Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

F. s. Faruqu é financiado pela agência do governo da Malásia Rakyat Amanah Majlis (MARA). Xu L. é um receptor da bolsas individuais Marie Sklodowska-Curie (Horizonte 2020) (H2020-ACEM-IF-2016). K. T. Al-Jamal reconhece financiamento do BBSRC (BB/J008656/1) e o Wellcome Trust (WT103913). Os autores também gostaria de agradecer Dr Paul Lavender e o Dr David Fear (departamento de Pneumologia e alergia, College de Londres do King) para o fornecer o electroporator.

1. celular cultura num balão de biorreator
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig1.jpg"> Figura 1: cultura de células em balão de biorreator para produção de exossomo. (A) simplificado anatomia do balão biorreator. (B) partida a cultura em balão de biorreator. Consulte Tabela de materiais para a composição do normal e empobrecido exossomo médio (C) colheita condicionado médio (CM) e manutenção da cultura no recipiente de biorreator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Cultura de células HEK-293 médio normal (ver Tabela de materiais; 5% de CO2, 37 ° C) e expandi-las em 4 frascos de x T75 (até 90% de confluencia).</li>
	<li>Molhe a membrana do balão biorreator adicionando 50-100 mL de meio normal no reservatório médio do frasco biorreator.</li>
	<li>Recolher todas as células HEK-293 do 4 x T75 e ressuspender em 15 mL de meio exossomo empobrecido (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Adicionar a suspensão de células HEK-293 ao compartimento de pilha do balão biorreator utilizando uma seringa de 20 mL, conectada a um preenchimento sem corte da agulha (ver Tabela de materiais), com cuidado para remover qualquer bolha que possa ter se formado.</li>
	<li>Encha o reservatório médio do frasco biorreator com normal médio de 500 mL e manter o frasco na incubadora (5% de CO2, 37 ° C) por uma semana.</li>
</ol>2. condicionado médio (CM) colheita de balão de biorreator
<ol><li>Depois de 1 semana, descarte todo o meio no reservatório médio do frasco biorreator.</li>
	<li>Remover todas as médias no compartimento de pilha (isto é, o CM) utilizando uma seringa de 20 mL conectada a uma agulha romba preenchimento.</li>
	<li>Adicione 50-100 mL de meio normal para o reservatório médio.</li>
	<li>Adicione 15 mL de meio exossomo empobrecido para o compartimento de pilha removendo o meio velho e adicionando fresco empobrecido exossomo médio utilizando uma seringa de 20 mL conectada a uma agulha romba preenchimento.</li>
	<li>Encha o reservatório médio do frasco biorreator com normal médio de 500 mL e manter o frasco na incubadora (5% de CO2, 37 ° C) por mais uma semana. Nota: A cultura pode ser continuada por mais de um ano. Etapa 2.2, a CM da primeira colheita não será usado para a isolação do exossomo e é descartada. Para o 2nd e colheita subsequente, o CM é mantido por exossomo isolamento.</li>
</ol>3. exossomo de isolamento para uma almofada de sacarose
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig2.jpg"> Figura 2: isolamento e caracterização de exosomes. (A) Pre-esclarecimento colhido condicionado médio (CM) de células mortas e detritos celulares. (B) isolar exosomes de CM para almofada de sacarose. (C) lavar passo para remover a sacarose e proteínas contaminantes. (D) exosomes isolado depois foram submetidas à caracterização físico-química, bioquímica e morfológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Pre-Limpe o CM (da etapa 2.2) por centrifugação diferencial e filtração como segue.<ol>
<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar a pelota. Repita essa etapa de centrifugação mais uma vez, recuperando-se o sobrenadante e descartando a pelota.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante da etapa 3.1.1 a 2.000 x g durante 15 min e 4 ° C e em seguida, descartar da pelota. Filtre o sobrenadante recuperado uma vez através de 0,22 µm de filtros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante Pre-esclarecimento, prepare solução de sacarose (w/w) 25% de óxido de deutério, com precisão, pesando 1,9 g (± 0,001 g) da sacarose em um tubo de universal e em seguida desponta com óxido de deutério, até que o peso atinge 7,6 g (± 0,001 g).</li>
	<li>Encher-se se um tubo (ver Tabela de materiais) com 22,5 mL de pre-apuradas CM. compõem o CM a 22,5 mL com 0,22 µm-filtrado PBS se o volume atual é menos do que isso.</li>
	<li>Lugar um vidro Pipetar (ver Tabela de materiais) no tubo e, através dele, adicionar 3 mL de solução de sacarose, de modo que a solução forma uma camada separada sob o CM.</li>
	<li>Cuidadosamente o lugar o tubo contendo camadas solução de sacarose/CM o balde de um rotor basculante (ver Tabela de materiais) e fixar o balde no rotor.</li>
	<li>Colocar o se o rotor (veja a Tabela de materiais) e girar a 100.000 x g, durante 1,5 h a 4 ° C.</li>
	<li>Coletar 2 mL da camada de sacarose e adicionar esta para uma garrafa se (ver Tabela de materiais) contendo 20 mL de filtrado PBS para uma etapa de lavagem.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rotor de ângulo fixo (ver Tabela de materiais) e girar a 100.000 x g, durante 1,5 h a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante com uma pipeta sorológica 10ml e resuspenda o pellet com 400 µ l de filtrado de PBS. Manter esse estoque exossomo a 4 ° C ou -80 ° C para armazenamento de curto e longo prazo, respectivamente.</li>
</ol>4. caracterização do exossomo tamanho e rendimento por nanopartículas acompanhamento análise (NTA)
<ol><li>Fazer 1:1, 000-1:50, 000 diluições do exossomo estoque em volume de 1 mL (mínimo 750 µ l) a fim de obter partículas de 20-80 no quadro de visualização da NAT instrumento exposição (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Injetar o estoque exossomo diluídos na câmara de amostra NTA instrumento utilizando uma seringa de 1 mL e inserir a sonda de temperatura de um termômetro na entrada da sonda de temperatura.</li>
	<li>Definir o software NTA (ver Tabela de materiais) para a gravação da seguinte forma: 3 medidas padrão, 30 s cada, opção de temperatura manual desmarcada; e digite o fator de diluição na guia avançado .</li>
	<li>Definir o nível de câmera para 13 e execute o script de captura do software NTA, injetando uma fornada de amostra e inserindo a temperatura da câmara de amostra quando solicitado após cada leitura.</li>
	<li>Definir o limite de 4 para a parte de análise subsequente e note o tamanho médio de modal e a concentração de partículas do estoque exossomo de medições.</li>
</ol>5. caracterização do exossomo de pureza por determinação do rácio de partícula: proteína
<ol><li>Medida que o teor de proteínas do exossomo estoque por um ensaio de proteína bicinchoninic ácido (BCA) kit (veja a Tabela de materiais) como segue.<ol>
<li>Preparar o definido padrões.
