Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

F. N. Faruqu er finansiert av den malaysiske regjering agency Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu er en mottaker av Marie Sklodowska-Curie individuelle stipend (horisonten 2020) (H2020-MSCA-hvis-2016). K. T. Al-Jamal erkjenner finansiering fra BBSRC (BB/J008656/1) og Wellcome Trust (WT103913). Forfatterne vil også gjerne takke Dr. Paul Lavender og Dr David Fear (Institutt for åndedretts indremedisin og allergi, King's College London) for å gi electroporator.

1. celle kultur i en Bioreactor kolbe
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig1.jpg"> Figur 1: kultur av celler i bioreactor kolbe for exosome produksjon. (A) forenklet anatomi av bioreactor kolbe. (B) starter kultur i bioreactor kolbe. Se Tabellen for materiale for sammensetningen av normal og exosome-utarmet middels (C) høsting betinget medium (CM) og vedlikehold av kultur i bioreactor kolbe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol><li>Kultur HEK-293 celler i normal medium (se Tabell av materialer; 5% CO2, 37 ° C) og utvide dem til 4 x T75 flasker (inntil 90% confluent).</li>
	<li>Våt membran av bioreactor kolbe ved å legge til 50-100 mL av normal medium medium reservoaret av bioreactor kolbe.</li>
	<li>Samle alle HEK-293 celler fra 4 x MT75 og resuspend dem i 15 mL av exosome-utarmet medium (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Legge til HEK-293 celle suspensjon celle rommet bioreactor flasken med en 20 mL sprøyte koblet til sløv fyll p (se Tabell for materiale), forsiktig fjerne alle boble som kan ha dannet.</li>
	<li>Fyll middels tanken av bioreactor kolbe med normal medium til 500 mL og holde flasken i inkubator (5% CO2, 37 ° C) for en uke.</li>
</ol>2. betinget Medium (CM) høsting fra Bioreactor kolbe
<ol><li>Etter 1 uke forkaste alle mediet i middels reservoaret av bioreactor kolbe.</li>
	<li>Fjerne alle mediet i cellen skuffen (dvs. de CM) en 20 mL sprøyte er koblet til en sløv fyll nål.</li>
	<li>Legge til 50-100 mL av normal medium medium reservoaret.</li>
	<li>Legge til 15 mL av exosome-utarmet medium celle rommet ved å fjerne den gamle mediet og legge fersk exosome-utarmet middels bruker en 20 mL sprøyte koblet til en sløv fyll nål.</li>
	<li>Fyll middels tanken av bioreactor kolbe med normal medium til 500 mL og holde flasken i inkubator (5% CO2, 37 ° C) i en uke. Merk: Kultur kan videreføres i mer enn et år. For trinn 2.2 CM fra den første avlingen brukes ikke for exosome isolasjon og forkastes. For 2nd og påfølgende harvest holdes CM exosome isolering.</li>
</ol>3. Exosome isolasjon på en sukrose pute
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig2.jpg"> Figur 2: isolering og karakterisering av exosomes. (A) før clearing høstet betinget medium (CM) fra døde celler og celle rusk. (B) isolere exosomes fra CM på sukrose pute. (C) vaske trinn for å fjerne sukrose og skadelige proteiner. (D) isolert exosomes ble deretter utsatt for mekanisk- og morfologiske og biokjemiske karakterisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol><li>Pre Fjern CM (fra trinn 2.2) av differensial sentrifugering og filtrering som følger.<ol>
<li>Sentrifuger på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Overføre nedbryting til en ny tube og kast pellet. Repeter dette sentrifugering igjen, gjenoppretter nedbryting og forkaster pellet.</li>
		<li>Sentrifuge nedbryting fra trinn 3.1.1 2000 x g for 15 min og 4 ° C, og deretter kaste pellets. Filtrere den gjenopprettede supernatant gang gjennom 0.22 µm filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Under pre clearing, forberede 25% (w/w) sucrose løsning i deuterium oksid ved nøyaktig vekt ut 1,9 g (± 0,001 g) av sukrose i en universell rør, og deretter samtidig med deuterium oksid til vekten når 7,6 g (± 0,001 g).</li>
	<li>Fyll opp en ultracentrifuge tube (se Tabell for materiale) med 22,5 mL av pre-ryddet cm utgjør CM til 22.5 mL med 0.22 µm-filtrert PBS Hvis volumet er mindre enn.</li>
	<li>Plasser et glass Pipetter (se Tabell for materiale) i røret, og gjennom det, legge 3 mL sucrose løsning slik at løsningen danner et eget lag under CM.</li>
	<li>Nøye sted rør som inneholder lagdelte CM/sucrose løsning til bøtte med en swing-out rotor (se Tabell for materiale), og sikre bøtte i rotoren.</li>
	<li>Plasser rotoren i ultracentrifuge (se Tabell for materiale) og spinn på 100.000 x g for 1,5 t på 4 ° C.</li>
	<li>Samle 2 mL av sukrose laget og legge dette til en ultracentrifuge flaske (se Tabell for materiale) som inneholder 20 mL filtrert PBS for en vask trinn.</li>
	<li>Plassere rør i en bestemt vinkel rotor (se Tabell for materiale) og spinn på 100.000 x g for 1,5 t på 4 ° C.</li>
	<li>Nøye fjerne nedbryting med en 10 mL serologisk pipette og resuspend pellets med 400 µL filtrert PBS. Hold dette exosome lager på 4 ° C eller-80 ° C for kortsiktig og langsiktig lagring henholdsvis.</li>
</ol>4. karakterisering av Exosome størrelse og kapasitet av hydrogenion sporing analyse (NTA)
<ol><li>Lag 1:1, 000-1:50, 000 fortynninger av exosome aksjer i 1 mL (minimum 750 µL) volum for 20-80 partikler i visning rammen av NTA instrument (se Tabell for materiale) skjerm.</li>
	<li>Injisere utvannet exosome aksjen i NTA instrument eksempel kammeret ved hjelp av en 1 mL sprøyte, og temperatur probe av et termometer inn temperatur sonde innløpet.</li>
	<li>Sette NTA programvare (se Tabell for materiale) for innspilling som følger: 3 standard mål, 30 s hver, manuell temperatur alternativet merket; og angi fortynningsfaktoren under kategorien Avansert .</li>
	<li>Angi kamera til 13 og kjøre skriptet fangst på NTA software, injisere en frisk bakst av prøve og skrive inn temperaturen på prøven kammeret når du blir spurt etter hver lesning.</li>
	<li>Angi terskelen til 4 for den påfølgende analyse-delen, og Merk gjennomsnittlig sperrende størrelse og partikkel konsentrasjon av exosome aksjer fra målinger.</li>
</ol>5. karakterisering av Exosome renhet av partikkel: Protein forholdet besluttsomhet
<ol><li>Mål proteininnholdet i exosome lager av en bicinchoninic syre (BCA) protein analysen kit (se Tabell for materiale) som følger.<ol>
<li>Forberede den definert standarder.
