Name: preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells
Uploaded: 2018-12-05T12:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Ф. н. Faruqu финансируется Агентством правительства Малайзии Rakyat Amanah Меджлиса (Мара). L. Сюй является получателем индивидуальных стипендий Мария Склодовская-Кюри (Horizon 2020) (H2020-МСКА-если-2016). K. т. Аль-Джамаль признает, финансирование от СИББН (BB/J008656/1) и Уэллком траст (WT103913). Авторы также хотели бы поблагодарить д-р Пол лаванды и д-р Дэвид страх (Департамент респираторной медицины и аллергии, Королевский колледж Лондона) для обеспечения electroporator.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Получение достойной exosome доходность от культивируемых клеток, которые являются достаточно для нескольких раундов в vitro или в vivo исследований, по-прежнему является проблемой. По словам производителя биореактор колбы были предназначены для производства антител и белков с высокой доходности от культуры различных увековечен клеточных линий. Это позволяет клеткам непрерывно обогащают питательной среды с желаемого продукта, приводящих к концентрированной кондиционером среднего (см) в клетки купе. Теоретически же концепция будет полезным в exosome производства из различных клеточных линий, и действительно культивирования этих клеток в колбах биореактор была продемонстрирована значительно увеличить урожайность exosome40. Большой средних водохранилища постоянно поставляет питательные вещества и удаление отходов из клеток отсека через 10 кДа полупроницаемую мембрану, позволяя продолжительной культуре не требуя большого количества средних быть в контакте с клетки, или регулярные Фляги изменения, которые могут в конечном счете сохранить общую стоимость и труда крупномасштабных exosome производства40. Было также продемонстрировано, что морфология, фенотип, а также функции иммуномодулирующих exosomes изолированных клеток, что долгосрочные биореактор колбы культур аналогичны, получены из клетки культивировали в регулярных 75 см2 фляги40. Поэтому культура других увековечен клеточных линий как exosome источников в биореакторе колбу поможет увеличить доходность их exosome при сохранении их целостности и функции. Эта форма культуры является, однако не применимо к первичной ячейки с ограниченным разделение циклов и те, которые нельзя культивировали в высокой плотности.
Так как урожай см делается раз в неделю, и никогда не были пассированной клетки в культуре, можно предположить, что клетки в биореакторе настой не растут в монослое как регулярные клеточной культуры. Они, скорее всего, создавать кластеры с некротическими центрами или просто отсоединить от поверхности и умереть, когда клетки слишком вырожденная для монослоя. Визуальный осмотр клеток отсека биореактор фляга невозможно подтвердить это предположение, но отражается на большое количество отмерших клеток, полученные во время сбора урожая см. Регулярное удаление плохо сторонником и нежизнеспособных клеток от биореактор настой может предотвратить накопление материалов на полупроницаемую мембрану, которая может отрицательно сказаться на обмен газа, питательных веществ и отходов между отсеке клеток и среднего водохранилище, таким образом позволяя в биореакторе колбы для длительного культуры > 6 месяцев40. В этом контексте, это не регулярности роста клеток в колбах биореактор является идеальным, как мы предположить, что он имитирует фактического состояния опухолевого роста в естественных условиях более тесно, чем обычные монослойном культивировании клеток, и следует надеяться, что exosomes производимые раковые клетки в биореакторе колбу будет больше похож на что выделяемый опухоли в vivo. Это было бы особенно полезным в исследованиях, глядя в роли опухоли производные exosomes в прогрессии опухоли патологии. Опухоль производные exosomes сообщили неразрывно и преференциально домой, чтобы их ткани происхождения32, поэтому имея exosomes, производимых в системе, имитируя их в естественных условиях производства было бы также желательно в исследованиях, глядя на изучает пассивной ориентации способность exosomes как nanocarriers препарат.
Аналогично соотношение было сообщено как параметр для оценки чистоты изолированных exosomes от загрязнения белки от питательной среды физиологические жидкости, от которых были получены exosomes из41. Аналогично соотношение 8,3 ± 1,7 × 1010 p/мкг, полученные в настоящем исследовании находится в диапазоне высокой чистоты, предложенные в исследовании. Это соотношение подчеркивается опасность использования концентрацию белка выразить урожайности или дозы exosomes изолированные или используется в нижнем течении исследования соответственно, как это не отражает истинное количество доступных в образце, учитывая проблемы белка exosomes загрязнение в изоляции. НТА через инструменты, такие как NanoSight, который измеряет концентрацию exosomes количеству частиц, является более разумным и точным способом количественной оценки exosomes.
