Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

פ Faruqu ש ממומן על ידי הסוכנות ממשלת מלזיה Rakyat Amanah המג'לס (מרה). Xu ל' הוא הנמען של מארי קירי Sklodowska בודדים המלגות (אופק 2020) (H2020-MSCA-אם-2016). קיי טי אל-ג'מל מאשר מימון BBSRC (BB/J008656/1) וטרסט (WT103913). המחברים גם רוצה תודה ד ר פול לבנדר, ד ר דוד פחד (המחלקה לרפואה נשימתית, אלרגיה, קולג '-לונדון קינגס) למתן את electroporator.

1. תא תרבות בבקבוקון ביוריאקטור
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig1.jpg"> איור 1: התרבות של תאים ביוריאקטור הבקבוק לייצור exosome. (א) פשוטה האנטומיה של הבקבוק ביוריאקטור. (B) התחלתי תרבות בתוך הבקבוק ביוריאקטור. ראה טבלה של חומרים ההרכב של נורמלי, מדולדל exosome בינוני קציר (C) ממוזגים בינוני (ס מ) ותחזוקה של תרבות הבקבוקון ביוריאקטור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>תרבות HEK-293 תאים נורמליים בינוני (ראה טבלה של חומרים; 5% CO2, 37 ° C) ולהרחיב אותם לתוך מבחנות x T75 4 (עד 90% confluent).</li>
	<li>הרטב את הקרום + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור על-ידי הוספת 50-100 מ ל בינונית רגילה בתוך המאגר בינוני + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור.</li>
	<li>לאסוף את כל התאים HEK-293 מ 4 x T75 ו resuspend אותם תוך 15 מ"ל של מדיום מדולדל exosome (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף התליה תא HEK-293 תא התא + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור באמצעות מזרק 20 מ"ל מחובר מילוי בוטה מחט (ראה טבלה של חומרים), עם טיפול להסרת כל בועה זה אולי יצרו.</li>
	<li>למלא מאגר בינוני הבקבוק ביוריאקטור בינונית רגילה כדי 500 מ"ל ולשמור הבקבוקון בחממה (5% CO2, 37 ° C) במשך שבוע.</li>
</ol>2. ממוזגים בינוני (ס מ) קציר מן הבקבוק ביוריאקטור
<ol><li>אחרי שבוע 1, למחוק את כל אמצעי בתוך המאגר בינוני + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור.</li>
	<li>להסיר כל המדיום בתא תא (קרי, ס מ) בעזרת מזרק 20 מ"ל מחובר מחט מילוי בוטה.</li>
	<li>להוסיף 50-100 מ ל בינונית רגילה המאגר בינוני.</li>
	<li>להוסיף 15 מ"ל של מדיום מדולדל exosome תא תא על-ידי הסרת המדיום הישן והוספת טרי בינוני מדולדל exosome באמצעות מזרק 20 מ"ל מחובר מחט מילוי בוטה.</li>
	<li>למלא מאגר בינוני הבקבוק ביוריאקטור בינונית רגילה כדי 500 מ"ל ולשמור הבקבוקון בחממה (5% CO2, 37 ° C) לשבוע נוסף. הערה: ניתן המשיך את התרבות במשך יותר משנה. עבור שלב 2.2, ס מ הקציר הראשון לא ישמש exosome בידוד, נמחקת. כדי להפוך את 2nd הקציר עוקבות, ס מ נשמרת exosome בידוד.</li>
</ol>3. Exosome בידוד על גבי כרית סוכרוז
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig2.jpg"> איור 2: בידוד ואפיון של exosomes. (א) ניקוי קדם שנקטפו ממוזגים בינוני (ס מ) של תאים מתים ופסולת תאים. (B) בידוד exosomes מ ס מ על גבי כרית סוכרוז. (ג) שטיפת צעד כדי להסיר סוכרוז וחלבונים משחיתה. Exosomes מבודד (D) היו אז נתון אפיון physicochemical, ביוכימי, מורפולוגיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>מראש נקה את ס מ (מתוך שלב 2.2) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית ולסינון כדלקמן.<ol>
<li>צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור חדש ולבטל את גלולה. חזור על פעולה זו צנטריפוגה פעם נוספת, מחלים את תגובת שיקוע ומחיקת בגדר.</li>
		<li>Centrifuge את תגובת שיקוע מהשלב 3.1.1 ב g 2,000 x עבור 15 דקות ו- 4 ° C ולאחר מכן למחוק גלולה. לסנן פעם supernatant התאושש דרך מסננים מיקרומטר 0.22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במהלך פינוי מראש, הכינו 25% סוכרוז (w/w) פתרון דאוטריום תחמוצת על-ידי במדויק שוקל 1.9 גרם (± 0.001 g) של סוכרוז בשפופרת אוניברסלי ולאחר מכן מצטייד עם תחמוצת דאוטריום עד המשקל מגיע 7.6 g (± 0.001 g).</li>
	<li>למלא בהם את ultracentrifuge צינור (ראה טבלה של חומרים) עם 22.5 מ של מאושר מראש ס"מ. לפצות ס"מ 22.5 מ עם 0.22 מיקרומטר-מסוננים PBS אם אמצעי האחסון הנוכחי הוא פחות מזה.</li>
	<li>המקום כוס פיפטה (ראה טבלה של חומרים) בצינור, דרך זה, להוסיף 3 מ"ל של סוכרוז פתרון כך הפתרון יוצרת שכבה נפרדת מתחת ס מ.</li>
	<li>בזהירות המקום שפופרת המכילה שכבות ס"מ/סוכרוז פתרון לתוך הדלי של הרוטור והזזה (ראה טבלה של חומרים), ולאבטח את הדלי אל הרוטור.</li>
	<li>למקם את הרוטור ultracentrifuge (ראה טבלה של חומרים) ו ספין-g x 100,000 עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף 2 מ"ל של השכבה סוכרוז, להוסיף את זה לרשימת בקבוק ultracentrifuge (ראה טבלה של חומרים) המכיל 20 מ של סינון PBS צעד כביסה.</li>
	<li>למקם את הצינורות רוטור זווית קבועה (ראה טבלה של חומרים) ו ספין-g x 100,000 עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית 10 מ ל, resuspend בגדר עם 400 PBS µL מסוננים. שמור את המניה exosome 4 ° C או-80 מעלות לאחסון לטווח הקצר ולטווח הארוך בהתאמה.</li>
</ol>4. אפיון Exosome גודל ואת התשואה על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ)
<ol><li>לעשות 1:1, 000-1:50, 000 דילולים של המניה exosome בכרך 1 מ"ל (מינימום µL 750) כדי להשיג 20-80 חלקיקים במסגרת צפייה נ מכשיר. התצוגה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להזריק את המניה exosome מדולל החדרה נ מכשיר מדגם באמצעות מזרק 1 מ"ל, ויש את הגשוש טמפרטורה של מד חום לתוך הים רגש טמפרטורה.</li>
	<li>להגדיר את התוכנה נ (ראה טבלה של חומרים) להקלטת כדלקמן: 3 מידות סטנדרטיות, 30 s לכל, אפשרות טמפרטורה ידני לא מסומן; והזינו את הגורם לדילול תחת הכרטיסייה מתקדם .</li>
	<li>קבע את רמת המצלמה 13, להריץ את הסקריפט לכידה על תוכנת נ, הזרקת חבילה חדשה מדגם והזנת את טמפרטורת החדר לדוגמה כאשר תתבקש לעשות זאת לאחר קריאת כל.</li>
	<li>מוגדר הסף 4 לחלק לא חשפה ורשום את גודל מודאלי הממוצע ואת ריכוז החלקיקים של המניה exosome מן המדידות.</li>
</ol>5. אפיון Exosome טוהר על ידי קביעת יחס של חלקיקים: חלבון
<ol><li>מדד תכולת החלבון של המניה exosome על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay קיט (ראה טבלה של חומרים) כדלקמן.<ol>
<li>להכין מוגדרת על ידי סטנדרטים.