		<ol>
<li>Forberede standarden på den høyeste konsentrasjonen (500 µg/mL) ved å legge til 45 µL av BSA lagerløsning (2 mg/mL-i analysen kit) et microcentrifuge rør, og gjøre det opp til 180 µL med PBS.</li>
			<li>Fyll 8 microcentrifuge rør med 90 µL av PBS.</li>
			<li>Gjøre føljetong fortynninger (faktor: 0,5) ved å ta 90 µL fra høyeste BSA standard og legge dette til 1m microcentrifuge tube med PBS (bland godt), så tar 90 µL fra dette røret og legge det inn i 2nd microcentrifuge røret.</li>
			<li>Gjenta dette til 7 microcentrifuge røret. 8 røret blir bare PBS (dvs. tomt: 0 µg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forberede exosome prøver å 1:2 fortynning av prøver med PBS i et totalt volum på 90 µL (45 µL av prøven, 45 µL av PBS).</li>
		<li>Forberede BCA arbeider reagens blanding.<ol>
<li>Beregne det totale volumet av BCA arbeider reagens blanding nødvendig (50 µL per Vel, duplikater, inkludert standarder).</li>
			<li>Bland personlige BCA reagenser i henhold til følgende forholdet: 25 deler reagens A: 24 deler reagens B: 1 del reagens C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utføre analysen og analyse.<ol>
<li>Legge til 40 µL av hver standard og exosome prøve utarbeidet over i en godt av en 96-brønns plate (dubletter for hver standard og utvalg). Merk: Siden dette er en kolorimetrisk analysen, riktig pipettering teknikk er avgjørende for å oppnå nøyaktige resultater. Endre Pipetter etter hver standard/sample replikere i hver av</li>
			<li>Legg 50 µL av protein analysen arbeider reagens blanding i hver brønn, og ruge platen på 37 ° C i 30 min. Merk: For å minimere avvik mellom gjentak, legge protein analysen arbeider reagensen inn den 1st gjenskape en standard/sample, etterfulgt av 2nd replikere av samme utvalg/standard, før det legges til 1m replikere til en annen eksempel normer.</li>
			<li>Måle absorbans ved 562 nm på plate leseren (se Tabell for materiale).</li>
			<li>Tegne en standardkurve absorbansen verdier av standarder, og trene protein konsentrasjonen i hvert utvalg ved hjelp av formelen av kurven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne partikkel: protein forholdet ved å dele exosome avkastningen oppnådd tidligere med protein konsentrasjonen av exosome aksjen målt over.</li>
</ol>6. karakterisering av Exosomal markør uttrykk av flowcytometri
<ol><li>Inkuber 40 µL av exosomes (≥1x1011 partikler/mL) med 10 µL av aldehyd/sulfat latex perler (ufortynnet fra lager) i 15 min ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Legge til 5 µL av 100 µM BSA løsning (se Tabell of Materials) til exosome-perle blanding å oppnå en 10 mM endelige konsentrasjon og ruge i 15 min på RT.</li>
	<li>Legg 1 mL av PBS og ruge for 75 min på RT i et microcentrifuge rør med mild agitering på en rocking shaker (~ 150 rpm).</li>
	<li>Sentrifuge suspensjon 580 x g i 5 min på RT og kast nedbryting.</li>
	<li>Resuspend pellets med 1 mL 100 mM glysin (se Tabell for materiale) og Inkuber i 30 min på RT.</li>
	<li>Sentrifuge suspensjon i 5 min på 580 x g. Forkast nedbryting og resuspend pellets med 1 mL av 3% FBS/PBS (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Repeter dette vask og resuspend pellet i 350 µL av 3% FBS/PBS.</li>
	<li>Dele suspensjon i 7 rør, hver med 50 µL av suspensjon og Inkuber dem med fluorophore-konjugerte anti-CD81, anti-CD9 og anti-CD63 antistoffer og deres tilsvarende isotype kontroller (1:10 fortynning), henholdsvis for 45 min på 4 ° C. Holde 1 av rør som en unstained kvinne kontroll men gjennomgår den samme behandlingen.</li>
	<li>Legg 1 mL av 3% FBS/PBS hver rør, sentrifuge for 5 min 580 x g og forkaste nedbryting.</li>
	<li>Resuspend pellets med 200-400 µL av 3% FBS/PBS og analysere prøven på flyt cytometer (se Tabell for materiale) under de riktige kanalene.</li>
</ol>7. karakterisering av Exosome morfologi av overføring elektronmikroskop (TEM)
<ol><li>Fastsette exosome vandig dispersions i riktig konsentrasjoner som 1010 p/mL i innfesting løsning (se Tabell for materiale) i 15 min.</li>
	<li>Sted prøvene på 300 mesh karbon belagt kobber rutenett og la luften tørr.</li>
	<li>Negativt flekken prøvene med 0.22 µm-filtrert vandig uranyl acetate (se Tabell for materiale) for 4 min etterfulgt av to 50% metanol/T2O vask (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Luften tørr prøven.</li>
	<li>Se eksemplene under TEM (se Tabell for materiale). Sett akselererende spenningen på 80 kV og størrelsen på 2. Bruke objektive blenderåpning med alle prøvene.</li>