Высокоточные весом в ходе подготовки 25% раствора сахарозы в окись дейтерия имеет решающее значение, как этот метод на основе плотность изоляции. Exosomes имеют довольно узкий диапазон плотности флотации в растворе сахарозы, поэтому точная подготовка сахарозы подушки позволит снизить загрязнение не exosomal пузырьки как apoptotic тела или пузырьков Гольджи, полученных во время изоляции42. Рекомендуется не хранить остатки сахарозы решение и использовать его даже после одного дня с тем, чтобы избежать риска факторов, которые могут изменить его плотность таких потерь или добавление воды в растворе на испарение и конденсация воздуха в трубке. Использование поворотно откидные ротора также важно во время центрифугирования на подушке сахарозы чтобы разрешить даже миграции exosomes см для раствора сахарозы.
Снятие после центрифугирования раствор сахарозы также деликатный шаг, и он включает в себя поиск компромисса между максимальное количество exosomes восстановленные и не слишком много, что белок из питательной среды вводится в exosome пример вывода . Интерфейс между раствора сахарозы и состояния среды, где белки от питательной среды будет собирать после центрифугирования и обычно может рассматриваться как темно коричневый кольцо, которое сидит на интерфейсе. В наших руках снятия 2 мл сахарозы подушки из первоначальных 3 мл добавил является оптимальный объем, который соглашается с компромиссом, упомянутых выше. Тома, указанных в настоящем Протоколе, для конкретных роторов используется; Поэтому рекомендуется оптимизировать объем сахарозы быть отменены при масштабировании вверх или вниз томов для типы роторов, доступных в различных учреждениях. Важно также избежать области право в центре нижней части трубки при снятии сахарозы, как это, где частиц плотность выше, чем сахароза будет отложений и обычно может рассматриваться как белые гранулы.
Стиральная шаг с относительно большим количеством PBS помогает дальнейшему сокращению степени загрязнения белков во время exosome изоляции41. Этот шаг необходим также удаление избыточного сахарозы из exosomes избежание осмотического повреждения exosomes сами или биомолекул в Люмене exosomal, а также снизить риск бактериальных или грибковых роста на складе exosome. Подготовка раствора сахарозы в окись дейтерия, вместо того, чтобы вода помогает уменьшить количество сахарозы, необходимых для достижения плотности флотации exosome для изоляции, поэтому снижение риска осмотического повреждения и микробной контаминации. После первого центрифугированием на подушке сахарозы, exosome содержащих сахарозу слой снят и добавлен в PBS можно хранить при 4 ° C и обработаны на следующий день, если сталкивается с нехваткой времени.
В меру наших знаний exosome/siRNA молярное соотношение является важным фактором в определении эффективности электропорации. В этом протоколе мы использовали 1: 60 как exosome чтобы молярное соотношение siRNA. Как способность инкапсуляции различных видов exosomes разные, мы настоятельно рекомендуем это быть оптимизированы на основе case-by-case. Однако инкапсуляции эффективность предлагаемых здесь всегда может быть параметром для выбора оптимального электропорации условий.
Кроме того совокупность малых интерферирующих РНК считается одним из наиболее распространенных проблем в электропорации. Доказано, что что электропорации может вызвать сильный совокупность малых интерферирующих РНК, что делает его еще труднее ввести exosomes. siRNA агрегаты часто ошибочно воспринимается как инкапсуляция интерферирующей РНК в exosome поэтому надлежащего контроля были использованы в этом исследовании, как формирование агрегатов siRNA неизбежны во время электропорации28. Процент инкапсуляции эффективности нашего метода очистки был рассчитан с помощью нормализованных значений для сведения к минимуму влияние из других источников, таких как фоновый шум, exosome и малых интерферирующих РНК агрегатов, влияющие на надежность данных. Основываясь на наших результатах, было незначительным siRNA агрегатов в управления образец т.е., используя electroporated и ООН electroporated siRNA.
Этот протокол успешно продемонстрировала инкапсуляции малых интерферирующих РНК в exosomes и их последующее внутриклеточных доставка малых интерферирующих РНК рака клеток в пробирке. Таким образом, различные виды exosomes от различных клеточных линий могут быть изолированы и характеризуется использованием предложенного протокола и впоследствии загружается с различных терапевтических siRNA для различных типов онкогенных цели чрезмерно выраженная в различных видов рака. Интересные приложения было бы исследовать эффективность доставки и поглощение siRNA с использованием различных комбинаций exosome источник цель клеток пара в пробирке. Это может быть переведено на животных моделей для оценки эффективности доставки и терапевтическую эффективность малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes в vivo.