		<ol>
<li>להכין את רמת הריכוז הגבוה ביותר (500 µg/mL) על-ידי הוספת µL 45 של BSA פתרון מניות (2 מ"ג/מ"ל – המסופק בערכה assay) צינור microcentrifuge, ולהפוך אותו µL עד 180 עם PBS.</li>
			<li>למלא 8 צינורות microcentrifuge µL 90 ל- PBS.</li>
			<li>להפוך דילולים טורי (פקטור: 0.5) על-ידי לקיחת 90 µL סטנדרטי BSA הגבוהה והוספת זה לתוך microcentrifuge 1סנט צינור עם PBS (mix היטב), ואז לוקח 90 µL מהצינור הזה מוסיף אותו לתוך הצינור microcentrifuge 2nd .</li>
			<li>חזור על זה עד הצינור microcentrifuge השביעית. הצינור ה-8 יהיה רק PBS (קרי, הריק: 0 µg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכן את דגימות exosome על ידי דילול 1:2 של דגימות עם PBS ב הנפח הכולל של 90 µL (45 µL מדגם, µL 45 ל- PBS).</li>
		<li>הכינו את BCA עובד ריאגנט מיקס.<ol>
<li>לחשב את הנפח הכולל של BCA עובד ריאגנט צריך לערבב (50 µL לכל טוב, שבו כפילויות, לרבות תקני).</li>
			<li>לערבב את ריאגנטים BCA בודדים לפי היחס הבא: ריאגנט 25 חלקים ריאגנט ת 24 חלקים ריאגנט ב': 1 חלק ג</li>
		</ol>
</li>
		<li>לבצע את assay וניתוח.<ol>
<li>להוסיף 40 µL של כל מדגם רגיל ו exosome המוכן מעל לבאר של צלחת 96-ובכן (כפילות לכל תקן או לדוגמה). הערה: מאז זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים, טכניקה נכונה pipetting חיוני להשגת תוצאות מדויקות. פיפטות שינוי לאחר הוספת כל שכפול תקן/מדגם לתוך כל הבארות</li>
			<li>הוסף µL 50 של וזמינותו חלבון עובד ריאגנט לערבב כל טוב, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: כדי למזער את הסטיות בין משכפל, להוסיף חלבון assay עבודה הכימית שכפול 1סט של מדגם/תקן, ואחריו של שכפול 2nd של התקן/המדגם זהה, לפני הוספתם 1סנט שכפול של מדגם אחר/תקן.</li>
			<li>למדוד את ספיגת במלון-562 ננומטר על הקורא צלחת (ראה טבלה של חומרים).</li>
			<li>להתוות עקומה סטנדרטיים מתוך הערכים ספיגת בסטנדרטים גבוהים, ולעבוד על ריכוז חלבון בכל מדגם באמצעות המשוואה של העקומה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את היחס של חלקיקים: חלבון על-ידי חלוקת התשואה exosome שהושג קודם לכן עם ריכוז חלבון של המניה exosome נמדד לעיל.</li>
</ol>6. אפיון Exosomal סמן ביטוי על-ידי Cytometry זרימה
<ol><li>תקופת דגירה 40 µL של exosomes (חלקיקים11 ≥1x10/mL) עם µL 10 של חרוזים לייטקס אלדהיד/סולפט (מדולל של מניות) של 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>להוסיף 5 µL בפתרון BSA 100 מיקרומטר (ראה טבלה של חומרים) לתערובת exosome-חרוז לריכוז סופי של 10 מ מ, תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, תקופת דגירה של 75 דקות-RT צינור microcentrifuge עם עצבנות קלה על מטרף נדנדה (~ 150 סל ד).</li>
	<li>Centrifuge את המתלים ב g x 580 למשך 5 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר עם 1 מ"ל של פתרון גליצין 100 מ מ (ראה טבלה של חומרים) דגירה למשך 30 דקות ב- RT.</li>
	<li>Centrifuge המתלה למשך 5 דקות ב- g 580 x. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 1 מ"ל של 3% FBS/PBS (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>חזור על שלב זה כביסה ו resuspend בגדר ב 350 µL של 3% FBS/PBS.</li>
	<li>לחלק את המתלים צינורות 7, שכל אחד מהם מכיל 50 µL של השעיה, דגירה אותם עם fluorophore מצומדת anti-CD81, נוגדנים anti-CD9 ו- anti-CD63 ופקדים isotype שלהם המתאים (1:10 דילול), בהתאמה, למשך 45 דקות ב 4 º C. שמור 1 של הצינורות פקד מוכתם אלא שעברו עיבוד אותו.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 3% FBS/PBS לכל צינור, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g 580 x ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר עם 200-400 µL של 3% FBS/PBS ולנתח את הדגימה על cytometer זרימת (ראה טבלה של חומרים) תחת הערוצים המקובלים.</li>
</ol>7. אפיון של מורפולוגיה Exosome על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
<ol><li>לתקן את exosome דיספרסיות מימית בריכוזים נאותה כגון 1010 p/mL בתיקון פתרון (ראה טבלה של חומרים) למשך 15 דקות.</li>
	<li>המקום הדגימות על 300 mesh פחמן מצופה נחושת רשתות ולהשאיר לאוויר יבש.</li>
	<li>שלילית מכתים את הדגימות עם 0.22 מיקרומטר-מסוננים uranyl מימית אצטט (ראה טבלה של חומרים) במשך 4 דקות ואחריו שני 50% מתנול/H2O לשטוף (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>האוויר יבש המדגם.</li>
	<li>לצפות את הדגימות תחת TEM (ראה טבלה של חומרים). הגדר את המתח מאיץ 80 kV ואת גודל ספוט-2. השתמש צמצם אובייקטיבית עם כל הדגימות.</li>