		<ol>
<li>Prepare o padrão da concentração mais alta (500 µ g/mL), acrescentando 45 µ l de solução-BSA (2 mg/mL – fornecidos no kit de ensaio) para um tubo de microcentrifugadora e torná-lo até 180 µ l com PBS.</li>
			<li>8 tubos de microcentrifuga enchem 90 µ l de PBS.</li>
			<li>Fazer diluições em série (fator: 0.5) tendo 90 µ l de BSA o mais alto padrão e adicionando-isto para a 1st microcentrifuga tubo com PBS (misture bem), em seguida, levando 90 µ l deste tubo e adicioná-lo no tubo 2nd microcentrifuga.</li>
			<li>Repita isto até o tubo de microcentrifugadora 7. O tubo 8 será apenas PBS (ou seja, o espaço em branco: 0 µ g/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare as amostras exossomo fazendo 1:2 diluição das amostras com PBS em um volume total de 90 µ l (45 µ l de amostra, 45 µ l de PBS).</li>
		<li>Prepare o BCA trabalhando mistura reagente.<ol>
<li>Calcule o volume total de BCA trabalhando mistura reagente necessária (50 μL por poço, em duplicatas, incluindo normas).</li>
			<li>Misturar os reagentes BCA individuais de acordo com a seguinte proporção: reagente de parte de reagente b: 1 para as peças de reagente a: 24 25 peças C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realize o ensaio e análise.<ol>
<li>Adicione 40 µ l de cada amostra padrão e exossomo preparada acima em um poço de uma placa de 96 poços (duplicatas para cada padrão e amostra). Nota: Uma vez que este é um ensaio colorimétrico, técnica de pipetagem adequada é crucial para alcançar resultados precisos. Pipetas de mudança após a adição de cada padrão/amostra replicar em cada um dos poços</li>
			<li>Adicionar 50 µ l do ensaio da proteína mistura reagente a trabalhar em cada poço e incubar a placa a 37 ° C por 30 min. Nota: Para minimizar os desvios entre repetições, adicionar o reagente de trabalho de ensaio de proteína para a replicar 1st de uma amostra/padrão, seguido pela replicar 2nd da mesma amostra/norma, antes de adicioná-lo para o 1st Replica de outra amostra/padrão.</li>
			<li>Medir a absorvância a 562 nm na leitora de placa (ver Tabela de materiais).</li>
			<li>Traçar uma curva padrão dos valores de absorvância das normas e trabalhar para fora a concentração de proteína em cada amostra utilizando a equação da curva.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a proporção de partículas: proteína, dividindo-se o rendimento de exossomo obtido anteriormente com a concentração de proteína do exossomo estoque medido acima.</li>
</ol>6. Caracterização da expressão do marcador de Exosomal por citometria de fluxo
<ol><li>Incube a 40 µ l de exosomes (≥1x1011 partículas/mL) com 10 µ l de grânulos de látex de aldeído/sulfato (sem diluição do estoque) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de solução de BSA 100 µM (ver Tabela de materiais) para a mistura de exossomo-grânulo para obter uma concentração final de 10 mM e incube por 15 min no RT</li>
	<li>Adicionar 1 mL de PBS e incube por 75 min a RT em um tubo de microcentrifugadora com agitação suave num agitador de balanço (~ 150 rpm).</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 580 x g durante 5 min à RT e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o precipitado com 1 mL de solução de glicina 100 mM (ver Tabela de materiais) e incube por 30 min em RT</li>
	<li>Centrifugar a suspensão por 5 min em 580 x. g. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 1 mL de 3% FBS/PBS (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Repita essa etapa de lavagem e resuspenda o pellet em 350 µ l de 3% FBS/PBS.</li>
	<li>Divida a suspensão em 7 tubos, cada um contendo 50 µ l de suspensão e incube-os com fluoróforo conjugado anti-CD81, anticorpos anti-CD9 e anti-CD63 e seus correspondentes controles isotype (01:10 diluição), respectivamente, por 45 min a 4 ° C. Mantenha 1 dos tubos como um controle imaculado, mas submetidos ao mesmo tratamento.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 3% FBS/PBS a cada tubo, centrifugue por 5 min a x 580 g e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet com 200-400 µ l de 3% FBS/PBS e analisar a amostra sobre o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) sob os canais apropriados.</li>
</ol>7. caracterização do exossomo morfologia por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
<ol><li>Corrigir exossomo dispersões aquosas em concentrações adequadas como 1010 p/mL em solução de fixação (ver Tabela de materiais) por 15 min.</li>
	<li>Lugar as amostras em 300 carbono revestido de malha cobre grades e deixar ao ar seco.</li>
	<li>Mancha negativamente as amostras com 0.22 acetato de uranilo aquosa filtrada µm (ver Tabela de materiais) para 4 min, seguido por dois 50% metanol/H2O lavar (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Ar seco da amostra.</li>
	<li>Observar as amostras sob temperatura (ver Tabela de materiais). Definir a tensão de aceleração em 80 kV e o tamanho de ponto em 2. Use abertura objetiva com todas as amostras.</li>
