Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

एफ एन Faruqu मलेशियाई सरकारी एजेंसी मजलिस Amanah Rakyat (मारा) द्वारा वित्त पोषित है । एल Xu Marie Sklodowska के एक प्राप्तकर्ता है-क्यूरी व्यक्तिगत फैलोशिप (क्षितिज २०२०) (H2020-MSCA-अगर-२०१६) । के. टी. अल जमाल ने BBSRC (BB/J008656/1) और वेलकम ट्रस्ट (WT103913) से फंडिंग स्वीकार की । लेखक भी dr पॉल लैवेंडर और डॉ डेविड डर (श्वसन चिकित्सा और एलर्जी, राजा कॉलेज लंदन के विभाग) electroporator प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Exosomes extracellular बुलबुले के एक उपप्रकार (EV) व्यास में 50-200 एनएम से लेकर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं1,2, कैंसर कोशिकाओं3,4,5 के रूप में विभिंन प्रकार के सेल द्वारा स्रावित कर रहे हैं, 6 और स्टेम सेल7। Exosomes भी विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में उपस्थित होने के लिए दिखाया गया है8,9,10,11. exosomes की अंतर्निहित क्षमता के संयोजन के लिए विभिंन अणुओं (जैसे, आरएनए और प्रोटीन)12,13,14 और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में इन अणुओं के प्रभावी वितरण ले जाने के लिए 15 , 16 , 17 नैनो पैमाने पर दवा वितरण वैक्टर के रूप में अपनी क्षमता के लिए ब्याज आकर्षित किया । विभिंन छोटे अणुओं है कि विरोधी के रूप में सेवा कैंसर और विरोधी भड़काऊ दवाओं के लिए सफलतापूर्वक exosomes में भरी हुई है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया18,19,20, प्रदर्शन किया गया है 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. दिलचस्प है, सिरना28,29 और microRNA30 के रूप में न्यूक्लिक एसिड भी सफलतापूर्वक electroporation के माध्यम से exosomes में लोड किया गया है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया ।
हाल ही में, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) के माध्यम से अपनी उच्च विशिष्टता के कारण जीन मुंह बंद करने में पसंदीदा तंत्र के रूप में अधिक रुचि प्राप्त की है, शक्तिशाली प्रभाव, कम से अधिक दुष्प्रभाव और सिरना संश्लेषण28में आसानी, 29. siRNAs की लंबाई में 19 से 25 न्यूक्लियोटाइड है कि अनुक्रम-विशिष्ट उत्प्रेरक mRNA पछाड़ना ट्रिगर से लेकर डबल-असहाय आरएनए अणु हैं । अपने बड़े आणविक वजन और polyanionic प्रकृति के कारण, कोशिकाओं में नग्न सिरना के निष्क्रिय सालभर28,29बाधा है । यह भी संभव के लिए नग्न सिरना प्लाज्मा nucleases31द्वारा तेजी से क्षरण के कारण प्रणालीगत संचलन में इंजेक्ट किया जा करने के लिए नहीं है । इस प्रकार, एक nanocarrier में सिरना के encapsulation प्रभावी वितरण सहायता और लक्ष्य कोशिकाओं में सिरना के ले जाएगा ।
Exosomes सिरना encapsulation के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में अपनी संरचना एक खोखले, जलीय एक फॉस्फोलिपिड bilayer द्वारा ढंक कोर के शामिल है । Exosomes न केवल रक्त में अच्छी स्थिरता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं३२में कार्यात्मक आरएनए देने के लिए प्राकृतिक लक्ष्यीकरण गुण है । अल्वारेज़ द्वारा किए गए अध्ययन-Erviti एट अल. सफलतापूर्वक लगभग कोई जटिलताओं के साथ इंजीनियर exosomes का उपयोग कर चूहों के दिमाग को सिरना के प्रभावी वितरण का प्रदर्शन किया31. यह कल्पना की है कि exosome-आधारित चिकित्सा अपेक्षाकृत अंय चिकित्सा की तुलना में सुरक्षित है के रूप में exosomes नहीं दोहराने endogenously कोशिकाओं के रूप में होता है और इसलिए मेटास्टेटिक गुण प्रदर्शित नहीं15।