</ol>8. siRNA כימוס לתוך Exosomes על ידי אלקטרופורציה
<ol><li>מראש להרגיע את cuvette אלקטרופורציה (ראה טבלה של חומרים) על קרח למשך 30 דקות לפני אלקטרופורציה.</li>
	<li>מיקס 7.0 µg של exosomes (32 µL של 7 x 1012 p/mL במלאי ב- PBS) עם µg 0.33 של siRNA (12 µL מניות 2 מיקרומטר במים נטולי RNase) בצינור microcentrifuge. לבצע את עוצמת הקול µL 150 עם מאגר חומצה ציטרית (ראה טבלה של חומרים). Exosome יחס טוחנת siRNA הוא יצירת במקרה זה.</li>
	<li>להעביר את התערובת אלקטרופורציה cuvette. קאפ cuvette את ולמקם אותו האוחז cuvette electroporator (ראה טבלה של חומרים). סובב את גלגל מפנה 180° בכיוון השעון. הערה: ההגה יש להפעיל לחלוטין למצב נעול, על מנת cuvette ליצור קשר עם האלקטרודות.</li>
	<li>בחר את התוכנית אלקטרופורציה הרצוי (למשל, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, וכו) ולהתחיל אלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן התחל . הערה: דופק מוצלחת מסומן על-ידי הצגת "אישור" על התצוגה.</li>
	<li>פעם אחת electroporated, להסיר את cuvette לאחר דרך חזרה את הגלגל 180° נגד כיוון השעון. למשוך את הדגימה cuvette עם פיפטה פלסטיק עיבוד נוסף.</li>
</ol>9. הסרת siRNA חינם באמצעות גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות)
<ol><li>Equilibrate בעמודה שניה (2.9 ס"מ [H] x 1.3 ס מ [W]; ראה טבלה של חומרים) ע י העברת מ 3.5 ל- PBS מסוננים פעמיים.</li>
	<li>להמיס μL 150 של מדגם electroporated μL 350 ל- PBS מסוננים, להעביר את זה לעמודה שניה כדי לבצע את ההסרה siRNA חינם.</li>
	<li>לאסוף את השבר הראשון 500 μL זה eluted מן העמודה (F0).</li>
	<li>להוסיף 500 μL ל- PBS המסונן אל העמודה ולאסוף את השבר הבא 500 μL (F1).</li>
	<li>חזור על השלב הנ ל עד סך של 10 x 500 שברים μL (עד F9) נאסף. F1, F2 צריך להכיל את exosomes אנקפסולציה siRNA.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם PBS מסוננים (פעמיים, לפחות) כדי להסיר את כל שאריות הדגימה.</li>
</ol>10. ספיגת במבחנה של siRNA טעונים Exosomes לתאי PANC-1
<ol><li>הזרע התאים PANC-1 ב- 24-ובכן שטוח התחתונה צלחות (ראה טבלה של חומרים)-צפיפות של תאים 50,000 לכל טוב 24 שעןת לפני תפיסה ללמוד, דגירה התאים בחממה (5% CO2, 37 ° C).</li>
	<li>Exosomes Electroporate HEK-293 (7.0 μg) עם Atto655-siRNA (0.33 μg) לפי שלב 8.</li>
	<li>לטהר electroporated exosome לפי שלב 9 , resuspend ב μL 100 ל- PBS.</li>
	<li>להוסיף 50 μL של exosomes electroporated לתא PANC-1, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 4 שעות.</li>
	<li>איסוף תאים לאחר דגירה.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, resuspend ב μL 200 ל- PBS סיבוב פוליסטירן-בתחתית צינור (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לנתח את התאים על ידי זרימת cytometer (ראה טבלה של חומרים) עם 10,000 אירועים רכשה עבור דגימה. הערה: האו ם-electroporated exosome-siRNA תערובת דגימות והתאים לא מטופל עם PBS מסוננים שימשו כפקדים.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

השגת תשואה סבירה exosome של תאים בתרבית, אשר מספיקים בשביל כמה סבבים של לימודי חוץ גופית בתוך או ויוו , הוא עדיין אתגר. לדברי היצרן, המבחנות ביוריאקטור נועדו לייצור נוגדנים וחלבונים עם תשואה גבוהה מתרבות של שורות תאים מונצחים שונים. דבר זה מאפשר לתאים ללא הרף להעשיר את המדיום תרבות עם המוצר הרצוי, והתוצאה היא מדיום ממוזגים מרוכז (ס מ) בתוך התא-התא. באופן תיאורטי, אותו הקונספט יהיה מועיל בייצור exosome של שורות תאים שונים, אכן culturing תאים אלה בתוך המבחנות ביוריאקטור הודגם להגדיל משמעותית את התשואה exosome40. המאגר בינוני גדול ברציפות אספקת חומרי הזנה ומסירה פסולת של התא לתא דרך קרום חדיר למחצה 10 kDa, ומאפשר תרבות ממושך ללא צורך כמויות גדולות של בינוני עם התאים, או רגיל מבחנות משתנה, אשר יכול בסופו של דבר להציל את העלות הכוללת ועבודה של ייצור גבוהה-סולם exosome40. גם הוכח כי המורפולוגיה, פנוטיפ, כמו גם את הפונקציות immunomodulatory של exosomes מבודדים תאים לטווח ארוך ביוריאקטור מבחנות שהתרבויות דומה לזה הטרייה תאים תרבותי ב רגיל 75 ס מ2 מבחנות40. תרבות של שורות תאים מונצחים אחרים כמקורות exosome בתוך הבקבוק ביוריאקטור יעזור לכן להגדיל את התשואה שלהם exosome תוך שמירה על תקינות ותפקוד שלהם. צורה זו של תרבות היא אולם לא ישים על ראשי תאים עם מחזורי חלוקה מוגבל, ואלה זה לא יכול להיות תרבותי בצפיפות גבוהה.