</ol>8. siRNA encapsulamento em Exosomes por eletroporação
<ol><li>Pre-relaxar a cubeta de eletroporação (ver Tabela de materiais) no gelo por 30 min antes de eletroporação.</li>
	<li>Mix 7,0 µ g de exosomes (32 µ l de 7 x 1012 p/mL caldo em PBS) com 0,33 µ g de siRNA (12 µ l de um efectivo de 2 µM em água livre de RNase) no tubo de microcentrifugadora. Perfazer o volume de 150 µ l de tampão de ácido cítrico (ver Tabela de materiais). O exossomo a razão molar de siRNA neste caso é 1: 60.</li>
	<li>Transfira a mistura para cubeta de eletroporação. A cubeta do tampão e coloque-o no suporte de cubeta da electroporator (ver Tabela de materiais). Gire a roda de giro 180° no sentido horário. Nota: A roda deve ser girada completamente para a posição de bloqueio, para que a cubeta entrar em contato com os eletrodos.</li>
	<li>Selecione o programa desejado eletroporação (por exemplo, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) e começar a eletroporação, pressionando o botão Iniciar . Nota: Um pulso bem sucedido é indicado mostrando "Okey" no visor.</li>
	<li>Uma vez electroporated, remover a cubeta após a volta do volante de 180° no sentido horário. Retire a amostra a cubeta com a pipeta plástica para processamento adicional.</li>
</ol>9. remoção de siRNA livre usando cromatografia de exclusão (SEC)
<ol><li>Equilibrar a coluna SEC (2,9 cm [H] x 1.3 cm [W]; Ver Tabela de materiais), passando de 3,5 mL de PBS filtrada duas vezes.</li>
	<li>Dissolver 150 μL da amostra de electroporated em 350 µ l de PBS filtrada e transferir isso para a coluna da SEC para realizar a remoção de siRNA livre.</li>
	<li>Colete a primeira fração de 500 μL que eluída da coluna (F0).</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de PBS filtrado para a coluna e coletar a próxima fração de 500 μL (F1).</li>
	<li>Repita o passo acima até que é coletado um total de frações de 10 x 500 μL (até F9). F1 e F2 devem conter o exosomes de siRNA-encapsulado.</li>
	<li>Lavar a coluna com PBS filtrada (duas vezes, pelo menos) para remover quaisquer resíduos da amostra.</li>
</ol>10. in Vitro absorção de siRNA-carregado Exosomes em células PANC-1
<ol><li>Células de PANC-1 de sementes em placas de 24-poço fundo plano (ver Tabela de materiais), em uma densidade de 50.000 células por bem 24 h antes da captação estudar e incubam as celulas na incubadora (5% de CO2, 37 ° C).</li>
	<li>Exosomes electroporate HEK-293 (7,0 μg) com Atto655-siRNA (0,33 μg) conforme a etapa 8.</li>
	<li>Purificar exossomo electroporated conforme o passo 9 e Resuspenda em 100 µ l de PBS.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de exosomes a electroporated PANC-1 célula e incubar a 37 ° C e 5% CO2 para 4 h.</li>
	<li>Recolha pilhas após incubação.</li>
	<li>Lavar as células com 1 mL de PBS estéril e Resuspenda em 200 µ l de PBS em poliestireno fundo redondo tubo (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Analisar as células pelo citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) com 10.000 eventos adquiridos por amostra. Nota: Amostras de mistura de siRNA-exossomo de Un-electroporated e células não tratadas com PBS filtrados foram usadas como controles.</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Obtendo um rendimento decente exossomo de culturas de células, que são suficientes para várias rodadas de estudos in vitro ou em vivo , ainda é um desafio. De acordo com o fabricante, destinavam-se os frascos de biorreator para produção de anticorpos e proteínas com alto rendimento de cultura de várias linhas de células imortalizado. Isso permite que as células continuamente enriquecer o meio de cultura com o produto desejado, resultando em meio condicionado concentrado (CM) no compartimento de pilha. Teoricamente, o mesmo conceito seria benéfico na produção do exossomo de várias linhas de células, e de fato cultivo destas células em balões o biorreator foi demonstrada para aumentar significativamente o rendimento de exossomo40. O grande reservatório médio continuamente fornece nutrientes para e remove resíduos do compartimento da pilha através de uma membrana semi-permeável 10 kDa, permitindo que a cultura prolongada sem exigir um grande volume de médio para estar em contacto com as células, ou regular frascos de mudança, que em última análise, podem conservar o custo global e o trabalho do exossomo de alta escala de produção40. Também foi demonstrado que a morfologia, fenótipo, bem como as funções immunomodulatory de exosomes isolaram células culturas de frascos de biorreator a longo prazo são semelhantes às que originária de células cultivadas em regular 75 cm2 frascos40. Cultura de outras linhas de célula imortalizado como fontes exossomo no recipiente de biorreator, portanto, ajudaria a aumentar seu rendimento exossomo, mantendo a sua integridade e função. Esta forma de cultura é no entanto não se aplica para as células primárias com ciclos de divisão limitada e aqueles que não podem ser cultivadas em alta densidade.