Exosomes являются подтипом внеклеточного везикулы (EV), начиная от 50-200 Нм в диаметре, выделяемый различных типов клеток, таких как иммунные клетки1,2, раковые клетки3,4,5, 6 и стволовых клеток7. Exosomes, также было показано, присутствовать в различных физиологических жидкостях8,9,10,11. Сочетание присущих exosomes способность выполнять различные биомолекул (например, РНК и белков)12,,13-14 и эффективной доставки Эти биомолекулы в получателей клетки 15 , 16 , 17 привлекла интерес для их потенциал как нано-векторов доставки наркотиков. Различные маленькие молекулы, которые служат противораковых и противовоспалительные препараты проявили успешно загружаться в exosomes и доставлены целевых ячеек18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. интересно, что нуклеиновые кислоты как siRNA28,29 и микроРНК30 также были успешно загружены в exosomes через электропорации и доставлены к клеткам-мишеням.
Недавно РНК интерференции (RNAi) через малые интерферирующие РНК (siRNA) приобрел больше интереса как предпочтительный механизм подавления экспрессии гена из-за его высокой специфичности, мощным эффектом, минимальные побочные эффекты и простота малых интерферирующих РНК синтеза28, 29. малые интерферирующие РНК являются молекулы двуцепочечной РНК от 19 до 25 нуклеотидов в длину что триггеры последовательности конкретные каталитические мРНК нокдаун. Благодаря своей большой молекулярной массой и Полианионная природы пассивное поглощение голый интерферирующей РНК в клетки — препятствуют28,29. Это также не возможно для голый siRNA быть введены в кровообращения за счет быстрой деградации плазмы nucleases31. Таким образом инкапсуляции интерферирующей РНК в nanocarrier будет способствовать эффективной доставки и поглощение малых интерферирующих РНК в клетки-мишени.
Exosomes являются идеальной системой для инкапсуляции siRNA, как его структура состоит из полые, водный ядра, окруженная фосфолипидного бислой. Exosomes не только имеют хорошую стабильность в крови, но также имеют природные нацеливания свойств доставить функциональных РНК в клетки32. Исследование, проведенное Альварес-Эрвити et al. успешно продемонстрировал эффективной доставки интерферирующей РНК в мозг мышей с помощью инженерных exosomes с практически без осложнений31. Можно предположить, что на основе exosome терапия является относительно безопаснее, чем другие виды терапии, как exosomes эндогенно не реплицируются как клетки бы и поэтому не проявляют свойства метастатических15.
Различные методы, как сообщается, успешно изолировать exosomes из клеточной культуры или физиологические жидкости. Наиболее популярным методом использует ultracentrifugation для Пелле exosomes от начального материала31,32,33. Этот метод может быть довольно суровой на exosomes и, как правило, Сопредседатель преципитаты белков из образца. Сочетание ultracentrifugation с на основе плотности разделения например сахароза градиенты становится все более распространенным, чтобы уменьшить загрязнение протеина и не exosomal в изолированных exosomes19,34. Размер-гель-проникающей хроматографии (SEC) позволяет разделение exosomes от других видов внеклеточного везикулы (EV) по размеру и может также привести к минимальным белковых загрязнений, но ограничивается небольшое количество исходного материала, он может обрабатывать35, 36. Immunoaffinity захвата использует бисер покрытием с антителами, которые связывают с exosomal поверхности белки, например tetraspanins или других клеток конкретных маркер, позволяющий конкретные захвата exosomes, вместо того, чтобы EVs или другие белки, а также изоляция подгрупп населения в exosomes от всей образцов, но опять же ограничивается количество исходного материала и является дорогостоящим36,37. На полимерной основе осадков exosomes используется для быть популярным тоже, но так как это довольно сырой осадков, это приводит к более не exosomal везикул и белка загрязнение38,39.
Электропорация сообщалось за ее неэффективности как метод для загрузки exosomes с малых интерферирующих РНК за счет белков агрегации15,28,31. Подходы на основе трансфекции были продемонстрированы иметь лучше загрузки эффективность и стабильность белков, но нежелательно из-за своей токсичности и побочные эффекты трансфекции агентов в изменяя клеточных генов выражение28. Таким образом электропорация более широко использовался в siRNA загрузки в exosomes как это безопасный метод. Однако метод оптимизации Инкапсуляция необходимо быть создан для того, чтобы доставить достаточное количество малых интерферирующих РНК на целевой сайт для мощным генов нокдаун.