כיוון הקציר ס מ מתבצע אחת לשבוע, התאים בתרבות מעולם לא היו passaged, ניתן להניח כי התאים הבקבוקון ביוריאקטור לא צומחות ב טפט כמו התרבות התא הרגיל. הם ככל הנראה בצורת אשכולות עם נמק מרכזי, או פשוט ניתוק מן השטח למות אם התאים נמצאים גם confluent עבור טפט. בדיקה ויזואלית של התא לתא + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור אינה אפשרית לאשר הנחה זו, אבל הוא בא לידי ביטוי מספר גדול של תאים מתים שהתקבל במהלך מהקצירה ס מ. הסרת רגיל לקוי חסיד ותאי כלכלית מן הבקבוק ביוריאקטור יכול למנוע הצטברות של חומרים על קרום חדיר למחצה, אשר עלולה להשפיע לרעה על חילופי גז, חומרים מזינים, פסולת בין התא לתא את המדיום מאגר המים, ובכך מאפשר התרבות ממושך המבחנות ביוריאקטור עבור > 6 חודשים40. בהקשר זה, זה שאינו קבוע של גידול תאים של המבחנות ביוריאקטור הוא אידיאלי כפי אנו לשער כי היא מחקה את המצב האמיתי של הגידול בצמיחה ויוו באופן הדוק יותר התרבות תאים חד שכבתי המקובלת, יש לקוות כי exosomes הופק על ידי הסרטן בתאים הבקבוקון ביוריאקטור יהיה יותר דומה לזה מופרש על ידי גידולים בתוך vivo. זה יהיה מועיל במיוחד במחקרים בודקים התפקיד של גידול, נגזר exosomes בהתקדמות של הפתולוגיה הגידול. Exosomes נגזר הגידול דווח ממהותם, מעדיפים הביתה לרקמות שלהם של מקור32, לכן יש exosomes המיוצר במערכת מחקה שלהם ויוו הייצור גם יהיה רצוי במחקרים מסתכל חקר את היכולת מיקוד פסיבי של exosomes סמים nanocarriers.
היחס P:P דווח כפרמטר כדי להעריך את טוהר exosomes מבודדים ובלחות חלבונים של המדיום תרבות של נוזלים פיזיולוגיים שממנו היו exosomes הטרייה41. היחס P:P של 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg שהושגו במחקר זה נופל בתוך הטווח טוהר גבוהה המוצע במחקר. יחס זה מדגיש את הסכנה של שימוש ריכוז חלבון כדי לבטא את התשואה או מנה של exosomes מבודדים או שימוש במחקרים במורד הזרם בהתאמה, כמו זה אינו משקף את כמות exosomes זמין במדגם נתון בבעיה של חלבון האמיתי זיהום במהלך בידוד. נ באמצעות כלים כגון NanoSight, אשר מודד את ריכוז exosomes מבחינת מספר החלקיקים, היא דרך הגיונית יותר ומדויק לכמת exosomes.
שקילה ומדויקים במהלך הכנת הפתרון סוכרוז 25% תחמוצת דאוטריום חיוני כמו בשיטה זו הוא בידוד מבוסס-צפיפות. Exosomes יש מגוון צר של הנפקה צפיפות תמיסת סוכרוז כך מדויק הכנת כרית סוכרוז תפחית זיהום של הלא-exosomal שלפוחית כגון גופים אפופטוטיים להיפגע או שלפוחית גולג'י-derived במהלך בידוד42. מומלץ לא לשמור סוכרוז שאריות פתרון ולהשתמש בו גם לאחר יום אחד כדי למנוע סיכון של גורמים יכול לשנות את צפיפות כגון אובדן או תוספת של מים הפתרון על ידי אידוי או עיבוי של האוויר בצינור. שימוש של הרוטור והזזה חיוני גם במהלך צנטריפוגה על גבי כרית סוכרוז לאפשר העברה גם של exosomes מ ס הפתרון סוכרוז.
נסיגה של סוכרוז פתרון פוסט-צנטריפוגה הוא גם צעד עדין, זה כולל מציאת פשרה בין למקסם את כמות exosomes המשוחזר, ואני לא יותר מדי כי חלבון מאמצעי התרבות היא הציגה את הדגימה exosome מופנמים . הממשק בין הפתרון סוכרוז המדיום התנאי הוא שבו חלבונים של המדיום תרבות אוספים שלאחר צנטריפוגה, בדרך כלל ניתן לראות טבעת חום כהה, שיושב על הממשק. בידיים שלנו, מהאמנה 2 מ של כרית סוכרוז mL 3 הראשונית הוסיף הוא אמצעי האחסון האופטימלית מסכימה עם הפשרה שהוזכרו לעיל. אמצעי האחסון שמתואר פרוטוקול זה מיועדות הרוטורים מסוימים להשתמש; לכן, מומלץ כדי למטב את עוצמת הקול של סוכרוז כדי להיות מסוגר בעת שינוי קנה המידה למעלה או למטה את אמצעי האחסון עבור הסוגים של הרוטורים זמין במתקנים שונים. זה חשוב גם למנוע את הזכות אזור במרכז התחתון של הצינור בעת נסיגה של סוכרוז, כמו זה היא היכן חלקיקים של צפיפות גבוהה יותר מאשר סוכרוז המשקע יכול בדרך כלל ניתן לראות על גלולה תפר חוט רקמה אופווייט.
הצעד כביסה עם כמות יחסית גדולה של PBS מסייעת לצמצם עוד יותר את מידת חלבון זיהום במהלך exosome בידוד41. שלב זה חיוני גם הסרת עודפי סוכרוז exosomes כדי למנוע נזק osmotic exosomes עצמם או את מולקולות בתוך לומן exosomal, כמו גם להפחית את הסיכון של גידול חיידקי או פטרייתי במלאי exosome. מכינים את הפתרון סוכרוז ב דאוטריום תחמוצת יותר מאשר מים מסייעת להפחית את כמות סוכרוז צריך להשיג את הצפיפות הנפקה exosome לבידוד, ומכאן לצמצם את הסיכון של נזק osmotic והן זיהום מיקרוביאלי. לאחר צנטריפוגה הראשון על גבי כרית סוכרוז, המכיל exosome שכבה סוכרוז מסוגר ויצורפו לאיש, טוב, מגניב ניתן לאחסן ב 4 ° C ולעבד למחרת אם מתמודד עם אילוצי זמן.
לפי מיטב ידיעתנו, היחס טוחנת exosome/siRNA הוא גורם חשוב בקביעת יעילות אלקטרופורציה. ב פרוטוקול זה, השתמשנו יצירת כמו exosome יחס טוחנת siRNA. כפי היכולת כימוס של סוגים שונים של exosomes שונים, אנו ממליצים מאוד כדי להיות מותאם על בסיס מקרה לגופו. עם זאת, היעילות כימוס המוצע במסמך זה תמיד יכול להיות פרמטר עבור בחירת התנאים אלקטרופורציה אופטימלית.
