleaffald ved differentieret centrifugering og underkastes ultracentrifugering på en saccharose pude efterfulgt af en vask skridt, til at indsamle exosomes. Isolerede HEK-293 exosomes er karakteriseret for udbytte, morfologi og exosomal markør udtryk ved nanopartikel tracking analyse, protein kvantificering, Elektron Mikroskopi og flowcytometri, henholdsvis. Lille interfererende RNA (siRNA), fluorescently mærket med Atto655, er indlæst i exosomes af elektroporation og overskydende siRNA er fjernet af gel filtrering. Celle optagelse i PANC-1 kræftceller, efter 24 timers inkubation ved 37 ° C, er bekræftet ved flowcytometri. HEK-293 exosomes er 107.0 ± 8.2 nm i diameter. Exosome udbytte og partikel til protein forholdet (P:P) forholdet er 6.99 ± 0,22 × 1012 partikel/mL og 8.3 ± 1,7 × 1010 partikel/µg, henholdsvis. SiRNA i exosomes indkapsling effektivitet er ~ 10-20%. Fyrre procent af cellerne vise positive signaler for Atto655 på 24 h efter inkubation. Afslutningsvis tilbyder exosome isolation af ultracentrifugering på saccharose pude en kombination af gode afkast og renhed. siRNA kunne være korrekt indlæst i exosomes af elektroporation og efterfølgende leveres i kræftceller in vitro-. Denne protokol tilbyder en standard procedure for at udvikle siRNA-loaded exosomes til effektiv levering til kræftceller.

De fysisk-kemiske karakterisering af exosomes isoleret fra HEK-293 celler (HEK-293 Exo) er sammenfattet i tabel 1. Størrelsen måles ved hjælp af nanopartikler tracking analyse (NTA) instrument var 107.0 ± 8.2 nm. Exosome udbytte fra HEK-293 celler, også analyseres ved hjælp af NTA instrument, blev 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL fra ~ 24 mL cm (fremstillet af 2 runder af høst). Renhed af HEK-293 Exo vurderet ved at beregne partikel til protein-forhold (P:P) var 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg.
Størrelse fordelingen af isolerede HEK-293 Exo er vist i figur 3A. Morfologisk analyse ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM) viste HEK-293 Exo var sfæriske strukturer lidt over 100 nm i størrelse (figur 3B). Dette resultat stemmer overens med fra NTA måling (figur 3A). Den isolerede HEK-293 Exo var positive for CD81, CD9 og CD63, som er canonical markører, der anvendes til at identificere vesikler som exosomes (figur 3 c).
Til rensning af exosomes ved hjælp af størrelse udstødelse kromatografi (figur 4), blev genfindingsprocent af exosomes beregnet ved at dividere samlede exosome partikel antallet inddrives i de 10 fraktioner indsamles (F0-F9) med de oprindelige exosome partikel antallet bruges, mens genfindingsprocent af siRNA blev beregnet ved at dividere den samlede fluorescens intensitet fremstillet af F3, F4 og F5 med samlede fluorescens-intensiteten opnået fra alle 10 fraktioner indsamles. Genopretning af exosome og siRNA efter rensning blev beregnet som 75,0% og 80,4%, henholdsvis. SiRNA i exosomes indkapsling effektivitet var ~ 10-20%, beregnes siRNA standardkurven etableret (figur 4 c).