Здесь мы предлагаем exosome Протокол изоляции с помощью основанных на плотность ultracentrifugation на только один 25% (w/w) сахарозы подушке в окись дейтерия, вместо того, чтобы градиент плотности сахарозы. Это эффективный метод, который обходит градиента подготовка трудоемкий плотности и позволяет обрабатывать большие объемы исходного материала, но приводит к нетронутым exosomes высокой урожайностью и чистоты подходит для последующей загрузки с siRNA. Флуоресцентный конъюгированных Atto655 неспецифической siRNA была загружена в человеческих эмбриональных почек (клетки ГЭС-293) производные exosomes через электропорации и доставлен раковые клетки человеческого аденокарциномы поджелудочной железы (PANC-1) в пробирке.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated</td>
			<td>First Link</td>
			<td>08-05-850</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11090081</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101196X</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0140-01</td>
			<td>1 L; Particle Size 60 &#956;m-200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300096</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde/sulfate latex beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37304</td>
			<td>4% w/v, 4 &#181;m, 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0819-42</td>
			<td>Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 isotype (APC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4714-81</td>
			<td>&#160;Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-0098-41</td>
			<td>Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 isotype (FITC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-4714-41</td>
			<td>Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0639-41</td>
			<td>Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 isotype (PE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4714-81</td>
			<td>Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 &#181;l sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto655-siRNA</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; SQ-SIRNA</td>
			<td>(Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLine AD1000 bioreactor flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WCL1000ad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-out rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW45 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Type 70 Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355631</td>
			<td>Polycarbonate. Max. fill 32 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM10</td>
			<td>Software: NanoSight NTA v3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>FEI Electron Optics</td>
			<td>Philips CM 12</td>
			<td>with Tungsten filament and a Veleta - 2k &#215; 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector I</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>with Amaxa&#8217;s Nucleofector Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat-bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt fill needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td>18G x 1 1/2&#34; (1.2 mm x 40 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1156-6963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4&#176;C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 &#181;m filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% w/w sucrose cushion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.9 g (&#177; 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (&#177; 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% FBS/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M BSA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 &#181;M BSA solution. Make 5-10 &#181;l aliqouts of this 100 &#181;M BSA solution (for single use) and store them at -20&#176;C. All BSA solution should be stored at -20&#176;C, and discard solutions that have undergone &#8805;2 freeze-thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM glycine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid buffer with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% methanol/H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEC Column packed with Sepharose CL-2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of exosomes for sirna delivery to cancer cells