בנוסף, צבירה של siRNA הוא האמין להיות אחד של הבעיה הנפוצה ביותר באלקטרופורציה. הוכח שאלקטרופורציה הזה יכול לגרום צבירה חזקה של siRNA, עושה את זה אפילו יותר קשה להיכנס exosomes. הצטברויות של siRNA מפורשים לעתים קרובות בטעות כפי ומגעים siRNA לפקדי ולכן ראוי exosome השתמשו במחקר זה כמו היווצרות של אגרגטים siRNA בלתי נמנע במהלך אלקטרופורציה28. כימוס אחוז יעילות שיטת טיהור שלנו מחושב באמצעות ערכים מנורמל כדי למזער את ההשפעה ממקורות אחרים, כגון רקע רעש, exosome ו- siRNA מצבורים שזה ישפיע על אמינות הנתונים. בהתבסס על הממצאים שלנו, היו מצבורים siRNA זניח שנצפתה על הבקרה מדגם קרי, באמצעות electroporated ו un-electroporated siRNA.
פרוטוקול זה הוכיח בהצלחה ומגעים siRNA לתוך exosomes, את הפנייה תאיים עוקבות של siRNA סרטן תאים בתוך חוץ גופית. לכן, סוגים שונים של exosomes של שורות תאים שונים יכול להיות מבודדת, מאופיין באמצעות פרוטוקול המוצעת ואת לאחר מכן עמוסה siRNA טיפוליים שונים עבור סוגים שונים של מטרות oncogenic ביטוי יתר סוגי סרטן שונים. יישום מעניין יהיה לחקור את משלוח siRNA ויעילות ספיגת באמצעות הגלגולים השונים של exosome מקור-יעד תא זוג חוץ גופית בתוך. זה אז יכול להיות מתורגם מודלים בבעלי חיים כדי להעריך את היעילות של הן את המשלוח ויעילות טיפולית אנקפסולציה siRNA exosomes ויוו.

Exosomes תת סוג של שלפוחית חוץ-תאית (EV) הנע בין 50-200 ננומטר בקוטר, מופרש על ידי סוגי תאים שונים כגון תאים חיסוניים1,2, סרטן בתאי3,4,5, 6 7תאי גזע. Exosomes יש גם הוכח להיות נוכח10,9,8,נוזלים פיזיולוגיים שונים11. השילוב של יכולת מובנית של exosomes נושאים שונים מולקולות (למשל, RNA וחלבונים)12,13,14 ומסירה יעיל של מולקולות אלה לתוך תאים הנמען 15 , 16 , 17 להתעניינות של הפוטנציאל שלהם כמו וקטורים משלוח סמים בקנה מידה ננו. מולקולות קטנות שונות לשמש נגד סרטן ותרופות אנטי דלקתיות הפגינו שיש לטעון בהצלחה לתוך exosomes, ונמסר היעד תאים18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. מעניין, חומצות גרעין כגון siRNA28,29 ו- microRNA30 יש גם בהצלחה נטענת לתוך exosomes ויה אלקטרופורציה, מועברת לתאי המטרה.
לאחרונה, ה-RNA הפרעה (RNAi) דרך קטן מפריעות RNA (siRNA) צברה יותר עניין כמנגנון המועדפת ב ג'ין להחרשת עקב ירידה לפרטים גבוה שלה, אפקט חזק, תופעות לוואי מינימליות וקלות של siRNA סינתזה28, 29. siRNAs הם מולקולות RNA גדילי זוגית ועד 19 נוקלאוטידים 25 אורך זה נוקאאוט mRNA מפעילים קטליטי רצף ספציפי. בשל משקל מולקולרי גדול שלה polyanionic הטבע, ספיגת פסיבי של siRNA עירום לתוך התאים הוא הפריע28,29. . זה גם לא אפשרי עבור siRNA עירום להיות מוזרק למחזור הדם מערכתית עקב להשפלה מהירה על ידי פלזמה nucleases31 לפיכך, ומגעים siRNA ב nanocarrier הסיוע יעילה של ספיגת של siRNA לתוך תאי היעד.
Exosomes הם מערכת אידיאלית לצורך כימוס siRNA המבנה שלו מורכבת גרעין חלול, מימית עטוף בקליפה bilayer פוספוליפיד. Exosomes לא רק יש יציבות טובה בדם, אך יש גם מאפיינים מיקוד טבעי כדי לספק RNA פונקציונלי לתוך תאים32. המחקר שנערך על ידי. אלוורז-Erviti et al. בהצלחה הפגינו יעיל מסירת siRNA אל מוחותיהם של עכברים באמצעות הנדסה לאחור exosomes עם כמעט אין סיבוכים31. זה זה שיערו כי טיפול המבוסס על exosome הוא בטוח יחסית יותר טיפולים אחרים כמו exosomes אינם משתכפלים endogenously תאים היה, לכן לא נספח מאפייני גרורתי15.
שיטות שונות דווחו לבודד בהצלחה exosomes תרבית תאים או נוזלים פיזיולוגיים. השיטה הפופולרית ביותר משתמש ultracentrifugation כדי הצניפה exosomes מן ההתחלה גשמי31,32,33. שיטה זו יכולה להיות די קשה על exosomes, בדרך כלל חלבונים פוחת משקעים שיתוף מדגם. שילוב ultracentrifugation עם הפרדה המבוססת על צפיפות כגון מעברי צבע סוכרוז הופכת שכיחה יותר, כדי לצמצם זיהום חלבון לבין הלא-exosomal ב-19,exosomes מבודדים34. גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) מאפשר הפרדה בין exosomes של סוגים אחרים של שלפוחית חוץ-תאית (EV) על-ידי גודל ואני יכול גם לגרום לזיהום חלבון מינימלית אבל הוא מוגבל על ידי כמות קטנה של חומר זה יכול לעבד35, החל 36. לכידת Immunoaffinity משתמשת חרוזים מצופה נוגדנים לאגד exosomal פני שטח חלבונים כגון tetraspanins או הסמן השני התא הספציפי המאפשר ללכוד ספציפיות של exosomes יותר מאשר EVs או חלבונים אחרים, כמו גם לבודד את אוכלוסיית תתי exosomes של כל דגימות, אבל שוב הוא מוגבל על ידי כמות החל חומר והוא יקר36,37. מבוסס פולימר משקעים של exosomes נהגה להיות פופולרי מדי, אבל מאז זה משקעים גולמי למדי, זה מוביל גבוה שאינו exosomal שלפוחית וחלבון זיהום38,39.