Desde a colheita do CM é feita semanalmente, e as células em cultura nunca foram passadas, pode-se supor que as células em balão de biorreator não estão crescendo em uma monocamada como a cultura de célula normal. Eles são mais propensos a formar grupos com centros necróticos, ou simplesmente desconectar-se da superfície e morrem quando as células são também confluentes para uma monocamada. Inspeção visual do compartimento da pilha do balão biorreator não é possível confirmar esta hipótese, mas é reflectida pelo grande número de células mortas, obtidos durante a colheita de CM. Remoção regular de células não viáveis e mal aderentes de balão de biorreator pode prevenir o acúmulo de materiais sobre a membrana semi-permeável que podem afetar adversamente a troca de gases, nutrientes e resíduos entre o compartimento da célula e o meio reservatório, permitindo assim a cultura prolongada nos frascos de biorreator para > 6 meses40. Neste contexto, esta não-regularidade do crescimento celular em balões o biorreator é ideal como nós especulamos que imita o estado real do tumor crescimento na vivo mais pròxima do que a cultura de células convencional monocamada, e espera-se que o exosomes produzido pelo câncer células em balão de biorreator seria mais semelhantes ao secretadas por tumores em vivo. Isso seria particularmente benéfico em estudos investigando o papel do exosomes derivado de tumor na progressão da patologia do tumor. Tumor derivado exosomes têm sido relatados para intrinsecamente e preferencialmente em casa para seus tecidos de origem32, tendo, portanto, exosomes produzido em um sistema imitando seus na vivo produção seria também desejável em estudos olhando explorar a capacidade de direcionamento passiva de exosomes como nanocarriers de drogas.
A relação de amizade foi relatada como um parâmetro para avaliar a pureza de exosomes isoladas de contaminar proteínas do meio de cultura de fluidos fisiológicos, dos quais exosomes eram provenientes de41. A relação de amizade de 8.3 ± 1,7 × 1010 p / µ g obtidos neste estudo fica dentro do intervalo de alta pureza proposto no estudo. Este rácio destaca o perigo de usar a concentração de proteína para expressar o rendimento ou a dose de exosomes isolado ou utilizadas nos estudos a jusante, respectivamente, como isto não reflete a verdadeira quantidade de exosomes disponíveis na amostra dada o problema da proteína contaminação durante o isolamento. NTA através de instrumentos tais como NanoSight, que mede a concentração de exosomes em termos de número de partículas, é uma forma mais sensata e precisa de quantificação dos exosomes.
Alta precisão de pesagem durante a preparação da solução de sacarose de 25% em óxido de deutério é crucial como esse método é uma densidade de isolamento. Exosomes ter uma faixa bastante estreita de densidade de flutuação em solução de sacarose para que preparação exacta da almofada da sacarose irá reduzir a contaminação dos não-exosomal vesículas como corpos apoptotic ou vesículas de Golgi-derivado durante o isolamento42. É aconselhável não manter a solução de sacarose sobras e usá-lo mesmo depois de um dia, a fim de evitar o risco de fatores que podem alterar a sua densidade como perda ou adição de água na solução por evaporação ou condensação de ar no tubo. Uso de um rotor basculante também é essencial durante a centrifugação para a almofada de sacarose para permitir até mesmo migração de exosomes do CM para a solução de sacarose.
Retirar a pós-centrifugação solução de sacarose é também um passo delicado, e envolve encontrar um compromisso entre maximizar a quantidade de exosomes recuperado e não muito que proteínas do meio de cultura é apresentada para a retirada de amostra exossomo . A interface entre a solução de sacarose e o meio de condição é onde iria recolher pós-centrifugação proteínas do meio de cultura e geralmente podem ser vistas como um anel marrom escuro que fica na interface. Em nossas mãos, retirar o inicial 3ml adicionado 2 mL da almofada da sacarose é o volume ideal que concorda com o compromisso acima mencionado. Os volumes descritos no presente protocolo são para os rotores específicos utilizados; Portanto, é aconselhável otimizar o volume de sacarose a ser retirado ao dimensionamento de cima ou para baixo os volumes para os tipos de rotores disponíveis em diferentes instalações. Também é importante evitar o direito de área no centro da parte inferior do tubo quando retirar a sacarose, como este é onde as partículas de maior densidade do que a sacarose serão sedimentos e normalmente pode ser visto como uma pelota de Off-White.
A etapa de lavagem com uma quantidade relativamente grande de PBS ajuda a reduzir ainda mais o grau de contaminação de proteína durante exossomo isolamento41. Esta etapa também é essencial na sacarose excesso retirando a exosomes a fim de evitar danos osmótico para o exosomes eles próprios ou as biomoléculas dentro do lúmen do exosomal, bem como reduzir o risco de crescimento bacteriano e/ou fúngico do exossomo de estoque. Preparar a solução de sacarose em óxido de deutério em vez de água ajuda a reduzir a quantidade de sacarose necessária para atingir a densidade de flutuação do exossomo de isolamento, portanto, reduzindo o risco de tanto dano osmótico e contaminação microbiana. Após a primeira centrifugação para a almofada de sacarose, contendo o exossomo camada de sacarose retirado e adicionado para a PBS pode ser armazenada a 4 ° C e processada no dia seguinte, se depara com limitações de tempo.
O melhor de nosso conhecimento, a relação molar exossomo/siRNA é um fator importante na determinação da eficiência da eletroporação. Neste protocolo, usamos 1: 60 como o exossomo a razão molar de siRNA. Como a capacidade de encapsulação de diferentes tipos de exosomes são diferentes, nós recomendamos fortemente que esta para ser otimizado em uma base caso-a-caso. No entanto, a eficiência de encapsulação proposta neste documento sempre pode ser um parâmetro para selecionar as condições de eletroporação ideal.