विभिंन तरीकों को सफलतापूर्वक या तो सेल संस्कृति या शारीरिक तरल पदार्थ से exosomes को अलग करने के लिए सूचित किया गया है । सबसे लोकप्रिय विधि शुरू सामग्री31,३२,३३से गोली exosomes को ultracentrifugation का उपयोग करता है । इस विधि exosomes पर काफी कठोर हो सकता है और आम तौर पर सह नमूना से प्रोटीन हाला । इस तरह के सुक्रोज ढाल के रूप में एक घनत्व आधारित जुदाई के साथ ultracentrifugation संयोजन अधिक आम होता जा रहा है, अलग exosomes19,३४में प्रोटीन और गैर exosomal संदूषण को कम करने के लिए । आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) extracellular बुलबुले के अंय प्रकार से exosomes के पृथक्करण (EV) आकार से अनुमति देता है और यह भी ंयूनतम प्रोटीन संदूषण में परिणाम कर सकते है लेकिन शुरू सामग्री यह३५प्रक्रिया कर सकते है की छोटी राशि से सीमित है, ३६. Immunoaffinity कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित मोती का उपयोग करता है कि इस तरह के tetraspanins या अंय सेल विशेष मार्कर कि exosomes के बजाय ईवीएस या अंय प्रोटीन के विशिष्ट कब्जा की अनुमति देता है के रूप में exosomal सतह प्रोटीन को बांध, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग उप जनसंख्या exosomes पूरे नमूनों से, लेकिन फिर से शुरू सामग्री की राशि से सीमित है और३६,३७महंगा है । exosomes के बहुलक आधारित वर्षण लोकप्रिय भी हुआ करते थे, लेकिन चूंकि यह एक जगह कच्चे तेल वर्षण है, यह एक उच्च गैर exosomal पुटिका और प्रोटीन संदूषण३८,३९की ओर जाता है ।
Electroporation प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण सिरना के साथ exosomes लोड करने के लिए एक विधि के रूप में अपनी अक्षमता के लिए सूचित किया गया है15,28,31. अभिकर्मक आधारित दृष्टिकोण बेहतर लदान दक्षता और प्रोटीन स्थिरता के लिए प्रदर्शन कर रहे थे, लेकिन अपनी विषाक्तता और अभिकर्मक एजेंटों के साइड इफेक्ट के कारण अवांछनीय सेलुलर जीन अभिव्यक्ति28फेरबदल में । इस प्रकार, electroporation गया है और अधिक व्यापक रूप से exosomes में सिरना लोडिंग में इस्तेमाल के रूप में यह एक सुरक्षित तरीका है । हालांकि, एक अनुकूलित encapsulation विधि के क्रम में एक शक्तिशाली जीन पछाड़ना के लिए लक्ष्य साइट के लिए सिरना की पर्याप्त मात्रा में वितरित करने के लिए स्थापित करने की जरूरत है ।
यहां, हम एक exosome अलगाव घनत्व का उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रस्ताव सिर्फ एक ही 25% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) सुक्रोज ड्यूटेरियम ऑक्साइड में तैयार तकिया, बजाय एक सुक्रोज घनत्व ढाल पर ultracentrifugation आधारित है । यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि श्रमसाध्य घनत्व ढाल तैयारी दरकिनार और सामग्री शुरू करने की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, अभी तक उच्च उपज और सिरना के साथ बाद में लदान के लिए उपयुक्त पवित्रता के बरकरार exosomes में परिणाम है । फ्लोरोसेंट Atto655-संयुग्मित गैर विशिष्ट सिरना मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में भरी हुई थी (HEK-२९३ कोशिकाओं) exosomes के माध्यम से electroporation व्युत्पंन और मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता को दिया (PANC-1) इन विट्रो में कैंसर की कोशिकाओं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