Kvalitativ analyse af in vitro- optagelse af exosomes fyldt med de fluorescerende Atto655-siRNA ved flowcytometri viste at PANC-1 celler behandles med siRNA-indkapslede exosomes registreret den største skift i fluorescens signal (figur 5A) . PANC-1 celler behandles med siRNA-indkapslede exosomes indspillet en højere procentdel af befolkningen positivt for det Atto655 signal (39,4%) i forhold til, behandlet med losses exosomes og siRNA blanding (0,56%), som bekræftede bemærkning ovenfor ( Figur 5B). Graden af cellulære optagelse af siRNA (udtrykt som fold forskellen i gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) værdier fra de ubehandlede celler) blev også observeret til at være væsentligt højere i PANC-1 celler behandles med siRNA-indkapslet exosomes (MFI fold forskel = 5.1) i forhold til, behandles med exosome-siRNA blanding (MFI fold forskel = 1.1) (figur 5 c). Disse observationer viser at siRNA-indkapslede exosomes blev internaliseret af PANC-1 celler og at de effektivt leveret siRNA intracellulært.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> Figur 3: biokemiske og morfologi analyse af HEK-293 exosomes. (A) størrelse distribution af HEK-293 exosomes ved hjælp af nanopartikler Tracking analyse (NTA). Kurven viser en overlejrede histogram fra 3 forskellige fanger på 30 s interval med røde områder betegner standardafvigelse mellem målinger (n = 3). (B) transmissions elektronmikroskopi (TEM) billeder af naivt HEK-293 exosomes. Skalalinjen: 100 nm. (C) påvisning af exosomal markører CD81, CD9 og CD63 ved hjælp af flowcytometri på HEK-293 exosomes. Exosomes var koblet til aldehyd/sulfat latex perler før registrering. Exosome-perler kompleks blev efterfølgende farves med fluorophore-konjugerede anti-CD81, anti-CD9 og anti-CD63 antistoffer. Grad af udtryk af markører er udtrykt som fold forskellen i median fluorescens intensitet (MFI) værdier fra for kontrolelementet (exosome-perler komplekse farves med den tilsvarende isotypen). Værdier udtrykkes som betyder ± SD, hvor n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> Figur 4: Exosome rensning post-elektroporation. (A) eluering profiler (F0-F9) af Atto655-siRNA og electroporated exosomes ved hjælp af størrelse udelukkelse chormatography. (B) NTA analyse af både Atto655-siRNA og exosome fra F0 til F9 bruger størrelse udelukkelse chormatography. (C) kalibrering kurve af Atto655 mærket siRNA. Fluorescens intensiteter blev indhentet af Pladelæser på Ex / Em: 640-10/680 nm; Få 2800. Værdier udtrykkes som betyder ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> Figur 5: cellulære optagelse af siRNA-indkapslede exosomes PANC-1 celler på 4 h. (A) histogrammer sammenligne cellulære optagelse af losses exosomes + siRNA blanding og siRNA-indkapslede exosomes. (B) sammenligning af optagelsen af losses exosomes + siRNA blanding på 4 h af pseudocolor plot. (C) fold forskel i middelværdi fluorescens intensitet (MFI) værdier af prøverne testet sammenlignet med ubehandlet celler. Værdier udtrykkes som betyder ± SD, hvor n = 3. P < 0,001. NS: ikke signifikant. En-vejs ANOVA blev brugt til statistisk analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exosome</td>
			<td>Størrelse1,2 (nm)</td>
			<td>Udbytte1,2,3 (p/mL)</td>
			<td>[Protein] 2,4 (µg/mL)</td>
			<td>Partikel til protein (P:P) forholdet5 (p/µg)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-293</td>
			<td>107.0 ± 8.2</td>
			<td>6.99 ± 0,22 x 1012
</td>
			<td>84.3 ± 9,8</td>
			<td>8.3 ± 1,7 x 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 Measured bruger nanopartikel tracking analyse (NTA instrument) 2 værdier udtrykkes som betyder ± SD, hvor n = 3 3 udbytte blev opnået ved celle-aircondition medium samles fra 2 runder af høst fra bioreaktor kolber (~ 24 mL) 4 Measured ved hjælp af et protein assay kit 5 værdien opnået ved hjælp af formlen: P:P ratio = udbytte / [Protein]</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Fysisk-kemiske karakterisering af exosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Forberedelse af Exosomes til siRNA levering til kræftceller