אלקטרופורציה דווח על שלה יעילות כשיטה לטעון exosomes עם siRNA עקב חלבון צבירת15,28,31. גישות מבוססות-תקנים היו הפגינו שיהיה כדאי להעמיס חלבון יציבות ויעילות, אבל הוא לא רצויים בשל שלה רעילות תופעות לוואי של תרביות תאים סוכנים של שינוי בביטוי גנים הסלולר28. לפיכך, אלקטרופורציה כבר יותר בשימוש נרחב ב siRNA loading exosomes כמו זו שיטה בטוחה יותר. עם זאת, שיטת אופטימיזציה כימוס צריך להיות הוקמה על מנת לספק כמות מספקת של siRNA לאתר היעד עבור נוקאאוט גנטי חזק.
כאן, אנו מציעים פרוטוקול בידוד exosome משתמש המבוסס על צפיפות ultracentrifugation על גבי פשוט בודד 25% (w/w) סוכרוז כרית המבושלות דאוטריום תחמוצת, במקום הדרגתי צפיפות סוכרוז. זוהי שיטה חסכונית זה עוקף ההכנה הדרגתיות צפיפות מפרך, מאפשרת עיבוד של כמויות גדולות של החומר מתחיל, אולם התוצאה exosomes שלם של תשואה גבוהה וטוהר מתאים לטעינה הבאים עם siRNA. פלורסנט Atto655 מצומדת שאינם ספציפיים siRNA נטען לתוך הכליה עובריים אנושיים תאים (תאים HEK-293) נגזר exosomes ויה אלקטרופורציה ומסר לתאי סרטן אדנוקרצינומה בלבלב האנושי (PANC-1) אין ויטרו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

שלפוחית חוץ-תאית, ב- exosomes מסוים, לאחרונה השיגו עניין כמו סמים הרומן משלוח וקטורים עקב שלהם ממקור ביולוגי, שפע, ויכולת מהותי במשלוח המערכת של מולקולות שונות. עבודה זו מבססת פרוטוקול בידוד כדי להשיג תשואה גבוהה ועל טוהר גבוהה של exosomes למסירה siRNA. תאי הכליה עובריים אנושיים (תאים HEK-293) מתורבתים ב ביוריאקטור מבחנות וקצרו התרבות supernatant (המכונה לכאן בזמן שנסעתי בינוני ממוזגים) היא על בסיס שבועי כדי לאפשר העשרת HEK-293 exosomes. המדיום ממוזגים (ס מ) אינה מסומנת מראש של תאים מתים ופסולת התאית על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, הוא נתון ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז ואחריו צעד כביסה, כדי לאסוף את exosomes. מבודדים HEK-293 exosomes מאופיינים לביטוי סמן התשואה, מורפולוגיה, exosomal על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק, כימות חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים cytometry זרימה, בהתאמה. RNA קטנים מפריעות (siRNA), המסומנת fluorescently Atto655, נטען exosomes על ידי אלקטרופורציה, עודף siRNA יוסר על ידי סינון ג'ל. ספיגת תאים בתאי סרטן PANC-1, לאחר דגירה 24 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, אושר על ידי cytometry זרימה. HEK-293 exosomes הם nm 107.0 ± 8.2 בקוטר. יחס יחס (P:P) exosome תשואה של חלקיקים-כדי-חלבון הם ב- 6.99 ± 0.22 × 1012 חלקיקים/mL ו חלקיקים10 ± 8.3 1.7 × 10/µg, בהתאמה. היעילות כימוס של siRNA ב exosomes הוא ~ 10-20%. 40% של התאים מראים אותות חיוביים עבור Atto655 ב 24 שעות שלאחר הדגירה. לסיכום, בידוד exosome על ידי ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז מציע שילוב של התשואה טוב וטוהר. siRNA היתה אפשרות לטעון בהצלחה לתוך exosomes על ידי אלקטרופורציה ונשלח לאחר מכן לתוך תאים סרטניים במבחנה. פרוטוקול זה מציע נוהל סטנדרטי של פיתוח שנטענו siRNA exosomes למסירה יעיל תאים סרטניים.

אפיון physicochemical exosomes מבודדים מתאי HEK-293 (Exo HEK-293) מסוכמים בטבלה1. גודל נמדד באמצעות ננו-חלקיק מעקב כלי ניתוח (נ) היה 107.0 ± 8.2 ננומטר. Exosome התשואה מתאי HEK-293, גם נותחה באמצעות הכלי נ, היתה ב- 6.99 ± 0.22 x 1012 p/mL מ מ ל ~ 24 ס מ (המתקבל 2 סיבובים של קציר). טוהר Exo HEK-293 מוערך על ידי חישוב היחס חלקיקים-כדי-חלבון (P:P) היה 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg.
התפלגות גודל Exo HEK-293 מבודד מוצג באיור 3 א. ניתוח מורפולוגי שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הראה את מסכות HEK-293 היו מבנים כדוריים מעט מעל 100 ננומטר בגודלם (איור 3B). תוצאה זו מסכים עם זה מן המידה נ (איור 3 א). Exo HEK-293 מבודד היו חיוביות CD81, CD9, CD63, אשר הם סמנים הקנוני המשמש לזיהוי שלפוחית כמו exosomes (איור 3C).
עבור טיהור של exosomes באמצעות גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (איור 4), התאוששות אחוז של exosomes מחושב על ידי חלוקת מספר החלקיקים exosome הכולל התאוששה 10 השברים נאספים (F0-F9) עם exosome הראשוני מספר החלקיקים בשימוש, בזמן התאוששות אחוז של siRNA מחושב על ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל המתקבל F3, F4 F5 עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל המתקבל שברים 10 כל הנאספים. השחזור של exosome ושל siRNA פוסט-טיהור מחושב כמו 75.0% ו 80.4%, בהתאמה. היעילות כימוס של siRNA ב exosomes היה ~ 10-20%, מחושב באמצעות siRNA סטנדרטי העקומה נוסדה (איור 4C).