Внеклеточные везикулы, в частности exosomes, недавно получили интерес как роман наркотиков векторов доставки из-за их биологического происхождения, изобилия и внутренние возможности в межклеточных доставки различных биомолекул. Эта работа устанавливает Протокол изоляции для достижения высокой урожайности и высокой чистоты exosomes для доставки siRNA. Человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293 клетки) культивировали в биореакторе колбы и культуры супернатанта (расписка называют кондиционером среднего) собирают на еженедельной основе для обогащения exosomes ГЭС-293. Кондиционерами среднего (см) предварительно очищается от отмерших клеток и клеточных обломков, дифференциального центрифугирования и подвергается ultracentrifugation на подушке сахарозы последовал Стиральная шаг, чтобы собрать exosomes. Изолированные exosomes ГЭС-293 характерны для урожайности, морфология и exosomal маркер выражения анализа отслеживания наночастиц, белок количественной оценки, электронной микроскопии и проточной цитометрии, соответственно. Малые интерферирующие РНК (siRNA), дневно помечены Atto655, загружается в exosomes путем электропорации и избыток siRNA удаляется путем фильтрации геля. Поглощения клеток в раковые клетки PANC-1, после 24 ч инкубации при температуре 37 ° C, подтверждается проточной цитометрии. Exosomes ГЭС-293 являются 107.0 Нм ± 8.2 в диаметре. Коэффициент соотношения (аналогично) exosome урожайность и частица белка являются 6.99 ± 0,22 × 1012 частиц/мл и 8,3 ± 1,7 × 1010 частиц/мкг, соответственно. Инкапсуляция эффективность малых интерферирующих РНК в exosomes ~ 10-20%. Сорок процентов клеток Показать позитивные сигналы для Atto655 на 24 ч после инкубации. В заключение exosome изоляции по ultracentrifugation на подушке сахарозы предлагает сочетание чистоты и хороший урожай. малых интерферирующих РНК может быть успешно загружены в exosomes путем электропорации и впоследствии доставлены в раковые клетки в пробирке. Этот протокол предоставляет стандартную процедуру для развивающихся малых интерферирующих РНК загружен exosomes для эффективной доставки на раковые клетки.