Além disso, a agregação de siRNA é acreditada para ser um dos problemas mais comuns na eletroporação. Está provado que electroporation pode induzir forte agregação de siRNA, tornando ainda mais difícil entrar exosomes. siRNA agregações são erroneamente interpretadas como encapsulamento de siRNA em exossomo um controlo adequado, portanto, foram utilizados neste estudo, como a formação de agregados de siRNA é inevitável durante electroporation28. A eficiência de encapsulação de percentagem do nosso método de purificação foi calculada usando valores normalizados para minimizar a influência de outras fontes como agregações fundo ruído, exossomo e siRNA que afetam a confiabilidade de dados. Baseado em nossos achados, havia agregações de siRNA insignificante observadas no controle amostra ou seja, usando siRNA electroporated e un-electroporated.
Este protocolo demonstrou com sucesso o encapsulamento de siRNA em exosomes e sua subsequente entrega intracelular do siRNA para câncer células in vitro. Portanto, vários tipos de exosomes de linhagens celulares diferentes podem ser isolado e caracterizado utilizando o protocolo proposto e posteriormente carregado com vários siRNA terapêuticos para diferentes tipos de alvos oncogênicos over expressos em diferentes tipos de câncer. Uma aplicação interessante seria explorar a eficiência de entrega e captação de siRNA usando várias permutações de exossomo de origem-destino célula par em vitro. Isto então pode ser convertido em modelos animais para avaliar a eficiência de ambos a entrega e eficácia terapêutica de siRNA-encapsulado exosomes in vivo.

Exosomes são um subtipo de vesículas extracelulares (EV), que variam de 50-200 nm de diâmetro, secretado por vários tipos de células, como células do sistema imunológico1,2, as células cancerosas3,4,5, 6 e tronco células7. Exosomes também se mostraram estar presente em vários fluidos fisiológicos8,9,10,11. A combinação entre a capacidade inerente de exosomes de transportar várias biomoléculas (por exemplo, RNA e proteínas)12,13,14 e a entrega efetiva destas biomoléculas em células destinatários 15 , 16 , 17 atraiu o interesse de seu potencial como vetores de entrega de droga de nano-escala. Várias pequenas moléculas que servem como drogas anti-câncer e anti-inflamatório tem sido demonstradas para ser carregado com êxito em exosomes e entregues ao alvo células18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Curiosamente, os ácidos nucleicos tais como siRNA28,29 e microRNA30 também foi carregado com êxito no exosomes via eletroporação e entregues às células alvo.
Recentemente, RNA interferência (RNAi) através de interferência RNA pequeno (siRNA) ganhou mais interesse como o mecanismo preferido no silenciamento de genes devido à sua alta especificidade, efeito potente, efeitos colaterais mínimos e facilidade de siRNA síntese28, 29. siRNAs são moléculas de RNA double-stranded variando de 19 a 25 nucleotides no comprimento que nocaute de mRNA catalítico gatilhos sequência específica. Devido ao seu grande peso molecular e natureza polyanionic, absorção passiva de siRNA nua em células é impedido de28,29. Também não é possível para siRNA nua deve ser injetado na circulação sistêmica devido à rápida degradação por nucleases de plasma31. Assim, encapsulamento de siRNA em nanocarreador ajudariam a entrega eficaz e absorção de siRNA dentro das células alvo.
Exosomes é um sistema ideal para encapsulamento de siRNA como sua estrutura é composta de um núcleo oco, aquoso, envelopado por uma BICAMADA de fosfolípidos. Exosomes não só têm boa estabilidade no sangue, mas também têm propriedades naturais de direcionamentos para entregar RNA funcional nas células32. O estudo realizado por Alvarez-Erviti et al com sucesso demonstrado efetiva entrega de siRNA para o cérebro de ratos utilizando engenharia exosomes com praticamente sem complicações de31. A hipótese é de que a terapia baseada em exossomo é relativamente mais segura do que outras terapias, como exosomes não replicar endogenamente como células e, portanto, não apresentam propriedades metastático15.
Vários métodos têm sido relatados para isolar com êxito exosomes de cultura celular ou fluidos fisiológicos. O método mais popular usa a ultracentrifugação para exosomes desde a partida de32,material31,33de Pelotas. Esse método pode ser bastante duro na exosomes e, geralmente, precipitados co proteínas da amostra. Combinando a ultracentrifugação com uma separação baseada na densidade tais como gradientes de sacarose é cada vez mais comum, para reduzir a contaminação de proteína e não-exosomal.19,a exosomes isolada34. Tamanho-exclusão cromatografia (SEC) permite a separação de exosomes de outros tipos de vesículas extracelulares (EV), tamanho e também pode resultar em contaminação mínima de proteína, mas é limitada pela pequena quantidade de material que pode processar35, começar 36. Immunoaffinity captura usa pérolas revestidas com anticorpos que se ligam a proteínas de superfície exosomal, como tetraspanins ou outro marcador de célula específica que permite a captura específica de exosomes, ao invés de EVs ou outras proteínas, bem como isolar a subpopulação de exosomes de todo as amostras, mas novamente é limitada pela quantidade de material começar e é caro36,,37. Baseado em polímero de precipitação de exosomes era popular também, mas já que é uma precipitação bastante cru, conduz a uma maior não-exosomal vesículas e proteína contaminação38,39.
Electroporation foi relatado por sua ineficiência como um método para carregar exosomes com siRNA devido a agregação de proteínas15,28,31. Abordagens de transfeccao foram demonstradas para ter que carregar melhor eficiência e estabilidade de proteínas, mas é indesejáveis devido à sua toxicidade e efeitos colaterais dos agentes de transfecção em alterar a expressão de gene celular28. Assim, eletroporação tem sido mais amplamente utilizada no carregamento de siRNA em exosomes como é um método mais seguro. No entanto, um método de encapsulamento otimizado precisa ser estabelecido para fornecer quantidades adequadas de siRNA para o site de destino para um knockdown potente do gene.