</ol>8. siRNA innkapsling i Exosomes av Electroporation
<ol><li>Pre chill electroporation cuvette (se Tabell for materiale) på isen i 30 min før electroporation.</li>
	<li>Mix 7.0 µg av exosomes (32 µL fra 7 x 1012 p/mL aksjer i PBS) med 0,33 µg av siRNA (12 µL fra 2 µM lager i RNase uten vann) i microcentrifuge røret. Gjøre opp til 150 µL med sitronsyre buffer (se Tabell for materiale). Exosome siRNA molar forhold er 1:60 i dette tilfellet.</li>
	<li>Overføre blandingen til electroporation cuvette. Cap cuvette og plassere den i cuvette innehaveren av electroporator (se Tabell for materiale). Rotere hjulet snu 180 grader med klokken. Merk: Hjulet må slås helt til låst posisjon, for at cuvette kontakte elektrodene.</li>
	<li>Velg ønsket electroporation programmet (f.eks X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) og starte electroporation ved å trykke Start -knappen. Merk: En vellykket puls angis av viser "OK" på displayet.</li>
	<li>En gang electroporated, fjerne cuvette etter vrir tilbake 180° mot urviseren. Ta prøven fra cuvette med plastikk pipe for videre behandling.</li>
</ol>9. fjerning av gratis siRNA bruke størrelse utelukkelse kromatografi (sek)
<ol><li>Equilibrate kolonnen sek (2.9 cm [H] x 1,3 cm [W] – se Tabellen for materiale) ved å sende 3,5 mL filtrerte PBS to ganger.</li>
	<li>Oppløse 150 μL av electroporated prøve i 350 μL filtrerte PBS og overføre dette til kolonnen SEC å utføre gratis siRNA fjerning.</li>
	<li>Samle de første 500 μL brøken som elut fra kolonnen (F0).</li>
	<li>Legge til 500 μL filtrerte PBS kolonnen og samle neste 500 μL brøken (F1).</li>
	<li>Gjenta trinnet ovenfor til totalt 10 x 500 μL brøker (opptil F9) samles. F1- og F2 bør inneholde siRNA-kapslet exosomes.</li>
	<li>Vask kolonnen med filtrerte PBS (to ganger, minst) å fjerne prøven rester.</li>
</ol>10. in Vitro opptak av siRNA lastet Exosomes i PANC-1 celler
<ol><li>Frø PANC-1 celler i 24-vel flat bunn plater (se Tabell for materiale) på en tetthet av 50 000 celler godt 24 timer før opptaket studere og ruge cellene i inkubator (5% CO2, 37 ° C).</li>
	<li>Electroporate HEK-293 exosomes (7.0 μg) med Atto655-siRNA (0,33 μg) per trinn 8.</li>
	<li>Rens electroporated exosome per Trinn 9 og resuspend i 100 μL PBS.</li>
	<li>Tilsett 50 μL av electroporated exosomes PANC-1-cellen og ruge på 37 ° C og 5% CO2 4 h.</li>
	<li>Samle celler etter inkubasjon.</li>
	<li>Vask cellene med 1 mL steril PBS og resuspend i 200 μL av PBS polystyren runde-nederst tube (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Analysere celler ved flyt cytometer (se Tabell for materiale) med 10.000 hendelser ervervet per prøve. Merk: FN-electroporated exosome-siRNA blanding prøvene og ubehandlet celler med filtrerte PBS ble brukt som kontroller.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Få en anstendig exosome avkastning fra kulturperler celler, er som er nok for flere runder i vitro eller i vivo studier, fortsatt en utfordring. Ifølge produsenten, var bioreactor kolber ment for produksjon av antistoffer og proteiner med høy kapasitet fra kultur av ulike udødeliggjort linjer. Dette gjør at cellene å kontinuerlig berike kultur medium med det ønskede produktet, noe som resulterer i en konsentrert betinget medium (CM) i celle-rommet. Teoretisk sett, det samme konseptet vil være nyttig exosome produksjon fra ulike linjer, og faktisk dyrking disse cellene i de bioreactor flasker ble demonstrert å betydelig øke exosome avkastning40. Store middels reservoaret kontinuerlig leverer næringsstoffer til og fjerner avfallsstoffer fra cellen rommet gjennom en 10 kDa halvt gjennomtrengelig membran, slik at langvarig kultur uten store mengder middels være i kontakt med cellene eller vanlige kolber endring, som til slutt kan lagre den totale kostnaden og arbeid av høy-skala exosome produksjon40. Det ble også demonstrert at morfologi, fenotype, samt immunmodulerende funksjoner exosomes isolert celler langsiktige bioreactor kolber kulturer er lik som fra celler kultivert i vanlig 75 cm2 flasker40. Kultur for andre udødeliggjort linjer som exosome kilder i bioreactor flasken vil derfor bidra til å øke deres exosome utbytte mens deres integritet og funksjon. Denne formen for kultur er imidlertid ikke gjelder primære celler med begrenset divisjon sykluser, og de som ikke kan kultivert i høy tetthet.