Extracellular बुलबुले, विशेष रूप से exosomes में, हाल ही में उपंयास दवा वितरण उनके जैविक मूल, बहुतायत, और विभिंन जैव अणुओं के सेलुलर प्रसव में आंतरिक क्षमता के कारण वैक्टर के रूप में ब्याज प्राप्त की है । यह काम सिरना डिलीवरी के लिए exosomes की उच्च उपज और उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए एक आइसोलेशन प्रोटोकॉल स्थापित करता है । मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३ कोशिकाओं) के लिए एक साप्ताहिक आधार पर काटा जाता है के लिए HEK-२९३ exosomes के संवर्धन के लिए अनुमति देने के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी और संस्कृति supernatant (वातानुकूलित माध्यम के रूप में संदर्भित hereon) में किया जाता है । वातानुकूलित मध्यम (सेमी) विभेदक केंद्रापसारक द्वारा मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के पूर्व मंजूरी दे दी है और एक सुक्रोज तकिया पर ultracentrifugation के अधीन है एक धुलाई कदम के बाद, exosomes इकट्ठा करने के लिए । पृथक HEK-२९३ exosomes क्रमशः nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण, प्रोटीन ठहराव, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry द्वारा उपज, आकृति विज्ञान और exosomal मार्कर अभिव्यक्ति के लिए विशेषता है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना), फ्लोरोसेंट Atto655 के साथ लेबल, electroporation द्वारा exosomes में भरी हुई है और अतिरिक्त सिरना जेल निस्पंदन द्वारा निकाल दिया जाता है । PANC में सेल तेज-1 कैंसर की कोशिकाओं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 ज मशीन के बाद, प्रवाह cytometry द्वारा की पुष्टि की है । HEK-२९३ exosomes व्यास में १०७.० ± ८.२ एनएम हैं । exosome उपज और कण करने के लिए प्रोटीन अनुपात (P:P) अनुपात ६.९९ ± ०.२२ × 1012 कण/एमएल और ८.३ ± १.७ × 1010 कण/µ जी, क्रमशः हैं । exosomes में सिरना के encapsulation दक्षता ~ 10-20% है । कोशिकाओं के ४० प्रतिशत 24 एच बाद में Atto655 के लिए सकारात्मक संकेत दिखा । अंत में, सुक्रोज कुशन पर ultracentrifugation द्वारा exosome अलगाव अच्छी उपज और पवित्रता का एक संयोजन प्रदान करता है । सिरना सफलतापूर्वक electroporation द्वारा exosomes में लोड किया जा सकता है और बाद में इन विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में दिया । यह प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं को कुशल प्रसव के लिए सिरना-लोडेड exosomes के विकास के लिए एक मानक प्रक्रिया प्रदान करता है ।