ניתוח איכותי של ספיגת במבחנה של exosomes טעון עם Atto655-siRNA פלורסנט מאת cytometry זרימה הראה כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA טלקוה משמרת הגדול אות קרינה פלואורסצנטית (איור 5A) . PANC-1 תאים שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA נרשם אחוז גבוה מאוכלוסיית חיובי עבור Atto655 האות (39.4%) לעומת זאת שטופלו לפרוק exosomes siRNA תערובת (0.56%), אשר לאשר התצפית מעל ( איור 5B). מידת ספיגת הסלולר של siRNA (המבוטא ההבדל קיפול ערכי העוצמה (MFI) זריחה מרושע מזה של תאים שלא טופלו) נצפתה גם להיות גבוה משמעותית בתאים PANC-1 שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA (MFI קיפול ההבדל = 5.1) בהשוואה שטיפל עם התערובת exosome-siRNA (MFI מקפלים ההבדל = 1.1) (איור 5C). תצפיות אלה הפגינו exosomes אנקפסולציה siRNA הופנמו על ידי תאים PANC-1 ומסר כי הם ביעילות את siRNA intracellularly.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> איור 3: הביוכימי וניתוח מורפולוגיה של HEK-293 exosomes. (א) גודל חלוקת HEK-293 exosomes באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ). העקומה הצגת היסטוגרמה-גבי 3 שונים לכידות במרווח s 30 אזורים אדומים שמשמעו סטיית תקן בין מדידות (n = 3). (B) הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תמונות של נאיבי HEK-293 exosomes. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. (ג) גילוי של סמנים exosomal CD81, CD9, CD63 באמצעות cytometry זרימה על HEK-293 exosomes. Exosomes היו מצמידים אלדהיד/סולפט חרוזים לייטקס לפני זיהוי. מתחם Exosome-חרוזים היו לאחר מכן מוכתמות נוגדנים anti-CD81, אנטי-CD9 ו- anti-CD63 fluorophore מצומדת. מידת ביטוי סמני מבוטא ההבדל קיפול ערכי העוצמה (MFI) זריחה החציוני מזו של הפקד (מתחם exosome-חרוזים מוכתם את isotype המתאים). הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> איור 4: Exosome טיהור פוסט-אלקטרופורציה. (א) • תנאי פרופילים (F0-F9) של exosomes Atto655-siRNA ו electroporated באמצעות גודל אי-הכללה של chormatography. ניתוח (B) נ Atto655-siRNA והן exosome של F0 כדי F9 באמצעות גודל אי-הכללה של chormatography. (ג) הכיול. עיקול Atto655 מתויג siRNA. עוצמות קרינה פלואורסצנטית התקבלו על-ידי קורא צלחת-Ex / Em: 640-10/680 ננומטר; רווח 2800. הערכים מבוטאים אומר ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> איור 5: קליטת סלולר אנקפסולציה siRNA exosomes לתאי PANC-1-4 h (א) היסטוגרמות השוואת הסלולר קליטת exosomes לפרוק + תערובת siRNA ו exosomes אנקפסולציה siRNA. השוואה (B) של ספיגת של exosomes לפרוק + תערובת siRNA ב 4 שעות על ידי מגרש מדומה. (ג) ההבדל קיפול אומר קרינה פלואורסצנטית (MFI) ערכי העוצמה של הדגימות שנבדקו לעומת זו של תאים שלא טופלו. הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3. P < 0.001. NS: לא משמעותי. חד-כיווני אנובה שימש לשם ניתוח סטטיסטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exosome</td>
			<td>גודל1, 2 (אן אם)</td>
			<td>תשואה1,2,3 (p/mL)</td>
			<td>[חלבון] 2, 4 (µg/mL)</td>
			<td>יחס חלקיקים-כדי-חלבון (P:P)5 (p/µg)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-293</td>
			<td>107.0 ± 8.2</td>
			<td>ב- 6.99 ± 0.22 x 1012
</td>
			<td>84.3 ± 9.8</td>
			<td>8.3 ± 1.7 x 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 . מדוד באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח (כלי נ) 2 הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3 3 התשואה שהושגה על-ידי תאים ממוזגים בינוני איחדו מ 2 סיבובים של קציר מ ביוריאקטור מבחנות (~ 24 מ"ל) 4 מדוד באמצעות ערכת assay חלבון 5 הערך שהושג באמצעות נוסחה: P:P יחס = תשואה / [חלבון]</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: אפיון Physicochemical של exosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Exosome הוא דור חדש של ספקיות שירות משלוח סמים. הקמנו פרוטוקול בידוד exosome עם תשואה גבוהה וטוהר למסירה siRNA. אנו גם אנקפסולציה siRNA שאינם ספציפיים שכותרתה fluorescently לתוך exosomes, חקר את ספיגת הסלולר של siRNA טעונים exosomes בתאים סרטניים.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

קצירת מדיום מותנה מועשר אקסוזום מתאים מתורבתים בבקבוקים bioreactor ובידוד על ידי כרית סוכרוז ultracentrifugation לגרום הכנה exosome של תשואה גבוהה עם חלבונים מזהמים מינימליים או וריסקים שאינם אקסוזומליים. שימוש כרית סוכרוז אחת מוכן תחמוצת דיטריום עוקף את ההכנה מייגעת של שיפוע סוכרוז רציפה ומפחית את כמות סוכרוז הדרוש כדי להשיג את הצפיפות הנדרשת. אספקה יעילה במבחנה של siRNA אנקפסולציה אקסוזומים שהוכנו בפרוטוקול זה מדגיש את הפוטנציאל של מערכת זו כטיפול חדש מבוסס הפרעה RNA הדור לסרטן הלבלב.ראשית, תרבות HEK-293 תאים במדיום רגיל, כמתואר בכתב היד. הרחב את התאים לארבעה בקבוקונים T75, וגדל עד שהם מגיעים 90% confluency. כדי להכין בקבוק bioreactor, להוסיף 50 עד 100 מיליליטר של מדיום נורמלי לתוך המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor להרטיב את הממברנה.לאסוף את כל התאים HEK-293 מארבעת flasks T75, ו resuspend אותם 15 מיליליטר של מדיום דל שומן בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמש במזרק 20 מיליליטר המחובר למחט מילוי קהה כדי להוסיף בזהירות את מתלי התא לתא התא של בקבוק bioreactor. לאחר מכן, למלא את המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor עם המדיום הרגיל, עד 500 מיליליטר, ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 במשך שבוע.