Siden av CM er gjort ukentlig, og cellene i kultur var aldri passaged, kan det antas at cellene i bioreactor kolbe ikke vokser i en monolayer som vanlig cellekultur. De er mest sannsynlig å danne klynger med nekrotisk sentre, eller bare koble fra overflaten og dø når cellene er for confluent for en monolayer. Visuell inspeksjon av cellen kupé av bioreactor kolbe er ikke mulig å bekrefte denne antakelsen, men gjenspeiles av det store antallet døde celler fikk under CM høsting. Vanlig fjerning av dårlig tilhenger og ikke-levedyktige celler fra bioreactor kolbe kan hindre oppbygging av materiale på den halvt gjennomtrengelig membranen som kan påvirke utveksling av gass, næringsstoffer og avfall mellom cellen rommet og medium reservoaret slik at langvarig kultur i bioreactor flasker for > 6 måneder40. I denne sammenheng, denne ikke-regularitet av cellevekst i bioreactor flasker er ideelt som vi spekulere at det etterligner den faktiske tilstanden til tumor vekst i vivo tettere enn konvensjonelle monolayer cellekultur, og håpet er at exosomes produsert av kreft celler i bioreactor kolbe ville være mer lik som skilles ut av svulster i vivo. Dette vil være spesielt nyttige i studier ser på rollen svulst-avledet exosomes i utviklingen av svulst patologi. Svulst-avledet exosomes har blitt rapportert til bunn og fortrinnsvis hjem til deres vev av opprinnelse32, derfor ha exosomes produsert i et system etterligne sine i vivo produksjon ville også være ønskelig i studier ser på utforske passiv målretting evne til exosomes som narkotika nanocarriers.
P:P forholdet ble rapportert som en parameter å vurdere renheten av isolerte exosomes fra forurensende proteiner fra kultur medium med fysiologiske væske som exosomes ble Hentet fra41. P:P forholdet mellom 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg innhentet i denne studien ligger innenfor høy renhetsgrad foreslått i studien. Dette forholdet understreker faren for å bruke protein konsentrasjon for å uttrykke kapasitet eller dose exosomes isolert eller brukes i nedstrøms studier, som dette ikke gjenspeiler den virkelige mengden av exosomes tilgjengelig i av prøven problemet protein forurensning under isolasjon. NTA via instrumenter som NanoSight, som måler konsentrasjonen av exosomes i partikkel tall, er en mer fornuftig og nøyaktig måte å kvantifisere exosomes.
Svært nøyaktig veiing under utarbeidelsen av 25% sukrose løsningen i deuterium oksid er avgjørende som denne metoden er en tetthet-baserte isolasjon. Exosomes har en ganske smal rekke flotasjon tetthet i sucrose løsning så nøyaktig utarbeidelse av sukrose puten vil redusere forurensning av ikke-exosomal blemmer som apoptotisk organer eller Golgi-avledet blemmer under isolasjon42. Det anbefales ikke å holde leftover sucrose løsning og bruke den selv etter en dag for å unngå risikoen for faktorer som kan endre tettheten som tap eller tilsetting av vann i løsningen av fordampning eller kondens luft i røret. Bruk av en swing-out rotoren er også avgjørende under sentrifugering på sukrose pute å tillate selv overføring av exosomes fra CM til sucrose løsning.
Uttak sucrose løsning etter sentrifugering er også et delikat skritt, og det innebærer å finne et kompromiss mellom maksimere mengden exosomes gjenopprettet, og ikke for mye at protein fra kultur medium er introdusert til exosome prøven trukket tilbake . Grensesnittet mellom sucrose løsning og tilstand medium er der proteiner fra kultur medium ville samle etter sentrifugering, og kan vanligvis sees som en mørk brun ring som sitter på grensesnittet. I våre hender er uttak 2 mL sukrose pute fra den første 3 mL lagt optimal volumet enig med kompromiss nevnt ovenfor. Volumer som er beskrevet i denne protokollen er for spesifikke rotorene brukes; Derfor anbefales det å optimalisere volumet av sukrose å trekkes ved skalering opp eller ned volumene for de rotorer tilgjengelig i forskjellige fasiliteter. Det er også viktig å unngå område rett i midten av bunnen av røret når uttak sukrose, da dette er der partikler av høyere tetthet enn sukrose sedimenter og kan vanligvis bli sett på som et off-white pellets.
Vask trinnet med en relativt stor mengde PBS bidrar til å redusere graden av protein forurensning under exosome isolasjon41. Dette trinnet er også viktig å fjerne overflødig sukrose fra exosomes for å unngå osmotisk skade exosomes seg selv eller biomolecules i exosomal-lumen, i tillegg til å redusere risikoen for bakteriell og/eller sopp vekst i exosome lager. Forbereder sukrose løsningen i deuterium oksid i stedet for vann bidrar til å redusere mengden av sukrose måtte oppnå exosome flotasjon tettheten for isolering, dermed redusere risikoen for både osmotisk skade og mikrobiell forurensning. Etter den første sentrifugering på sukrose pute, den exosome inneholder sukrose lag trukket og lagt til PBS kan lagres på 4 ° C og behandles dagen hvis overfor tidspress.
Til best av vår kunnskap er exosome/siRNA molar forholdet en viktig faktor i å avgjøre effektiviteten av electroporation. I denne protokollen brukte vi 1:60 som exosome siRNA molar forhold. Som innkapsling evnen til ulike typer exosomes er forskjellige, foreslår vi sterkt dette optimaliseres på et sak-til-sak grunnlag. Men kan innkapsling effektiviteten foreslått her alltid være en parameter for å velge den optimale electroporation forhold.