HEK-२९३ कोशिकाओं (HEK-२९३ Exo) से अलग exosomes के भौतिक लक्षण वर्णन तालिका 1में संक्षेप हैं । आकार nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) साधन का उपयोग कर मापा १०७.० ± ८.२ एनएम था । HEK-२९३ कोशिकाओं से Exosome उपज, भी ंत् साधन का उपयोग कर विश्लेषण किया, ६.९९ ± ०.२२ x 1012 पी/एमएल से ~ 24 मिलीलीटर (फसल के 2 दौर से प्राप्त) था । HEK की पवित्रता-२९३ Exo कण-से-प्रोटीन अनुपात (P:P) की गणना करके मूल्यांकन किया गया ८.३ ± १.७ × 1010 पी/µ जी ।
अलग HEK-२९३ Exo का आकार वितरण चित्र 3ए में दिखाया गया है । रूपात्मक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग कर विश्लेषण दिखाया HEK-२९३ Exo गोलाकार संरचनाओं थोड़ा आकार में १०० एनएम (चित्र बी)से ऊपर थे । इस परिणाम से सहमत है कि ंत् माप (3 ए आंकड़ा) से । अलग HEK-२९३ Exo CD81, CD9 और CD63, जो विहित मार्करों exosomes (चित्रा 3सी) के रूप में बुलबुले की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है के लिए सकारात्मक थे ।
exosomes के शुद्धिकरण के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 4) का उपयोग कर, exosomes की प्रतिशत वसूली कुल exosome कण संख्या में बरामद 10 अंश (F0-F9) प्रारंभिक exosome के साथ में विभाजित द्वारा गणना की गई थी कण संख्या का उपयोग किया है, जबकि सिरना की प्रतिशत वसूली कुल प्रतिदीप्ति सभी 10 अंश एकत्र से प्राप्त की तीव्रता के साथ F3, F4 और F5 से प्राप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके गणना की गई थी । exosome और सिरना पद-शुद्धिकरण की वसूली क्रमशः ७५.०% और ८०.४% की गणना की गई । exosomes में सिरना के encapsulation दक्षता ~ 10-20% था, सिरना मानक वक्र (चित्र 4c) की स्थापना का उपयोग कर की गणना की ।
में गुणात्मक विश्लेषण इन विट्रो exosomes के तेज फ्लोरोसेंट Atto655-सिरना प्रवाह cytometry के साथ भरी हुई है कि PANC-1 सिरना के साथ इलाज कोशिकाओं-encapsulated exosomes प्रतिदीप्ति संकेत में सबसे बड़ा बदलाव दर्ज (आंकड़ा 5 ए) . PANC-1 सिरना के साथ इलाज कोशिकाओं-encapsulated exosomes Atto655 संकेत के लिए सकारात्मक जनसंख्या का एक उच्च प्रतिशत दर्ज (३९.४%) उस के साथ इलाज की तुलना में उतारा exosomes और सिरना मिश्रण (०.५६%), जो ऊपर प्रेक्षण पुष्टि ( चित्रा 5B). सिरना की सेलुलर की डिग्री (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (mfi) में अंतर के रूप में व्यक्त की है कि अनुपचारित कोशिकाओं से मूल्यों) भी PANC में काफी अधिक है-1 सिरना-encapsulated exosomes के साथ इलाज किया कोशिकाओं (MFI गुना मनाया गया अंतर = ५.१) कि exosome-सिरना मिश्रण (MFI गुना अंतर = १.१) (चित्रा 5C) के साथ इलाज की तुलना में । इन टिप्पणियों का प्रदर्शन किया कि सिरना-encapsulated exosomes PANC-1 कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे और है कि वे प्रभावी ढंग से सिरना intracellularly दिया ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> चित्रा 3: जैव रसायन और HEK की आकृति विज्ञान विश्लेषण-२९३ exosomes । (A) आकार वितरण HEK-२९३ Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) का उपयोग exosomes । वक्र (n = 3) माप के बीच मानक विचलन को ध्यान में लाल क्षेत्रों के साथ 30 s अंतराल पर 3 अलग कब्जा से एक आरोपित हिस्टोग्राम दिखाता है । (ख) भोले HEK के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) की छवियाँ-२९३ exosomes. स्केल बार: १०० एनएम । (ग) exosomal मार्करों का पता लगाना CD81, CD9 और CD63 का उपयोग प्रवाह cytometry पर HEK-२९३ exosomes. Exosomes एल्डिहाइड/सल्फेट लेटेक्स मोती का पता लगाने से पहले युग्मित थे । Exosome-मोती परिसर बाद में fluorophore-संयुग्मित विरोधी CD81, विरोधी CD9 और विरोधी CD63 एंटीबॉडी के साथ दाग थे । मार्कर की अभिव्यक्ति की डिग्री माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) है कि नियंत्रण (exosome-मोती जटिल इसी isotype के साथ दाग) से मूल्यों में गुना अंतर के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । मान ± एसडी, जहां n = 3 मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> चित्रा 4: Exosome शुद्धि पद-electroporation । (क) Atto655-सिरना और electroporated exosomes का रेफरेंस प्रोफाइल (F0-F9) आकार बहिष्करण chormatography का उपयोग करना. (ख) दोनों Atto655 के ंत् विश्लेषण-सिरना और exosome F0 से F9 करने के लिए आकार अपवर्जन chormatography का उपयोग कर । (ग) Atto655 बला सिरना के अंशांकन वक्री । प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लेट रीडर द्वारा पूर्व में प्राप्त किया गया/640-10/680 एनएम; नफा २८००. मान मतलब ± एसडी (एन = 3) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> चित्रा 5: सिरना-encapsulated exosomes PANC-1 कोशिकाओं में 4 एच में सेलुलर के ऊपर ले । (क) exosomes + सिरना मिश्रण और सिरना-encapsulated exosomes के सेलुलर ऊपर की तुलना हिस्टोग्रामs । (ख) pseudocolor प्लाट द्वारा 4h पर उतारे गए exosomes + सिरना मिश्रण के ऊपर की तुलना में । (ग) का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) में अंतर अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में परीक्षण नमूनों के मूल्यों । मान ± एसडी, जहां n = 3 मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । P < ०.००१ । एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग किया गया । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exosome</td>
			<td>आकार1, 2 एनएम</td>
			<td>उपज1, 2, 3 (पी/एमएल)</td>
			<td>प्रोटीन 2, 4 (µ g/mL)</td>
			<td>कण-से-प्रोटीन (P:P) अनुपात5 (p/µ g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-२९३</td>
			<td>१०७.० ± ८.२</td>
			<td>६.९९ ± ०.२२ x 1012
</td>
			<td>८४.३ ± ९.८</td>
			<td>८.३ ± १.७ x 10 10 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग कर मापा (ंत् साधन) 2 मान मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, जहां n = 3 3 उपज सेल द्वारा प्राप्त किया गया था मध्यम-प्रतिक्रियात्मक कुप्पी से हार्वेस्टिंग के 2 दौर से परित (~ 24 एमएल) 4 एक प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मापा 5 सूत्र का उपयोग करके प्राप्त मूल्य: P:P अनुपात = उपज/</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: exosomes के भौतिक लक्षण वर्णन ।