Aqui, propomos um protocolo de isolamento exossomo usando baseado em densidade ultracentrifugação em apenas um único 25% (w/w) sacarose coxim preparado em óxido de deutério, ao invés de um gradiente de densidade de sacarose. Este é um método de baixo custo que contorna a preparação de gradiente de densidade laborioso e permite o processamento de grandes volumes de material começar, no entanto, resulta em exosomes intacto de alto rendimento e pureza adequada para carregamento subsequente com siRNA. Fluorescente Atto655-conjugado específico siRNA foi carregado no rim embrionário humano células (HEK-293) derivadas exosomes via eletroporação e entregue para as células cancerosas humanas adenocarcinoma pancreático (PANC-1) in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

Vesículas extracelulares, em particular exosomes, recentemente ganharam interesse como droga nova vetores de entrega devido a sua origem biológica, abundância e capacidade intrínseca na entrega intercelular de várias biomoléculas. Este trabalho estabelece um protocolo de isolamento para atingir alto rendimento e alta pureza de exosomes para a entrega de siRNA. Células de rim embrionário humanas (células HEK-293) são cultivadas em frascos de biorreator e a sobrenadante de cultura (aqui referida como meio condicionado) é colhida em uma base semanal, para permitir o enriquecimento de HEK-293 exosomes. O meio condicionado (CM) é previamente limpo de células mortas e restos celulares por centrifugação diferencial e é submetido a ultracentrifugação para uma almofada de sacarose, seguida por uma etapa de lavagem, para recolher a exosomes. Isolado HEK-293 exosomes caracterizam-se por rendimento, morfologia e exosomal expressão de marcador por análise de rastreamento de nanopartículas, quantificação de proteína, microscopia eletrônica e citometria de fluxo, respectivamente. RNA de interferência pequeno (siRNA), fluorescente etiquetado com Atto655, é carregado em exosomes por eletroporação e siRNA em excesso é removido por filtração em gel. Captação de célula em células de câncer PANC-1, após incubação de 24 horas a 37 ° C, é confirmada por citometria de fluxo. Exosomes HEK-293 são 107.0 ± 8,2 nm de diâmetro. A taxa de proporção (estudante) exossomo rendimento e partícula-a-proteína são 6,99 ± 0,22 × 1012 partículas/mL e 8,3 ± 1,7 × 1010 partícula / µ g, respectivamente. A eficiência de encapsulação de siRNA em exosomes é ~ 10-20%. Quarenta por cento das células mostrar sinais positivos para Atto655 em 24h pós-incubação. Em conclusão, exossomo isolamento por ultracentrifugação em coxim de sacarose oferece uma combinação de bom rendimento e pureza. siRNA poderia ser carregado com êxito em exosomes por eletroporação e posteriormente entregue nas células cancerosas in vitro. Este protocolo oferece um procedimento padrão para o desenvolvimento de siRNA-carregado exosomes para entrega eficiente de células cancerosas.

A caracterização físico-química de exosomes isolados de células HEK-293 (Exo de HEK-293) estão resumidos na tabela 1. O tamanho medido usando nanopartículas acompanhamento de instrumento de análise (NTA) foi 107.0 nm ± 8,2. Rendimento do exossomo de células HEK-293, também analisados usando o instrumento NTA, foi 6,99 ± 0.22 x 1012 p/mL de ~ 24 mL de CM (obtido de 2 voltas de colheita). Pureza do Exo de HEK-293 avaliado pelo cálculo do rácio de partícula-a-proteína (estudante) foi 8,3 ± 1,7 × 1010 p / µ g.
A distribuição de tamanho de Exo de HEK-293 isolado é mostrada na Figura 3A. Análise morfológica utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostrou o Exo de HEK-293 eram estruturas esféricas ligeiramente acima de 100 nm de tamanho (Figura 3B). Este resultado concorda com isso de medição NTA (Figura 3A). O Exo de HEK-293 isolados foram positivas para CD81, CD9 e CD63, que são marcadores canônicos usados para identificar vesículas como exosomes (Figura 3).
Para a purificação de exosomes usando cromatografia de exclusão (Figura 4), a percentagem de recuperação de exosomes foi calculada dividindo o número de partículas do exossomo total recuperado em 10 frações coletadas (F0-F9) com a inicial exossomo número de partículas utilizado, enquanto que a percentagem de recuperação de siRNA foi calculada dividindo-se a intensidade de fluorescência total Obtida de F3, F4 e F5 com a intensidade de fluorescência total Obtida de todos os 10 fracções recolhidas. A recuperação do exossomo e siRNA pós-purificação foi calculado como 75,0% e 80,4%, respectivamente. A eficiência de encapsulação de siRNA em exosomes foi ~ 10-20%, calculada usando siRNA curva padrão estabelecida (Figura 4).