I tillegg antas samling av siRNA å være en av de fleste vanlig problem i electroporation. Det er bevist at electroporation kan indusere sterk samling av siRNA, noe som gjør det enda vanskeligere å angi exosomes. siRNA samlinger blir ofte feilaktig tolket som innkapsling av siRNA i exosome derfor riktig kontroller ble brukt i denne studien som dannelsen av siRNA aggregater er uunngåelig under electroporation28. Prosentandel innkapsling effektiviteten av våre rensing metoden ble beregnet ved normaliserte verdier for å minimalisere påvirkning fra andre kilder som bakgrunn støy, exosome og siRNA samlinger som vil påvirke datapålitelighet. Basert på våre funn, var det ubetydelig siRNA samlinger i på kontroll prøven dvs. bruke electroporated og FN-electroporated siRNA.
Denne protokollen har vist innkapsling av siRNA i exosomes og deres påfølgende intracellulær levering av siRNA til kreft celler i vitro. Ulike typer exosomes fra forskjellige linjer kan derfor være isolert preget med foreslåtte protokollen, og deretter lastet med forskjellige terapeutiske siRNA for ulike typer kreftfremkallende mål over uttrykt i ulike kreftformer. Et interessant program som vil være å utforske siRNA levering og opptak effektiviteten ved hjelp av forskjellige permutasjoner av exosome kilde-målet cellen par i vitro. Dette kan deretter oversettes til dyr modeller for å vurdere effektiviteten av både leveransen og effektivitet av siRNA-kapslet exosomes i vivo.

Exosomes er en undertype av ekstracellulære blemmer (EV) fra 50-200 nm i diameter, skilles ut av ulike celletyper som immunceller1,2, kreft celler3,4,5, 6 og stamceller7. Exosomes har også vist seg å være til stede i ulike fysiologiske væsker8,9,10,11. Kombinasjonen av iboende evne til exosomes å bære ulike biomolecules (f.eks RNA og proteiner)12,13,14 og effektiv levering av disse biomolecules i mottakerens celler 15 , 16 , 17 tiltrukket interesse for sitt potensial som nano-skala stoffet levering vektorer. Ulike små molekyler som tjene som anti-kreft og anti-inflammatorisk narkotika er vist for å være er lastet inn i exosomes og levert til målet celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. interessant nukleinsyrer som siRNA28,29 og microRNA30 har også vært er lastet inn i exosomes via electroporation og leveres til målcellene.
Nylig har RNA forstyrrelser (RNAi) via lite forstyrrende RNA (siRNA) fått mer interesse som foretrukket mekanismen i genet silencing dens høy spesifisitet, potente effekt, minimale bivirkninger og enkel siRNA syntese28, 29. siRNAs er double-strandet RNA molekyler, fra 19 til 25 nukleotider i lengde som utløser sekvens-spesifikke katalytisk mRNA knockdown. Sin store molekylvekt og polyanionic natur er passiv opptak av nakne siRNA i cellene hindret28,29. Det er heller ikke mulig for naken siRNA skal injiseres i systemisk sirkulasjonen på grunn av rask nedbrytning av plasma nucleases31. Dermed ville innkapsling av siRNA i en nanocarrier hjelpe effektiv levering og opptak av siRNA i målcellene.
Exosomes er et ideelt system for siRNA innkapsling strukturen består av en hul, vandig kjerne innhyllet i en phospholipid bilayer. Exosomes ikke bare har god stabilitet i blodet, men har også naturlige målretting egenskaper å levere funksjonelle RNA i celler32. Studien utført av Alvarez-Erviti et al. vellykket demonstrert effektiv levering av siRNA til hjernen til mus bruker utviklet exosomes med nesten ingen komplikasjoner31. Det er en teori om at exosome-basert terapi er relativt tryggere enn andre terapier som exosomes ikke repliseres endogenously som celler og derfor ikke vise egenskaper for metastatisk15.
Ulike metoder har blitt rapportert å med hell isolere exosomes fra cellekultur eller fysiologiske væsker. Den mest populære metoden bruker ultracentrifugation for å pellets exosomes den starter materiale31,32,33. Denne metoden kan være ganske harde på exosomes og vanligvis co precipitates proteiner fra utvalget. Kombinere ultracentrifugation med en tetthet-baserte separasjon som sukrose graderinger blir mer vanlig, redusere protein og ikke-exosomal forurensning i de isolerte exosomes19,34. Størrelse-utestenging kromatografi (SEC) gir utskillelse av exosomes fra andre typer ekstracellulære blemmer (EV) etter størrelse og kan også føre til minimal protein forurensning men begrenses lite starter materiale det kan behandle35, 36. Immunoaffinity fange bruker perler belagt med antistoffer som binder til exosomal overflaten proteiner som tetraspanins eller andre celle-spesifikk markør som lar bestemt erobringen av exosomes i stedet for EVs eller andre proteiner, i tillegg til å isolere sub-populasjon av exosomes fra hele eksempler, men igjen er begrenset av mengden starter materiale og er kostbare36,37. Polymer-baserte utfelling av exosomes pleide å være populære også, men siden det er en ganske grov nedbør, det fører til en høyere ikke-exosomal vesicle og protein forurensning38,39.
Electroporation er rapportert for dens ineffektivitet som en metode for å laste exosomes med siRNA på grunn av protein aggregering15,28,31. Hva tilnærminger ble vist for å ha bedre lasting effektivitet og protein stabilitet, men er uønsket pga toksisitet og bivirkninger av hva agenter i endre mobilnettet gene expression28. Dermed har electroporation blitt mer brukt i siRNA lastes inn i exosomes som det er en sikrere metode. Imidlertid må en optimalisert innkapslingsmetode etableres for å levere tilstrekkelige mengder siRNA til målområdet for en potent genet knockdown.