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

कैंसर कोशिकाओं को सिरना डिलिवरी के लिए Exosomes की तैयारी

एक exosome दवा वितरण वाहक की एक नई पीढ़ी है । हम उच्च उपज और सिरना वितरण के लिए पवित्रता के साथ एक exosome अलगाव प्रोटोकॉल की स्थापना की । हम भी exosomes में गैर विशिष्ट सिरना लेबल की गई और कैंसर की कोशिकाओं में सिरना-भरी exosomes के सेलुलर के बारे में जांच की ।

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

बायोरिएक्टर फ्लास्क में सुसंस्कृत कोशिकाओं से एक्सोसोम-समृद्ध वातानुकूलित माध्यम की कटाई और सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेफगेशन द्वारा अलगाव के परिणामस्वरूप कम से कम दूषित प्रोटीन या गैर-एक्सोसोमल वेसिकल्स के साथ उच्च उपज की एक्सोसोम तैयारी होती है। ड्यूटेरियम ऑक्साइड में तैयार एक सुक्रोज कुशन का उपयोग करना एक असतत सुक्रोज ढाल की श्रमसाध्य तैयारी को दरकिनार करता है और आवश्यक घनत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक सुक्रोज की मात्रा को कम करता है। इस प्रोटोकॉल में तैयार किए गए एक्सोसोम्स में सिरना के विट्रो वितरण में प्रभावी अग्नाशय के कैंसर के लिए एक नई पीढ़ी आरएनए हस्तक्षेप आधारित चिकित्सा के रूप में इस प्रणाली की क्षमता पर प्रकाश डाला गया ।शुरू करने के लिए, संस्कृति HEK-293 कोशिकाओं सामान्य माध्यम में, के रूप में पांडुलिपि में वर्णित है. कोशिकाओं को चार T75 फ्लास्क में विस्तार करें, और तब तक बढ़ते हैं जब तक कि वे 90% तक नहीं पहुंच जाते। बायोरिएक्टर फ्लास्क तैयार करने के लिए, झिल्ली को गीला करने के लिए बायोरिएक्टर फ्लास्क के मध्यम जलाशय में सामान्य माध्यम के 50 से 100 मिलीलीटर जोड़ें।चार T75 फ्लास्क से सभी HEK-293 कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक्सोसोम-समाप्त माध्यम के 15 मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। फिर, बायोरिएक्टर फ्लास्क के सेल डिब्बे में इस सेल निलंबन को ध्यान से जोड़ने के लिए कुंद भरने वाली सुई से जुड़े 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। फिर, बायोरिएक्टर फ्लास्क के मध्यम जलाशय को सामान्य माध्यम से, 500 मिलीलीटर तक भरें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, एक सप्ताह के लिए 5% CO2 पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के एक सप्ताह के बाद बायोरिएक्टर फ्लास्क के मध्यम जलाशय से सभी माध्यम को बाहर डालकर निकाल लें। कुंद भरने वाली सुई से जुड़ी 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके, सेल डिब्बे से सभी माध्यम हटा दें। फिर, मध्यम जलाशय में सामान्य माध्यम के 50 से 100 मिलीलीटर और एक कुंद भरने सुई से जुड़े 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके सेल डिब्बे में ताजा एक्सोसोम-समाप्त माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें।इसके बाद बायोरिएक्टर फ्लास्क के मीडियम जलाशय को 500 मिलीलीटर तक सामान्य मीडियम से भरें। ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, एक और सप्ताह के लिए 5% CO2 । एकत्र किए गए वातानुकूलित माध्यम को पूर्व-साफ करने के लिए, इसे चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 500 बार जी पर अपकेंद्री करें।सुपरनैंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें, और गोली को त्याग दें। बरामद सुपरनेट के साथ इस अपकेंद्रित्र कदम को दोहराने के बाद, सुपरनेट को फिर से ठीक करें और गोली को त्याग दें। इसके बाद 15 मिनट और चार डिग्री सेल्सियस के लिए 2, 000 बार जी पर बरामद सुपरनेटेंट को सेंट्रलाइज करें ।सुपरनेट रखें, और गोली को त्याग दें। एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 20 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े एक 22 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से एक बार supernatant फिल्टर । इस बीच, ड्यूटेरियम ऑक्साइड में 25% सुक्रोज समाधान तैयार करने के लिए, एक सार्वभौमिक ट्यूब में 1.9 ग्राम सुक्रोज का सही वजन करें।