Análise qualitativa de captação em vitro de exosomes carregado com o Atto655-siRNA fluorescente por citometria de fluxo mostraram que PANC-1 células tratadas com siRNA-encapsulado exosomes gravou a maior mudança no sinal de fluorescência (Figura 5A) . PANC-1 células tratadas com siRNA-encapsulado exosomes gravou uma porcentagem mais elevada da população positiva para o Atto655 sinal (39,4%) em relação ao que tratados com descarregado exosomes e siRNA mistura (0,56%), que confirmou a observação acima ( Figura 5B). O grau de absorção celular de siRNA (expressado como a diferença de dobra em valores de fluorescência de média intensidade (IFM) das células não tratadas) observou-se também de ser significativamente maior em células PANC-1 tratadas com siRNA-encapsulado exosomes (dobra de IFM diferença = 5.1) em comparação com que tratou com a mistura de exossomo-siRNA (IFM dobre diferença = 1.1) (Figura 5). Estas observações demonstraram que o exosomes de siRNA-encapsulado foi internalizadas pelas células PANC-1 e que efetivamente entregaram o siRNA intracelular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> Figura 3: bioquímica e análise de morfologia de HEK-293 exosomes. (A) distribuição de HEK-293 exosomes usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de tamanho. A curva mostra um histograma sobreposto de 3 diferentes captura no intervalo de 30 s, com áreas vermelhas que indicam o desvio-padrão entre as medições (n = 3). (B) imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) o ingênuo HEK-293 exosomes. Barra de escala: 100 nm. (C) deteção dos marcadores exosomal CD81, CD9 e CD63 usando citometria de fluxo em exosomes HEK-293. Exosomes foram acoplados aos grânulos de látex aldeído/sulfato antes da deteção. Complexo do exossomo-grânulos posteriormente foram corados com anticorpos anti-CD81, anti-CD9 e anti-CD63 fluoróforo conjugado. Grau de expressão dos marcadores são expressas como a diferença de dobra em valores de fluorescência de mediana intensidade (IFM) do que do controle (complexo exossomo-grânulos corado com o isotipo correspondente). Os valores são expressos como média ± DP, onde n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> Figura 4: exossomo purificação post-electroporation. (A) perfis de eluição (F0-F9) de siRNA-Atto655 e electroporated exosomes usando chormatography de exclusão de tamanho. (B) NTA análise de siRNA-Atto655 e exossomo de F0 a F9 usando chormatography de exclusão de tamanho. (C) a calibração curva de Atto655 rotulados siRNA. As intensidades de fluorescência foram obtidas pelo leitor no Ex / Em: 640-10/680 nm; Ganham 2800. Os valores são expressos como média ± DP (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> Figura 5: absorção celular de siRNA-encapsulado exosomes em células PANC-1 em 4 h. Histogramas de (A) comparando a absorção celular de exosomes descarregado + mistura de siRNA e siRNA-encapsulado exosomes. (B) comparação entre a absorção de exosomes descarregado + mistura de siRNA em 4h por parcela pseudocolorida. (C) a diferença de dobra em média fluorescência intensidade (IFM) valores das amostras testadas comparados com a de células não tratadas. Os valores são expressos como média ± DP, onde n = 3. P < 0,001. NS: não significativo. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA One-Way. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exossomo</td>
			<td>Tamanho1,2 (nm)</td>
			<td>Rendimento1, 2,3 (p/mL)</td>
			<td>[Proteína] 2,4 (µ g/mL)</td>
			<td>Proporção de partículas de proteína (estudante)5 (p / µ g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEK-293</td>
			<td>107.0 ± 8,2</td>
			<td>6,99 ± 0.22 x 1012
</td>
			<td>84,3 ± 9,8</td>
			<td>8,3 ± 1,7 x 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 medido usando nanopartículas análise (instrumento NTA) de rastreamento 2 os valores são expressos como média ± DP, onde n = 3 3 rendimento foi obtido por meio de célula-condicionado pool de 2 voltas de colheita de frascos de biorreator (~ 24 mL) 4 medido usando um kit de ensaio da proteína 5 valor obtido usando a fórmula: relação de amizade = rendimento / [proteína]</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Caracterização físico-química de exosomes.

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Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Um exossomo é uma nova geração de portadores de entrega de drogas. Estabelecemos um protocolo de isolamento do exossomo com alto rendimento e pureza para a entrega de siRNA. Nós também encapsulados fluorescente etiquetado siRNA inespecífico em exosomes e investigou a absorção celular de siRNA-carregado exosomes em células cancerosas.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

A colheita do meio condicionado enriquecido exossomo de células cultivadas em frascos bioreatores e isolamento por ultracentrifugação de almofada de sacarose resultam em preparação exosóica de alto rendimento com proteínas contaminantes mínimas ou vesículas não exosômicas. O uso de uma única almofada de sacarose preparada em óxido de deutério contorna a preparação laboriosa de um gradiente de sacarose descontínua e reduz a quantidade de sacarose necessária para alcançar a densidade necessária. A entrega in vitro eficaz do encapsulamento de siRNA em exosóis preparados neste protocolo destaca o potencial deste sistema como uma nova geração de terapia baseada em interferência de RNA para câncer de pâncreas.Para começar, cultura HEK-293 células em meio normal, como descrito no manuscrito. Expanda as células em quatro frascos T75, e cresça até atingir 90% de confluência. Para preparar um frasco bioreator, adicione 50 a 100 mililitros de meio normal no reservatório médio do frasco bioreator para molhar a membrana.Colete todas as células HEK-293 dos quatro frascos T75, e resuspenque-as em 15 mililitros de meio exosomos em um tubo de centrífuga. Em seguida, use uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento contundente para adicionar cuidadosamente esta suspensão celular ao compartimento celular do frasco bioreator. Em seguida, encha o reservatório médio do frasco bioreator com o meio normal, até 500 mililitros, e incuba-o a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por uma semana.Após uma semana de incubação, remova todo o meio do reservatório médio do frasco bioreator, despejando-o. Usando uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento sem corte, remova todo o meio do compartimento celular. Em seguida, adicione 50 a 100 mililitros de meio normal ao reservatório médio e 15 mililitros de meio exosome fresco esgotado ao compartimento celular usando uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento contundente.Em seguida, encha o reservatório médio do frasco bioreator com meio normal até 500 mililitros. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por mais uma semana. Para pré-limpar o meio condicionado coletado, centrifuá-lo a 500 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Transfira o supernatante para um novo tubo, e descarte a pelota. Depois de repetir essa etapa de centrifugação com o supernante recuperado, recupere o sobrenante novamente e descarte a pelota. Em seguida, centrífugue o supernaente recuperado a 2.000 vezes g por 15 minutos e quatro graus Celsius.Mantenha o supernatante, e descarte a pelota. Filtre o supernatante uma vez através de um filtro de 22 micrômetros ligado a uma seringa de 20 mililitros em um tubo de centrífuga fresco. Enquanto isso, para preparar uma solução de 25% de sacarose em óxido de deutério, pesar com precisão 1,9 gramas de sacarose em um tubo universal.Em seguida, adicione óxido de deutério até que o peso atinja 7,6 gramas. Em seguida, encha um tubo de ultracentrifutura com 22,5 mililitros de meio condicionado pré-limpo. Coloque uma pipeta de vidro no tubo.Adicione três mililitros de solução de sacarose através da pipeta para que a solução forme uma camada separada abaixo do meio condicionado. Coloque cuidadosamente o tubo contendo solução média/sacarose em camadas em camadas no balde de um rotor swing-out. Segure o balde no rotor.Coloque o rotor no ultracentrifuuge e gire a 100.000 vezes g a quatro graus Celsius por 1,5 horas. Colete dois mililitros da camada de sacarose do tubo, um mililitro de cada vez usando uma pipeta P1000, com sua ponta presa a uma ponta de 10 microliteres, e adicione-a a uma garrafa ultracentrífa contendo 20 mililitros de PBS filtrado para lavagem. Coloque o tubo em um rotor de ângulo fixo e centrífugue a 100.000 vezes g a quatro graus Celsius por 1,5 horas.Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover cuidadosamente o supernatante. Resuspenja a pelota com 400 microliters de PBS filtrado. Antes de iniciar a eletroporação, pré-esfrie a cuvette de eletroporação no gelo por 30 minutos.Misture sete microgramas de exosósmos com 33 microgramas de siRNA no tubo de microcentrifutura. Adicione o tampão de ácido cítrico para atingir o volume de 150 microliters. Adicione a mistura exossome-siRNA ao cuvette de eletroporação usando uma pipeta de plástico, e tampa a cuvette.Coloque a cuvette na orientação certa no suporte de cuvette do eletroporador, e gire a roda giratória do eletroporador 180 graus no sentido horário. Selecione o programa desejado e pressione o botão Iniciar para iniciar a eletroporação. O visor indicará um pulso bem sucedido.Em seguida, volte a roda 180 graus no sentido anti-horário e remova a cuvette. Use uma pipeta de plástico para remover a amostra da cuvette em um novo tubo de microcentrifuuagem. Mantenha o tubo no gelo ou em uma geladeira antes de processamento adicional, se não for usado imediatamente.Para iniciar a remoção gratuita do siRNA, passe 3,5 mililitros de PBS filtrado através da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho duas vezes para equilibrá-la. Em seguida, dissolver 150 microliters de amostra eletroporada em 350 microliters de PBS filtrado, e transferi-lo para a coluna SEC. Colete a primeira fração de 500 microliter eludida da coluna em um tubo de microfuça, e marque-a como F0. Em seguida, adicione 500 microliters de PBS filtrado à coluna.Colete a próxima fração, e marque-a como F1. Repita a adição do PBS e a coleta de frações de elução até que um total de 10 frações de 500 microliter, ou até F9, seja coletado. Finalmente, para remover quaisquer resíduos amostrais, lave a coluna com PBS filtrado pelo menos duas vezes e, em seguida, continue com experimentos, como descrito no manuscrito. A análise morfológica usando microscopia eletrônica de transmissão mostrou que os exosóis HEK-293 eram estruturas esféricas ligeiramente maiores que 100 nanômetros.Este resultado concorda com o da medição da análise de rastreamento de nanopartículas, que também mostrou a distribuição de tamanho dos exosóis. Além disso, foram positivos para marcadores exosômicos CD81, CD9 e CD63. A recuperação percentual de exosóis purificados por meio da cromatografia de exclusão de tamanho e a recuperação percentual do siRNA foram calculadas conforme descrito no manuscrito.A recuperação pós-purificação do exossomo foi de 75% Utilizando a curva padrão siRNA, a eficiência de encapsulamento do siRNA em exosóis foi calculada em cerca de 10 a 20% A análise qualitativa da citometria de fluxo de absorção in vitro de exossomos carregados com Atto655-siRNA fluorescente mostrou que as células PANC-1 tratadas com exosomos encapsulados pelo siRNA tiveram a maior mudança no sinal de fluorescência. Isso foi confirmado pela constatação de que as células PANC-1 tratadas com exosóis encapsulados pelo siRNA registraram maior percentual de população positiva para o sinal Atto655 em comparação com a tratada com exosomos descarregados e mistura de siRNA. A absorção celular do siRNA também foi significativamente maior em células PANC-1 tratadas com exossomos encapsulados pelo siRNA em comparação com a tratada com a mistura exosome-sirna, confirmando que os exosóis encapsulados pelo siRNA foram internalizados pelas células PANC-1 e que efetivamente entregam o siRNA intracelularmente.É importante pesar o óxido de sacarose e deutério com muita precisão no preparo da solução de sacarose, e sempre usar solução de sacarose recém-preparada para evitar alterações de densidade durante o armazenamento. A microscopia confocal pode ser realizada para validar ainda mais a internalização do siRNA encapsulado nos exosóis nas células e estudar seu tráfico intracelular após a captação celular. Este protocolo nos permite avaliar o knockdown específico do siRNA fornecido por exosomos e serve como uma ferramenta para nova validação de alvo na terapia de câncer baseada em interferência de RNA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Pesquisa do câncer

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

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TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...