En exosome er en ny generation af drug delivery luftfartsselskaber. Vi etablerede en exosome isolation protokol med højt udbytte og renhed for siRNA levering. Vi har også indkapslet fluorescently mærket uspecifikke siRNA i exosomes og undersøgt den cellulære optagelse af siRNA-loaded exosomes i kræftceller.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Høst exosom-beriget betinget medium fra celler dyrket i bioreaktor kolber og isolering ved saccharose pude ultracentrifugering resultere i exosome forberedelse af højt udbytte med minimal forurenende proteiner eller ikke-exosomal vesicles. Ved hjælp af en enkelt saccharose pude fremstillet i deuteriumoxid omgår den besværlige forberedelse af en diskontinuerlig saccharose gradient og reducerer mængden af saccharose er nødvendig for at opnå den nødvendige tæthed. Effektiv in vitro levering af siRNA indkapslet i exosomer udarbejdet i denne protokol fremhæver potentialet i dette system som en ny generation RNA interferens-baseret behandling for kræft i bugspytkirtlen.Til at begynde, kultur HEK-293 celler i normalt medium, som beskrevet i manuskriptet. Udvid cellerne i fire T75 kolber, og vokse, indtil de når 90% sammenløb. For at forberede en bioreaktorkolbe tilsættes 50 til 100 milliliter normalt medium i bioreaktorkolbens mediumbeholder for at dæske membranen.Alle HEK-293-celler opsamles fra de fire T75-kolber, og de opvarmes igen i 15 milliliter exosome-forarmet medium i et centrifugerør. Brug derefter en 20-milliliter sprøjte forbundet til en stump fyldnål til forsigtigt at tilføje denne celle suspension til cellerummet i bioreaktoren kolben. Derefter fyldes bioreaktorkolbens mediumbeholder med det normale medium, op til 500 milliliter, og inkuberes den ved 37 grader Celsius, 5% CO2 i en uge.Efter en uges inkubation fjernes hele mediet fra bioreaktorkolbens mediumbeholder ved at hælde det ud. Brug en 20-milliliter sprøjte forbundet til en stump fyld nål, skal du fjerne alle mediet fra cellerummet. Derefter tilsættes 50 til 100 milliliter normalt medium til medium reservoir og 15 milliliter frisk exosome-forarmet medium til cellerummet ved hjælp af en 20-milliliter sprøjte forbundet til en stump fyldenål.Derefter fyldes bioreaktorkolbens mediumbeholder med normalt medium på op til 500 milliliter. Inkubere ved 37 grader Celsius, 5% CO2 for en anden uge. For at forfrist det indsamlede konditionerede medium centrifugeres det ved 500 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius.Overfør supernatanten til et nyt rør, og kassér pellet. Efter at have gentaget dette centrifugeringstrin med den genvundne supernatant, skal supernatanten genvindes igen, og pellets kasseres. Derefter centrifuge den genvundne supernatant på 2, 000 gange g i 15 minutter og fire grader Celsius.Hold supernatant, og kassér pellet. Supernatanten filtreres én gang gennem et 22-mikrometerfilter, der er fastgjort til en 20-millilitersprøjte, i et frisk centrifugerør. I mellemtiden, at forberede en 25% saccharose opløsning i deuteriumoxid, præcist afveje 1,9 gram saccharose i et universelt rør.Derefter tilsættes deuteriumoxid, indtil vægten når 7,6 gram. Derefter fylde en ultracentrifuge rør med 22,5 milliliter præ-ryddet konditioneret medium. Anslå en glaspipette i røret.Der tilsættes tre milliliter saccharoseopløsning gennem pipetten, så opløsningen danner et separat lag under det betingede medium. Forsigtigt placere røret indeholder lagdelt konditioneret medium / saccharose opløsning i spanden af en swing-out rotor. Fastgør spanden i rotoren.Placer rotoren i ultracentrifuge, og drej ved 100, 000 gange g ved fire grader Celsius i 1,5 timer. Opsaml to milliliter af saccharoselaget fra røret, en milliliter ad gangen ved hjælp af en P1000-pipette, med spidsen fastgjort til en 10-mikroliterspids, og tilsæt den til en ultracentrifugeflaske, der indeholder 20 milliliter filtreret PBS til vask. Rørret røret i en rotor med fast vinkel, og centrifuger det ved 100.000 gange g ved fire grader Celsius i 1,5 timer.Brug en 10-milliliter serologisk pipette til forsigtigt at fjerne supernatanten. Pellets opsplitning med 400 mikroliter filtreret PBS. Før elektroporationen startes, skal elektroporations cuvetteen startes på is i 30 minutter.Bland syv mikrogram exosomer med 33 mikrogram siRNA i