फिर, वजन 7.6 ग्राम तक पहुंचने तक ड्यूटेरियम ऑक्साइड जोड़ें। फिर, पूर्व-स्वीकृत वातानुकूलित माध्यम के 22.5 मिलीलीटर के साथ एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब भरें। ट्यूब में एक ग्लास पिपेट रखें।पिपेट के माध्यम से सुक्रोज समाधान के तीन मिलीलीटर जोड़ें ताकि समाधान वातानुकूलित माध्यम के नीचे एक अलग परत बनाता है। ध्यान से एक स्विंग बाहर रोटर की बाल्टी में स्तरित वातानुकूलित मध्यम/सुक्रोज समाधान युक्त ट्यूब जगह है । रोटर में बाल्टी सुरक्षित।रोटर को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में रखें, और 1.5 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 100, 000 बार ग्राम पर स्पिन करें। ट्यूब से सुक्रोज परत के दो मिलीलीटर, एक समय में एक मिलीलीटर एक P1000 पिपेट का उपयोग करके, एक 10 माइक्रोलीटर टिप से जुड़ी अपनी नोक के साथ, और इसे धोने के लिए फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 20 मिलीलीटर वाली अल्ट्रासेंट्राइज बोतल में जोड़ें। ट्यूब को एक निश्चित कोण रोटर में रखें, और इसे 1.5 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 100, 000 बार ग्राम पर अपकेंद्री करें।सुपरनेट को ध्यान से हटाने के लिए 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। फ़िल्टर पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर के साथ गोली को फिर से र्ल्स करें। इलेक्ट्रोपाउशन शुरू करने से पहले, 30 मिनट के लिए बर्फ पर इलेक्ट्रोपॉरेशन क्यूवेट को प्री-चिल करें।माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 33 माइक्रोग्राम सिरना के साथ सात माइक्रोग्राम एक्सोसोम्स मिलाएं। 150 माइक्रोलीटर की मात्रा प्राप्त करने के लिए साइट्रिक एसिड बफर जोड़ें। प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके इलेक्ट्रोपॉरेशन क्यूवेट में एक्सोसोम-सिर्ना मिश्रण जोड़ें, और क्यूवेट को कैप करें।इलेक्ट्रोपोरेटर के क्यूवेट होल्डर में सही ओरिएंटेशन में क्यूवेट रखें, और इलेक्ट्रोपोरेटर के टर्निंग व्हील को 180 डिग्री दक्षिणावर्त घुमाएं। वांछित कार्यक्रम का चयन करें, और इलेक्ट्रोपॉरेशन शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं। प्रदर्शन एक सफल नाड़ी का संकेत देगा।फिर, पहिया 180 डिग्री पलटवार वापस करें, और क्यूवेट को हटा दें। एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में क्यूवेट से नमूना हटाने के लिए करें। ट्यूब को बर्फ पर या फ्रिज में आगे की प्रोसेसिंग से पहले रखें, अगर तुरंत इस्तेमाल न किया जाए ।मुफ्त सिरना हटाने शुरू करने के लिए, आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम के माध्यम से फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 3.5 मिलीलीटर को दो बार इसे बराबर करने के लिए पास करें। फिर, फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 350 माइक्रोलीटर में इलेक्ट्रोपेटेड नमूने के 150 माइक्रोलीटर को भंग करें, और इसे एसईसी कॉलम में स्थानांतरित करें। कॉलम से माइक्रोफ्यूज ट्यूब में पहले 500-माइक्रोलीटर अंश को इकट्ठा करें, और इसे एफ0 के रूप में चिह्नित करें। इसके बाद कॉलम में फिल्टर्ड पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर डालें।अगले अंश को इकट्ठा करें, और इसे F1 के रूप में चिह्नित करें। पीबीएस को जोड़ना दोहराएं और कुल 10 500-माइक्रोलीटर अंश, या F9 तक, एकत्र होने तक एल्यूशन अंशों को इकट्ठा करें। अंत में, किसी भी नमूना अवशेषों को हटाने के लिए, कम से कम दो बार फ़िल्टर किए गए पीबीएस के साथ कॉलम धोएं, और फिर पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों के साथ जारी रखें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक विश्लेषण से पता चला है कि एचईके-293 एक्सोसोम गोलाकार संरचनाएं 100 नैनोमीटर से थोड़ी बड़ी थीं।