Физико-химическая характеристика exosomes, изолированных от ГЭС-293 клеток (ГЭС-293 Exo) кратко изложены в таблице 1. Размер измеряется с помощью наночастиц, отслеживания инструмент анализа (НТА) был 107.0 Нм ± 8.2. Exosome доходность от ГЭС-293 клеток, также анализируются с помощью инструмента НТА, был 6.99 ± 0,22 x 1012 p/мл от ~ 24 мл см (полученные от 2 раунда сбора урожая). Чистота ГЭС-293 Exo оценены путем расчета коэффициента частиц белка (аналогично) был 8,3 ± 1,7 × 1010 p/мкг.
Распределение по размерам изолированных ГЭС-293 Exo показано на рисунке 3A. Морфологический анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) показали ГЭС-293 Exo сферических структуры слегка выше 100 Нм в размер (рис. 3B). Этот результат соглашается с этим НТА измерения (рис. 3A). Изолированные Exo ГЭС-293 были положительными CD81, CD9 и CD63, которые являются канонические маркеров, используемый для идентификации везикулы как exosomes (рис. 3 c).
Для очистки exosomes, используя размер гель-проникающей хроматографии (рис. 4) процент восстановления exosomes был рассчитан путем деления числа частиц всего exosome, в 10 фракций собранных (F0-F9) с начальной exosome количество частиц используется, в то время как процент восстановления интерферирующей РНК была рассчитана путем деления всего флуоресценции интенсивности, полученные от F3, F4 и F5 с интенсивностью всего флуоресценции, полученные из всех 10 фракций собраны. Восстановление exosome и малых интерферирующих РНК после очистки была рассчитана как 75,0% и 80,4%, соответственно. Инкапсуляция эффективность малых интерферирующих РНК в exosomes был ~ 10-20%, рассчитанных с использованием малых интерферирующих РНК калибровочной кривой установлены (Рисунок 4 c).
Качественный анализ в vitro поглощения exosomes загружен с флуоресцентной Atto655-siRNA подачей cytometry показали, что клетки PANC-1, лечение с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes записан крупнейший сдвиг в флуоресценции сигнала (Рисунок 5A) . PANC-1 клетки, лечение с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes Записанная более высокий процент населения позитивного для Atto655 сигнала (39,4%), по сравнению с что лечить смесью выгрузки exosomes и малых интерферирующих РНК (0.56%), который подтверждает замечание выше ( Рисунок 5B). Степень клеточного поглощения малых интерферирующих РНК (выражается как раз разница в средней флуоресценции значения интенсивности (MFI) от того необработанных клеток) было также отмечено будет значительно выше в PANC-1 клетках, обработанных с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes (раза МФИ разница = 5.1) по сравнению с с exosome-siRNA смесь (МРИ сложите разницы = 1.1) (рис. 5 c). Эти наблюдения показали, что малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes были внутреннюю клетками PANC-1 и что они фактически доставлены siRNA внутриклеточно.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig3.jpg"> Рисунок 3: биохимические и анализа морфологии ГЭС-293 exosomes. (A) размер распределение exosomes ГЭС-293 с помощью наночастиц отслеживания анализа (НТА). Кривая показывает гистограмму отрываться от 3 различных захватывает интервалом 30 s с красной области, обозначающий стандартное отклонение между измерениями (n = 3). (B) передача электронной микроскопии (ТЕА) образы наивно exosomes ГЭС-293. Линейки: 100 Нм. (C) обнаружения маркеров exosomal CD81, CD9 и CD63 с помощью проточной цитометрии на exosomes ГЭС-293. Exosomes были соединены к альдегид/сульфат латексные шарики до обнаружения. Комплекс Exosome бусы были впоследствии витражи с Флюорофор конъюгированных антител анти CD81, анти CD9 и анти CD63. Степени экспрессии маркеров выражаются как раз разница в значениях интенсивности (МРИ) средний флуоресценции от этого элемента управления (exosome бисер комплекс витражи с соответствующими изотипа). Значения выражаются как означает ± SD, где n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig4.jpg"> Рисунок 4: Exosome очистки пост электропорация. (A) профилями элюции (F0-F9) Atto655-siRNA и electroporated exosomes, с помощью исключения chormatography размер. (B) НТА анализ Atto655-siRNA и exosome от F0 до F9, с помощью исключения chormatography размер. (C) калибровочной кривой Atto655 помечены siRNA. Интенсивностью флюоресценции были получены путем пластины читателя в Ex / Em: 640-10/680 Нм; Получите 2800. Значения выражаются как означает ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58814/58814fig5.jpg"> Рисунок 5: клеточного поглощения малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes в клетки PANC-1 на 4 ч. (A) гистограммы, сравнивая клеточного поглощения выгрузки exosomes + смесь siRNA и малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes. (B) сравнение поглощение выгрузки exosomes + смесь малых интерферирующих РНК в 4 ч в псевдоцветном сюжет. (C) раза разница в виду флуоресцирования (MFI) значения интенсивности исследованных образцов по сравнению с необработанными клеток. Значения выражаются как означает ± SD, где n = 3. P < 0,001. NS: не значительные. Односторонний дисперсионный анализ был использован для статистического анализа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58814/58814fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exosome</td>
			<td>Размер1,2 (Нм)</td>
			<td>Урожайность1,2,3 (p/мл)</td>
			<td>[Белка] 2,4 (мкг/мл)</td>
			<td>Частицы белка (аналогично) соотношение5 (p/мкг)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЭС-293</td>
			<td>107.0 ± 8.2</td>
			<td>6.99 ± 0,22 x 1012
</td>
			<td>84.3 ± 9,8</td>
			<td>8.3 ± 1,7 x 1010 </td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
1 измеряется с помощью наночастиц, отслеживания анализа (НТА инструмент) 2 значения выражаются как означает ± SD, где n = 3 3 выход был получен средой клеток кондиционером, объединить 2 раундов заготовки из фляги биореактора (~ 24 мл) 4 измеряется с помощью комплекта assay протеина 5 значение, полученное с помощью формулы: аналогично коэффициент = выход / [белка]</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Физико-химическая характеристика exosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells at JoVE.com