לאחר שבוע של דגירה, להסיר את כל המדיום מהמאגר הבינוני של בקבוק bioreactor על ידי לשפוך אותו החוצה. באמצעות מזרק 20 מיליליטר מחובר מחט מילוי קהה, להסיר את כל המדיום מתא התא. לאחר מכן, להוסיף 50 עד 100 מיליליטר של בינוני רגיל למאגר בינוני ו 15 מיליליטר של מדיום דל אקסואזום טרי לתא התא באמצעות מזרק 20 מיליליטר מחובר מחט מילוי קהה.לאחר מכן, למלא את המאגר הבינוני של בקבוק bioreactor עם בינוני נורמלי עד 500 מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לשבוע נוסף. כדי לנקות מראש את המדיום המותנה שנאסף, צנטריפוגה אותו ב 500 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש, ומשליכים את גלולת הכדור. לאחר שחזר על שלב צנטריפוגה זה עם על טבעי התאושש, לשחזר את העל טבעי שוב להשליך את גלולה. לאחר מכן, צנטריפוגה העל-טבעית התאוששה במהירות של 2,000 פעמים למשך 15 דקות וארבע מעלות צלזיוס.שמור על העל-טבעי, והשליך את גלולת הכדור. סנן את העל-טבעי פעם אחת דרך מסנן 22 מיקרומטר המחובר למזרק של 20 מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה טרי. בינתיים, כדי להכין פתרון סוכרוז 25% תחמוצת דיטריום, במדויק לשקול 1.9 גרם של סוכרוז בצינור אוניברסלי.לאחר מכן, מוסיפים תחמוצת דיטריום עד שהמשקל מגיע ל -7.6 גרם. לאחר מכן, מלא צינור אולטרהצנטריפוגה עם 22.5 מיליליטר של מדיום ממוזג טרום פינה. מניחים פיפטה זכוכית בצינור.הוסף שלושה מיליליטר של פתרון סוכרוז דרך פיפטה, כך הפתרון יוצר שכבה נפרדת מתחת למדיום מותנה. בזהירות למקם את הצינור המכיל פתרון בינוני מותנה בשכבות / סוכרוז לתוך הדלי של רוטור מתנדנד החוצה. אבטח את הדלי לתוך הרוטור.מניחים את הרוטור לתוך אולטרהצנטריפוגה, ולסובב ב 100, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. לאסוף שני מיליליטר של שכבת סוכרוז מן הצינור, אחד מיליליטר בכל פעם באמצעות פיפטה P1000, עם קצה שלה מחובר קצה 10 מיקרוליטר, ולהוסיף אותו בקבוק אולטרהצנטריפוגה המכיל 20 מיליליטר של PBS מסונן לכביסה. מניחים את הצינור לתוך רוטור בזווית קבועה, וצנטריפוגה אותו ב 100, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.השתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להסיר בזהירות את supernatant. תן שימוש חוזר לכדור עם 400 מיקרוליטרים של PBS מסונן. לפני תחילת האלקטרופוריה, מצננים מראש את ה-cuvette של האלקטרופולציה על הקרח למשך 30 דקות.מערבבים שבעה מיקרוגרם של אקסוזומים עם 33 מיקרוגרם של siRNA בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף מאגר חומצת לימון כדי להשיג נפח של 150 microliters. מוסיפים את תערובת האקסוזום-siRNA לקרט האלקטרופורציה באמצעות פיפטה מפלסטיק, ומכסים את ה- cuvette.מניחים את ה- cuvette בכיוון הנכון במחזיק ה- cuvette של האלקטרופורטור, ומסובבים את הגלגל המסתובב של האלקטרופורטור ב- 180 מעלות בכיוון השעון. בחר את התוכנית הרצויה ולחץ על לחצן התחל כדי להפעיל אלקטרופוזיה. הצג יצביע על דופק מוצלח.לאחר מכן, להחזיר את הגלגל 180 מעלות נגד כיוון השעון, ולהסיר את cuvette. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להסיר את המדגם מן cuvette לתוך צינור microcentrifuge חדש. יש לשמור את הצינור על הקרח או במקרר לפני עיבוד נוסף, אם לא נעשה בו שימוש מיידי.כדי להתחיל הסרת siRNA חינם, לעבור 3.5 מיליליטר של PBS מסונן דרך עמודת כרומטוגרפיה אי הכללת גודל פעמיים כדי לצייד אותו. לאחר מכן, להמיס 150 microliters של מדגם אלקטרופולד ב 350 microliters של PBS מסונן, ולהעביר אותו לעמודה SEC. אסוף את שבר ה-500 מיקרוליטר הראשון שחמק מהעמודה לצינור מיקרו-פוגה, וסמן אותו כ-F0. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS מסונן לעמודה.אסוף את השבר הבא וסמן אותו כ- F1. חזור על הוספת PBS ואיסוף שברי אלוטיון עד סך של 10 שברים 500 מיקרוליטר, או עד F9, נאסף. לבסוף, כדי להסיר שאריות מדגם, לשטוף את העמודה עם PBS מסונן לפחות פעמיים, ולאחר מכן להמשיך עם ניסויים, כמתואר בכתב היד. ניתוח מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור הראה כי אקסוזומים HEK-293 היו מבנים כדוריים מעט גדול יותר מ 100 ננומטר.תוצאה זו מסכימה עם זה מדידת ניתוח מעקב חלקיקים, אשר הראה גם את התפלגות הגודל של exosomes. יתר על כן, הם היו חיוביים עבור סמנים אקסוזומליים CD81, CD9, ו CD63. אחוז השחזור של אקסוזומים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ואחוז השחזור של siRNA חושבו כמתואר בכתב היד.ההתאוששות שלאחר הטיהור של אקסוסום הייתה 75% באמצעות העקומה הסטנדרטית siRNA, יעילות אנקפסולציה של siRNA באקסוזומים חושבה להיות על 10 כדי 20%זרימה ניתוח איכותי cytometry של ספיגת במבחנה של אקסוזומים טעון עם Atto655-siRNA פלואורסצנטי הראה כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes siRNA-אנקפסולציה היה השינוי הגדול ביותר באות פלואורסצנטי. זה אושר על ידי הממצא כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes encapsulated siRNA רשם אחוז גבוה יותר של אוכלוסייה חיובית עבור אות Atto655 לעומת זה שטופלו exosomes לא טעון ותערובת siRNA. ספיגת הסלולר של siRNA היה גם גבוה באופן משמעותי בתאי PANC-1 שטופלו exosomes encapsulated siRNA בהשוואה לזה שטופלו בתערובת exosome-siRNA, המאשר כי exosomes encapsulated siRNA הופנמו על ידי תאי PANC-1, כי הם מספקים ביעילות את siRNA תאית.חשוב לשקול את תחמוצת סוכרוז ו deuterium במדויק מאוד בעת הכנת פתרון סוכרוז, ותמיד להשתמש בתותח סוכרוז מוכן טרי כדי למנוע שינוי צפיפות במהלך האחסון. מיקרוסקופ קונפוקלי יכול להתבצע כדי לאמת עוד יותר את ההפנמה של siRNA אנקפסולציה exosomes לתאים וללמוד סחר תאי שלה בעקבות ספיגת הסלולר. פרוטוקול זה מאפשר לנו להעריך את ההפלה הספציפית לגנים של siRNA המועברת על ידי exosome ומשמש ככלי לאימות יעד חדש בטיפול בסרטן מבוסס הפרעות RNA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

תכנות מחדש של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב לפלוריפוטנציה

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...