यह परिणाम नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण माप से सहमत है, जिसने एक्सोसोम्स के आकार के वितरण को भी दिखाया। इसके अलावा, वे एक्सोसोमल मार्कर सीडी 81, सीडी 9 और सीडी 63 के लिए सकारात्मक थे। आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध एक्सोसोम्स की प्रतिशत वसूली और सिरना की प्रतिशत वसूली की गणना पांडुलिपि में वर्णित के रूप में की गई थी ।एक्सोसोम की शुद्धि के बाद वसूली 75% सिरना मानक वक्र का उपयोग कर रही थी, एक्सोसोम्स में सिरना की एनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना फ्लोरोसेंट एट्टो655-सिरना से भरे एक्सोसोम्स के इन विट्रो तेज के लगभग 10 से 20% प्रवाह साइटोमेट्री गुणात्मक विश्लेषण के बारे में की गई थी-सिरना से भरे पैन-1 कोशिकाओं ने दिखाया कि सिरना-एनकैप्सुलेटेड एक्सोसोम्स के साथ इलाज की जाने वाली पैनी-1 कोशिकाओं में फ्लोरेस्केंस सिग्नल में सबसे बड़ा बदलाव था। यह निष्कर्ष है कि PANC-1 siRNA-encapsulated exosomes के साथ इलाज कोशिकाओं को उतारा exosomes और सिराना मिश्रण के साथ इलाज की तुलना में Atto655 संकेत के लिए जनसंख्या सकारात्मक का एक उच्च प्रतिशत दर्ज की गई द्वारा पुष्टि की थी । सिरना का सेलुलर तेज भी पैन-1 कोशिकाओं में काफी अधिक था जो एक्सोसोम-सिरना मिश्रण के साथ इलाज की तुलना में सिरना-एनकैप्सुलेटेड एक्सोसोम के साथ इलाज किया जाता है, इस बात की पुष्टि करता है कि सिरना-समझाया exosomes PANC-1 कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे और वे प्रभावी ढंग से सिराणा को इंट्रासेलरली वितरित करते हैं।सुक्रोज समाधान तैयार करते समय सुक्रोज और ड्यूटेरियम ऑक्साइड को बहुत सटीक रूप से तौलना महत्वपूर्ण है, और भंडारण के दौरान घनत्व परिवर्तन से बचने के लिए हमेशा ताजा तैयार सुक्रोज समाधान का उपयोग करें। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी को कोशिकाओं में एक्सोसोम्स में समझाया गया सिरना के आंतरिककरण को और मान्य करने और सेलुलर तेज के बाद इसके इंट्रासेलुलर तस्करी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल हमें एक्सोसोम द्वारा वितरित सिर्ना के जीन-विशिष्ट नॉकआउट का आकलन करने की अनुमति देता है और आरएनए हस्तक्षेप-आधारित कैंसर थेरेपी में नए लक्ष्य सत्यापन के लिए एक उपकरण के रूप में कार्य करता है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

केंद्रापसारक Elutriation द्वारा विभिंन कोशिका चक्र चरणों में प्राथमिक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं की तैयारी

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

ट्यूमर और Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के बीच Extracellular पुटिका-मध्यस्थता संचार को परिभाषित करने के लिए ऑस्टियो के एक नैदानिक माउस मॉडल

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

जीन परिवर्तन के लिए Murine प्रोस्टेट के लिए CRISPR गाइड के वायरस डिलिवरी

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

चूहों में रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर को पुन: उत्पन्न करता है

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

विवो में स्तन इंट्राडक्टल इंजेक्शन के माध्यम से माउस स्तन उपकला कोशिकाओं में जीन वितरण

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

पैन-कैंसर बायोमार्कर के रूप में TMEM200A का मल्टीओमिक्स विश्लेषण

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

प्लुरिपोटेंसी के लिए अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा को पुन: प्रोग्रामिंग करना

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines (Video) | JoVE 

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells (Video) | JoVE 

TMEM200A siRNA ट्रांसफ़ेक्ट पेट Adenocarcinoma कोशिकाओं में mRNA की मात्रा का ठहराव