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток

Exosome представляет новое поколение перевозчиков поставки наркотиков. Мы создали exosome Протокол изоляции с высокой урожайностью и чистоты для доставки siRNA. Мы также инкапсулировать дневно помечены неспецифической малых интерферирующих РНК в exosomes и исследованы клеточного поглощения малых интерферирующих РНК загружен exosomes в раковых клетках.

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Сбор экзосомы обогащенной кондиционированной среды из клеток, обучтенный в биореакторных колбы и изоляции сахарозной подушкой ультрацентрифугации, приводит к экзосомной подготовке высокой урожайности с минимальными загрязняющими белками или не экзосомными пузырьками. Использование одной подушки сахарозы, приготовленной в оксиде дейтерия, обходит трудоемкий препарат градиента сахарозы и уменьшает количество сахарозы, необходимое для достижения необходимой плотности. Эффективная экстракорпоральная доставка siRNA инкапсулирует в экзосомах, подготовленных в этом протоколе подчеркивает потенциал этой системы в качестве нового поколения РНК-интерференционной терапии рака поджелудочной железы.Начнем с того, что культура HEK-293 клетки в нормальной среде, как описано в рукописи. Расширьте клетки на четыре колбы T75 и расти до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния. Чтобы подготовить биореакторную колбу, добавьте от 50 до 100 миллилитров нормальной среды в средний резервуар колбы биореактора, чтобы промокнуть мембрану.Соберите все клетки HEK-293 из четырех колб T75 и повторно посовещите их в 15 миллилитров экзосомы истощенной среды в центрифуге трубки. Затем используйте 20-миллилитровый шприц, подключенный к тупой игле, чтобы аккуратно добавить эту клеточную подвеску в клеточный отсек биореакторной колбы. Затем заполните средний резервуар колбы биореактора нормальной средой, до 500 миллилитров, и инкубировать его при 37 градусах Цельсия, 5%CO2 в течение недели.После одной недели инкубации, удалить все среды из среднего резервуара биореактор колбы, выливая его. Используя 20-миллилитровый шприц, подключенный к тупой игле, удалите всю среду из клеточного отсека. Затем добавьте от 50 до 100 миллилитров нормальной среды в средний резервуар и 15 миллилитров свежей экзосомно истощенной среды в клеточный отсек с помощью 20-миллилитрового шприца, подключенного к тупой игле заполнения.Затем заполните средний резервуар колбы биореактора нормальной средой до 500 миллилитров. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 в течение еще одной недели. Чтобы предварительно очистить собранную кондиционированную среду, центрифугировать ее при 500 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Перенесите супернатант в новую трубку и выбросьте гранулы. После повторения этого шага центрифугации с восстановленным супернатантом, восстановить супернатант снова и отказаться от гранул. Затем центрифуга восстанавливается супернатант на 2000 раз г в течение 15 минут и четыре градуса по Цельсию.Держите супернатант, и отбросить гранулы. Фильтр супернатант один раз через 22-микрометровый фильтр, прикрепленный к 20-миллилитровому шприцу, в свежую центрифугу. Между тем, чтобы подготовить 25% раствор сахарозы в оксиде дейтерия, точно вывесить 1,9 грамма сахарозы в универсальной трубке.Затем добавьте оксид дейтерия, пока вес не достигнет 7,6 грамма. Затем заполните ультрацентрифугную трубку 22,5 миллилитров предварительно очищенной кондиционированной среды. Поместите стеклянную пипетку в трубку.Добавьте три миллилитров раствора сахарозы через пипетку так, чтобы раствор образует отдельный слой под условным носителем. Аккуратно поместите трубку, содержащую многослойный условный раствор средней/сахарозы, в ведро ротора. Закрести ведро в роторе.Поместите ротор в ультрацентрифуг, и спина на 100000 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 1,5 часов. Соберите два миллилитров слоя сахарозы из трубки, один миллилитр за один раз с помощью P1000 пипетки, с его кончиком прилагается к 10-микролитр отзыв, и добавить его в ультрацентрифуг бутылку, содержащую 20 миллилитров фильтрованных PBS для мытья. Поместите трубку в ротор с фиксированным углом и центрифуга на 100 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 1,5 часов.Используйте 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант. Повторное распределение гранул с 400 микролитров фильтрованных PBS. Перед началом электропорации, предварительно охладить электропорации cuvette на льду в течение 30 минут.