Her foreslår vi en exosome isolasjon protokollen bruker tetthet-baserte ultracentrifugation på bare en enkelt 25% (w/w) sukrose pute i deuterium oksid, i stedet for sukrose tetthet gradering. Dette er en kostnadseffektiv metode som omgår arbeidskrevende tetthet gradert utarbeidelse og tillater behandling av store mengder starter materiale, men resulterer i intakt exosomes av høy avkastning og renhet egnet for påfølgende lasting med siRNA. Fluorescerende Atto655-konjugerte uspesifisert siRNA ble lagt inn menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293 celler) avledet exosomes via electroporation og levert til menneskelig bukspyttkjertelen adenocarcinoma (PANC-1) kreftceller i vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

Ekstracellulære blemmer, i bestemte exosomes, har nylig fått interesse som roman stoff levering vektorer deres biologiske opphavet, overflod og iboende evne i intercellulære levering av ulike biomolecules. Dette arbeidet etablerer en isolasjon protokoll for å oppnå høy kapasitet og høy renhet av exosomes for siRNA levering. Menneskelige embryonale nyreceller (HEK-293 celler) er kultivert i bioreactor flasker og kultur supernatant (heretter referert til som betinget medium) er høstet ukentlig å tillate anriking av HEK-293 exosomes. Betinget mediet (CM) er pre-klarert av døde celler og mobilnettet rusk av differensial sentrifugering og er utsatt for ultracentrifugation på en sukrose pute etterfulgt av en vask trinnet å samle exosomes. Isolerte HEK-293 exosomes kjennetegnes avkastning, morfologi og exosomal markør uttrykk av hydrogenion sporing analyse, protein kvantifisering, elektronmikroskop og flowcytometri, henholdsvis. Lite forstyrrende RNA (siRNA), fluorescently merket med Atto655, lastes inn i exosomes av electroporation og overflødig siRNA fjernes av gel filtrering. Cellen opptak i PANC-1 kreftceller, etter 24-timers inkubasjon ved 37 ° C, bekreftes av flowcytometri. HEK-293 exosomes er 107.0 ± 8.2 nm i diameter. Exosome yield og partikkel-til-protein forholdet (P:P) forholdet er 6.99 ± 0.22 × 1012 partikkel/mL og 8.3 ± 1.7 × 1010 partikkel/µg, henholdsvis. Innkapsling effektiviteten av siRNA i exosomes er ~ 10-20%. Førti prosent av cellene viser positive signaler for Atto655 på 24 h etter inkubasjon. Avslutningsvis tilbyr exosome isolasjon av ultracentrifugation på sukrose pute en kombinasjon av god avkastning og renhet. siRNA kan være er lastet inn i exosomes av electroporation og leverte senere i kreftceller i vitro. Denne protokollen gir en standard prosedyre for å utvikle siRNA lastet exosomes for effektiv levering til kreftceller.

Mekanisk-karakterisering av exosomes isolert fra HEK-293 celler (HEK-293 Exo) oppsummeres i tabell 1. Størrelsen målt ved hjelp av hydrogenion sporing analyse (NTA) instrument var 107.0 ± 8.2 nm. Exosome ytelse fra HEK-293 cellene, også analysert ved hjelp av NTA instrumentet, var 6.99 ± 0.22 x 1012 p/mL fra ~ 24 mL cm (hentes fra 2 runder av harvest). Renhet av HEK-293 Exo vurdert ved å beregne partikkel-til-protein forholdet (P:P) var 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg.
StørrelsesDistribusjon av isolerte HEK-293 Exo vises i figur 3A. Morfologisk analyse bruker overføring elektronmikroskop (TEM) viste HEK-293 Exo var sfærisk strukturer litt over 100 nm i størrelse (figur 3B). Dette resultatet er enig med det fra NTA måling (figur 3A). Den isolerte HEK-293 Exo var positive CD81, CD9 og CD63, som er kanoniske markører brukes til å identifisere blemmer som exosomes (Figur 3 c).
For rensing av exosomes bruker størrelse utelukkelse kromatografi (Figur 4), ble prosent utvinning av exosomes beregnet ved å dele totalt exosome partikkel nummeret utvinnes i 10 fraksjoner samlet (F0-F9) med den første exosome partikkel nummer brukes, mens prosent utvinning av siRNA ble beregnet ved å dele totale fluorescens intensiteten oppnådd fra F3, F4 og F5 med totalt fluorescens intensiteten fra alle 10 fraksjoner samlet. Utvinning av exosome og siRNA etter rensing beregnet som 75.0% og 80.4%, henholdsvis. Innkapsling effektiviteten av siRNA i exosomes var ~ 10-20%, beregnet med siRNA standardkurven etablert (figur 4C).