mikrocentrifugerøret. Tilsæt citronsyre buffer for at opnå volumen på 150 mikroliter. Tilsæt exosom-siRNA blandingen til elektroporation cuvette ved hjælp af en plastik pipette, og hætte cuvette.Anbring kuvette i den rigtige retning i elektroporatorens kuvetteholder, og drej elektroporatorens drejehjul 180 grader med uret. Vælg det ønskede program, og tryk på knappen Start for at starte elektroporation. Displayet vil indikere en vellykket puls.Drej derefter hjulet 180 grader mod uret, og fjern kuvette. Brug en plastpipette til at fjerne prøven fra kuvette i et nyt mikrocentrifugerør. Opbevar røret på is eller i køleskab før videre behandling, hvis det ikke anvendes med det samme.For at starte fri siRNA fjernelse, passere 3,5 milliliter filtreret PBS gennem størrelsen udelukkelse kromatografi kolonne to gange for at ligevægt det. Derefter opløses 150 mikroliter elektroporeret prøve i 350 mikroliter filtreret PBS, og overfør den til SEC-kolonnen. Saml den første 500-mikroliter fraktion eluted fra kolonnen i et mikrofuge rør, og markere det som F0. Derefter tilsættes 500 mikroliter filtreret PBS til kolonnen.Indsamle den næste fraktion, og markere det som F1. Tilføjelse af PBS og indsamling af elueringsfraktioner, indtil der indsamles i alt 10 500 mikroliterfraktioner eller op til F9. Endelig, for at fjerne eventuelle prøverester, vaskes kolonnen med filtreret PBS mindst to gange, og derefter fortsætte med eksperimenter, som beskrevet i manuskriptet. Morfologisk analyse ved hjælp af transmission elektronmikroskopi viste, at HEK-293 exosomer var sfæriske strukturer lidt større end 100 nanometer.Dette resultat er enig i det fra nanopartikel tracking analysemåling, som også viste størrelsesfordelingen af exosomer. Desuden var de positive for exosomal markører CD81, CD9 og CD63. Den procentvise genvinding af exosomer, der blev renset ved hjælp af størrelsesudelukkekromatografi, og den procentvise genvinding af siRNA blev beregnet som beskrevet i manuskriptet.Gensøgning efter rensning af exosomer var 75 %Ved hjælp af siRNA-standardkurven, indkapslingseffektiviteten af siRNA i exosomer blev beregnet til at være ca. 10 til 20% Flow cytometri kvalitativ analyse af in vitro optagelse af exosomer fyldt med fluorescerende Atto655-siRNA viste, at PANC-1 celler behandlet med siRNA-indkapslet exosomer havde det største skift i fluorescens signal. Dette blev bekræftet af konstateringen af, at PANC-1 celler behandlet med siRNA-indkapslet exosomer registreret en højere procentdel af befolkningen positiv for Atto655 signalet i forhold til den, der behandles med losset exosomer og siRNA blanding. Cellulær optagelse af siRNA var også signifikant højere i PANC-1 celler behandlet med siRNA-indkapslet exosomer i forhold til den, der blev behandlet med exosom-siRNA blandingen, bekræfter, at siRNA-indkapslet eksosomer blev internaliseret af PANC-1 celler, og at de effektivt levere siRNA intraularært.Det er vigtigt at veje saccharose og deuteriumoxid meget præcist, når sucroseopløsningen tilberedes, og brug altid frisklavet saccharoseopløsning for at undgå tæthedsændringer under opbevaring. Konfokal mikroskopi kan udføres for yderligere at validere internaliseringen af siRNA indkapslet i exosomer i celler og studere dens intracellulære handel efter cellulær optagelse. Denne protokol giver os mulighed for at vurdere den genspecifikke knockdown af siRNA leveret af exosom og fungerer som et redskab til ny målvalidering i RNA-interferensbaseret kræftbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse af primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser af Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prækliniske musemodel af osteosarkom at definere den ekstracellulære vesikel-medieret kommunikation mellem Tumor og mesenkymale stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus levering af CRISPR Guides til Murine prostata for gen ændring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Genlevering til musebrystepitelceller gennem brystintraduktal injektion

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics analyse af TMEM200A som en pan-cancer biomarkør

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...