Смешайте семь микрограммов экзосом с 33 микрограммами siRNA в микроцентрифугной трубке. Добавьте буфер лимонной кислоты для достижения объема в 150 микролитров. Добавить экзосому-siRNA смесь электропорации cuvette с помощью пластиковой пипетки, и крышка cuvette.Поместите кювет в правильную ориентацию в держатель кювета электропоратора и поверните поворотное колесо электропоратора на 180 градусов по часовой стрелке. Выберите нужную программу и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать электропорацию. Дисплей будет указывать на успешный пульс.Затем поверните колесо на 180 градусов против часовой стрелки и удалите кювет. Используйте пластиковую пипетку, чтобы удалить образец из кювета в новую трубку микроцентрифуга. Держите трубку на льду или в холодильнике перед дальнейшей обработкой, если не использовать немедленно.Чтобы начать свободное удаление siRNA, пройти 3,5 миллилитров фильтрованных PBS через столбец хроматографии размера дважды, чтобы уравностороть его. Затем растворите 150 микролитров электропотерного образца в 350 микролитров фильтрованных PBS и перенесите их в колонку SEC. Соберите первую 500-микролитровую фракцию, вытертую из колонны в трубку микрофуза, и отметь ее как F0. Затем добавьте в столбец 500 микролитров фильтрованного PBS.Соберите следующую фракцию и отметь ее как F1. Повторите добавление PBS и сбор фракций элюции до тех пор, пока в общей сложности 10 500-микролитровых фракций, или до F9, не будет собрано. Наконец, чтобы удалить остатки образцов, помойте столбец фильтрованным PBS по крайней мере дважды, а затем продолжить эксперименты, как описано в рукописи. Морфологический анализ с использованием электронной микроскопии передачи показал, что экзосомы HEK-293 были сферическими структурами, немного большими, чем 100 нанометров.Этот результат согласен с тем, что от наночастиц отслеживания анализа измерения, который также показал распределение размера экзосом. Кроме того, они были положительными для экзосомных маркеров CD81, CD9 и CD63. Процентное восстановление экзосом, очищенных с помощью хроматографии исключения размера, и процентное восстановление siRNA были рассчитаны, как описано в рукописи.После очистки восстановления экзосомы было 75% Использование siRNA стандартной кривой, инкапсуляция эффективность siRNA в экзосомы было рассчитано, чтобы быть около 10 до 20% Поток цитометрии качественный анализ поглощения в пробирке экзосомы загружены флуоресцентными Atto655-siRNA показали, что PANC-1 клетки, обработанные siRNA-encapulated exosomes был самый большой в сдвиге. Это было подтверждено выводом о том, что клетки PANC-1, обработанные инкапсулированными экзосомами siRNA, зафиксировали более высокий процент положительного населения для сигнала Atto655 по сравнению с теми, которые обрабатываются выгруженными экзосомами и смесью siRNA. Клеточное поглощение siRNA было также значительно более высоко в клетках PANC-1 обработанных siRNA-инкапсулированными exosomes сравненными с тем обработано с смесью exosome-siRNA, подтверждая что siRNA-инкапсулированные exosomes были интернализированы клетками PANC-1 и что они эффективно поставляют siRNA внутриклеточно.Важно очень точно взвесить сахарозу и оксид дейтерия при подготовке раствора сахарозы и всегда использовать свежеприготовленный раствор сахарозы, чтобы избежать изменения плотности во время хранения. Конфокаленная микроскопия может быть проведена для дальнейшей проверки интернализации siRNA инкапсулированных в экзосомах в клетки и изучения его внутриклеточной торговли после клеточного поглощения. Этот протокол позволяет нам оценить ген-специфический нокдаун siRNA поставленный exosome и служит как инструмент для новой проверки цели в ТЕРАПИИ рака RNA interference-основанной.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Вирус доставки ТРИФОСФАТЫ руководств для мышиных простаты для изменения гена

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

В естественных условиях Доставка генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши посредством внутрипротоковой инъекции молочной железы

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (Video) | JoVE

Мультиомный анализ TMEM200A как панракового биомаркера

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

Перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в плюрипотентность

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines

Transfection of TMEM200A siRNA in Stomach Adenocarcinoma Cell Lines (Video) | JoVE 

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells

Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells (Video) | JoVE 

Количественное определение мРНК в TMEM200A трансфицированных клетках аденокарциномы желудка миРНК