Kvalitativ analyse for i vitro opptak av exosomes lastet med fluorescerende Atto655-siRNA av flowcytometri viste at PANC-1-cellene behandles med siRNA-kapslet exosomes registrert største skiftet i fluorescens signal (figur 5A) . PANC-1-cellene behandles med siRNA-kapslet exosomes registrert en høyere andel av befolkningen positivt for Atto655 signalet (39.4%) sammenlignet med det behandlet med losset exosomes og siRNA blanding (0,56%), som bekreftet observasjon over ( Finne 5B). Graden av mobilnettet opptak av siRNA (uttrykt som fold forskjellen i mener fluorescens intensitetsverdiene (MFI) som ubehandlet celler) ble også observert for å være betydelig høyere i PANC-1-cellene behandles med siRNA-kapslet exosomes (MFI brett forskjellen = 5.1) sammenlignet med det behandlet med exosome-siRNA blanding (MFI brett forskjellen = 1.1) (figur 5C). Disse observasjonene vist at de siRNA-kapslet exosomes var internalisert PANC-1 cellene og at de effektivt levert av siRNA intracellulært.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> Figur 3: biokjemiske og morfologi analyse av HEK-293 exosomes. (A) størrelse distribusjon av HEK-293 exosomes bruker hydrogenion sporing analyse (NTA). Kurven viser en lagt histogrammet fra 3 forskjellige fanger ved 30 s med røde områder viser standard avvik mellom målinger (n = 3). (B) overføring elektronmikroskop (TEM) bilder av naive HEK-293 exosomes. Skala bar: 100 nm. (C) oppdagelsen av exosomal markører CD81, CD9 og CD63 med flowcytometri på HEK-293 exosomes. Exosomes var koblet til aldehyd/sulfat latex perler før oppdagelsen. Exosome-perler komplekset ble senere farget med fluorophore-konjugerte anti-CD81, anti-CD9 og anti-CD63 antistoffer. Graden av uttrykk for markører uttrykkes som fold forskjellen i median fluorescens intensitetsverdiene (MFI) fra at kontrollen (exosome-perler kompleks med den tilsvarende isotype). Verdiene uttrykkes som betyr ± SD, der n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> Figur 4: Exosome rensing innlegg-electroporation. (A) elueringsrør profiler (F0-F9) av Atto655-siRNA og electroporated exosomes med størrelse utelukkelse chormatography. (B) NTA analyse av både Atto655-siRNA og exosome fra F0 til F9 bruker størrelse utelukkelse chormatography. (C) kalibreringen kurven av Atto655 merket siRNA. Fluorescens intensiteter ble innhentet av platen leser på Ex / Em: 640-10/680 nm; Få 2800. Verdiene uttrykkes som betyr ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> Figur 5: Cellular opptak av siRNA-kapslet exosomes i PANC-1 celler på 4 h. (A) histogrammer sammenligne mobilnettet opptak av losset exosomes + siRNA blanding og siRNA-kapslet exosomes. (B) sammenligning av opptaket av losset exosomes + siRNA blanding på 4 h med pseudofarger, det vil tomten. (C) fold forskjellen i bety fluorescens (MFI) intensitetsverdiene for prøvene testet sammenlignet med ubehandlet celler. Verdiene uttrykkes som betyr ± SD, der n = 3. P < 0,001. NS: ubetydelig. Enveis ANOVA ble brukt til statistisk analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exosome</td>
			<td>Størrelse1,2 (nm)</td>
			<td>Gi1,2,3 (p/mL)</td>
			<td>[Protein] 2,4 (µg/mL)</td>
			<td>Partikkel-til-protein (P:P) forholdet5 (p/µg)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-293</td>
			<td>107.0 ± 8.2</td>
			<td>6.99 ± 0.22 x 10-12
</td>
			<td>84.3 ± 9.8</td>
			<td>8.3 ± 1,7 x 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 målte bruker hydrogenion sporing analyse (NTA instrument) 2 verdier blir uttrykt som betyr ± SD, der n = 3 3 yield ble innhentet av celle-conditioned medium samlet fra 2 runder av høsting fra bioreactor flasker (~ 24 mL) 4 målte bruker en protein analysen kit 5 verdien ved hjelp av formelen: P:P forholdet = kapasitet / [Protein]</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Mekanisk-karakterisering av exosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Utarbeidelse av Exosomes for siRNA levering til kreftceller

En exosome er en ny generasjon av stoffet levering bærere. Vi etablert en exosome isolasjon protokoll med høy kapasitet og renhet for siRNA levering. Vi innkapslet fluorescently merket uspesifisert siRNA i exosomes og undersøkt mobilnettet opptaket av siRNA lastet exosomes i kreftcellene.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Høsting eksosom-beriket betinget medium fra celler dyrket i bioreaktor kolber og isolasjon av sukrose pute ultracentrifugation resultere i eksosom preparat av høyt utbytte med minimal forurensende proteiner eller ikke-exosomale vesikler. Ved hjelp av en enkelt sukrosepute tilberedt i deuteriumoksid omgår den arbeidskrevende fremstillingen av en diskontinuerlig sukrosegradient og reduserer mengden sukrose som trengs for å oppnå den nødvendige tettheten. Effektiv in vitro levering av siRNA innkapsling i eksosomer utarbeidet i denne protokollen fremhever potensialet i dette systemet som en ny generasjon RNA interferens-basert terapi for kreft i bukspyttkjertelen.Til å begynne, kultur HEK-293 celler i normalt medium, som beskrevet i manuskriptet. Utvid cellene til fire T75 flasker, og vokse til de når 90% samløpet. For å forberede en bioreaktorkolbe, tilsett 50 til 100 milliliter av normalt medium i det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben for å tørst membranen.Samle alle HEK-293 celler fra de fire T75 kolben, og resuspend dem i 15 milliliter eksosom-utarmet medium i en sentrifuge rør. Deretter bruker du en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål for å forsiktig legge denne cellefjæringen til cellerommet på bioreaktorkolben. Fyll deretter det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben med det normale mediet, opptil 500 milliliter, og inkuber det ved 37 grader Celsius, 5% CO2 i en uke.Etter en uke med inkubasjon fjerner du alt mediet fra det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben ved å helle det ut. Bruk en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål, fjern alt mediet fra cellerommet. Deretter legger du til 50 til 100 milliliter normalt medium til mellomreservoaret og 15 milliliter friskt eksosomt til cellerommet ved hjelp av en 20-milliliter sprøyte koblet til en stump påfyllingsnål.Fyll deretter det mellomstore reservoaret av bioreaktorkolben med normalt medium opptil 500 milliliter. Inkuber ved 37 grader Celsius, 5% CO2 for en uke. For å forhåndsklarere det innsamlede bedede besamlede mediet, sentrifuger det på 500 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius.Overfør supernatanten til et nytt rør, og kast pelleten. Etter å ha gjentatt dette sentrifugeringstrinnet med det gjenopprettede supernatant, gjenoppretter du supernatanten igjen og kast pelleten. Deretter sentrifugere gjenvunnet supernatant på 2, 000 ganger g i 15 minutter og fire grader Celsius.Hold overnaturanten, og kast pelleten. Filtrer supernatanten en gang gjennom et 22-mikrometerfilter festet til en 20-milliliter sprøyte i et friskt sentrifugerør. I mellomtiden, for å forberede en 25% sukroseløsning i deuteriumoksid, veier du nøyaktig ut 1,9 gram sukrose i et universelt rør.Deretter legger deuteriumoksid til vekten når 7,6 gram. Fyll deretter opp et ultrasentrisk rør med 22,5 milliliter forhåndsklarert betinget medium. Plasser en glasspipette i røret.Tilsett tre milliliter sukroseløsning gjennom pipetten slik at løsningen danner et eget lag under det bevisste mediet. Plasser røret som inneholder lagdelt betinget medium/sukroseløsning i bøtte med en utsvingsrotor. Fest bøtten inn i rotoren.Plasser rotoren i ultracentrifuge, og spinn på 100, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 1,5 timer. Samle to milliliter av sukroselaget fra røret, en milliliter om gangen ved hjelp av en P1000 pipette, med spissen festet til en 10-mikroliterspiss, og legg den til en ultracentrifugeflaske som inneholder 20 milliliter filtrert PBS for vasking. Plasser røret i en fastvinkelrotor, og sentrifuger det på 100, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 1,5 timer.Bruk en 10-milliliter serologisk pipette for å forsiktig fjerne det overnaturlige. Resuspend pellet med 400 mikroliter filtrert PBS. Før du starter elektroporasjonen, før du forkjøl elektroporasjonscuvette på is i 30 minutter.Bland syv mikrogram eksosomer med 33 mikrogram siRNA i mikrocentrifugerøret. Tilsett sitronsyrebuffer for å oppnå volumet på 150 mikroliter. Tilsett eksosomet-siRNA-blandingen til elektroporasjonspotten ved hjelp av en plastpipette, og het cuvette.Plasser cuvette i riktig retning i cuvette holderen av elektroporatoren, og roter dreiehjulet på elektroporatoren 180 grader med klokken. Velg ønsket program, og trykk på Start-knappen for å starte elektroporering. Displayet vil indikere en vellykket puls.Deretter slår du hjulet 180 grader mot klokken, og fjerner cuvette. Bruk en plastpipette til å fjerne prøven fra cuvette inn i et nytt mikrocentrifugerør. Hold røret på is eller i kjøleskap før videre behandling, hvis det ikke brukes umiddelbart.For å starte gratis fjerning av siRNA, send 3,5 milliliter filtrert PBS gjennom størrelseekskludering kromatografikolonnen to ganger for å likevekte den. Oppløs deretter 150 mikroliter elektroporer av elektroporert prøve i 350 mikroliter filtrert PBS, og overfør den til SEC-kolonnen. Samle den første 500-mikroliterfraksjonen som er eluted fra kolonnen til et mikrodrivstoffrør, og merk det som F0. Deretter legger du til 500 mikroliter med filtrert PBS i kolonnen.Samle den neste fraksjonen, og merk den som F1. Gjenta legge PBS og samle elution fraksjoner til totalt 10 500-mikroliter fraksjoner, eller opp til F9, er samlet. Til slutt, for å fjerne eventuelle prøverester, vask kolonnen med filtrert PBS minst to ganger, og fortsett deretter med eksperimenter, som beskrevet i manuskriptet. Morfologisk analyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi viste at HEK-293 eksosomer var sfæriske strukturer litt større enn 100 nanometer.Dette resultatet er enig med det fra nanopartikkelsporingsanalysemåling, som også viste størrelsesfordelingen av eksosomer. Videre var de positive for eksosomale markører CD81, CD9 og CD63. Den prosentvise utvinningen av eksosomer renset ved hjelp av størrelse ekskludering kromatografi og prosentvis gjenoppretting av siRNA ble beregnet som beskrevet i manuskriptet.Etter rensing av eksosomet var 75%Ved hjelp av siRNA standardkurve, innkapslingseffektiviteten til siRNA i eksosomer ble beregnet til å være omtrent 10 til 20 % flytende cytometriqualitativ analyse av in vitro-opptak av eksosomer lastet med fluorescerende Atto655-siRNA viste at PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer hadde det største skiftet i fluorescenssignal. Det ble bekreftet av funnet at PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer registrerte en høyere prosentandel av befolkningen positivt for Atto655 signalet sammenlignet med det som ble behandlet med losset eksosomer og siRNA blanding. Cellulær opptak av siRNA var også signifikant høyere i PANC-1-celler behandlet med siRNA-innkapslede eksosomer sammenlignet med det som ble behandlet med eksosomet-siRNA-blandingen, noe som bekrefter at siRNA-innkapslede eksosomer ble internalisert av PANC-1-cellene, og at de effektivt leverer siRNA intracellulært.Det er viktig å veie sukrose og deuteriumoksid veldig nøyaktig når du forbereder sukroseløsningen, og bruk alltid nylaget sukroseløsning for å unngå tetthetsendring under lagring. Konfokal mikroskopi kan utføres for å ytterligere validere internaliseringen av siRNA innkapslet i eksosomene i celler og studere intracellulær smugling etter cellulæropptak. Denne protokollen tillater oss å vurdere den genspesifikke nedslagsen av siRNA levert av eksosom og fungerer som et verktøy for ny målvalidering i RNA interferensbasert kreftbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prekliniske musemodell Osteosarcoma definere den ekstracellulære Vesicle-mediert kommunikasjonen mellom svulst og Mesenchymal stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus levering CRISPR guider til Murine prostata for Gene endring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Genlevering i musepitelceller gjennom intraduktal injeksjon

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimalisering av ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysen

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Multiomics analyse av TMEM200A som en pan-kreft biomarkør

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...