Name: assaying for inorganic polyphosphate in bacteria
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00
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Ce projet a été soutenu par l’Université de l’Alabama au fonds de démarrage de Birmingham département de microbiologie et NIH grant R35GM124590 (à MJG) et NIH subvention R01AI121364 (FW).

1. purification de levure Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Transformer la souche de la surexpression de protéines Escherichia coli BL21 (de3)31 avec le plasmide pScPPX26 par électroporation32 ou33de la transformation chimique.</li>
	<li>Ensemencer 1 L de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µg, ampicilline des-1 mL dans une fiole débafflé 2 L avec une seule colonie de BL21 (de3) contenant pScP...

Le protocole décrit ici simplifie et accélère la quantification des niveaux de polype dans diverses bactéries, avec un ensemble typique de 24 échantillons prenant environ 1,5 h à traiter entièrement. Cela permet le dépistage rapide des échantillons et l’analyse des bibliothèques mutantes et simplifie les expériences cinétiques mesurant l’accumulation de polype au fil du temps. Nous avons démontré que le protocole fonctionne efficacement sur les représentants de trois différents phyla : proteobacteria...

Polyphosphate inorganique (polype) est un biopolymère linéaire d’unités de phosphate lié à phosphoanhydride que l'on retrouve dans tous les domaines de la vie1,2,3. Diverses bactéries, polype est essentiel pour la réponse au stress, motilité, la formation de biofilm, contrôle du cycle cellulaire, la résistance aux antibiotique et virulence4,5,6,7,8 ,9,10,11. Études du polype métabolisme chez les bactéries ont donc la possibilité de déboucher sur des connaissances fondamentales sur la capacité des bactéries causent la maladie et se développent dans divers environnements. Dans de nombreux cas, toutefois, les méthodes permettant de quantifier polype dans les cellules bactériennes sont un facteur limitant dans ces études.
Il y a plusieurs méthodes actuellement utilisées pour mesurer les niveaux de polype en matières biologiques. Ces méthodes impliquent généralement deux étapes distinctes : extraction de polype et quantifier le polype présent dans ces extraits. La méthode actuelle de l’étalon-or, développé pour la levure Saccharomyces cerevisiae par Bru et ses collègues12, polype extraits ainsi que l’ADN et l’ARN à l’aide de phénol et de chloroforme, suivie par précipitation à l’éthanol, le traitement par désoxyribonucléase (DNase) et ribonucléase (RNase) et la digestion du polype purifiée obtenue avec le S. cerevisiae dégradant le polype enzyme exopolyphosphatase (ScPPX)13 à céder gratuitement phosphate, qui est ensuite quantifié à l’aide une Malachite verte essai reposant sur la colorimétrie. Cette procédure est très quantitative, mais fastidieux, limitant le nombre d’échantillons qui peuvent être traitées dans une expérience simple, n’est pas optimisé pour les échantillons bactériens. D’autres ont rapporté extraction polype d’une variété de cellules et de tissus à l’aide de perles de silice (« glassmilk ») ou silice membrane colonnes6,14,15,16,17, 18. Ces méthodes ne retirer pas efficacement à chaîne courte polype (moins de 60 unités de phosphate)12,14,15, bien que cela soit moins préoccupante pour les bactéries, qui sont généralement réputés pour synthétiser principalement polype de longue chaîne3. Anciennes méthodes d’extraction de polype à l’aide d’acides forts19,20 sont n’est plus largement utilisés, étant donné que le polype est instable sous conditions acides12.
Il existe également une variété de méthodes déclarées pour quantifier polype. Parmi les plus courantes est 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent plus généralement utilisé pour colorer les ADN. DAPI-polype complexes ont des maxima d’excitation et d’émission de fluorescence différente que DAPI-ADN complexes21,22, mais il y a beaucoup d’autres composants cellulaires, y compris les ARN, nucléotides et inositol phosphates12,15,16,23, réduisant la spécificité et la sensibilité des mesures de polype effectuées à l’aide de cette méthode. Alternativement, les polypes et adénosine diphosphate (ADP) peuvent être convertis en adénosine triphosphate (ATP) à l’aide de purifiée Escherichia coli kinase polype (PPK) et l’ATP qui en résulte, quantifiée à l’aide de la luciférase14,17 ,,18. Cela permet la détection de très petites quantités de polype, mais nécessite deux étapes de la réaction enzymatique et luciférine et ADP très pure, qui sont des réactifs coûteux. ScPPX spécifiquement digestions polype en phosphate libre6,12,13,24, qui peut être détectée par des méthodes plus simples, mais ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN12, nécessitant un traitement DNase et RNase polype contenant des extraits. PPK ni ScPPX sont disponibles dans le commerce, et purification de PPK est relativement complexe25,26.
Polype dans les lysats cellulaires ou des extraits aussi peut être visualisée sur gel de polyacrylamide par DAPI27,28,29,30, une méthode qui permet l’évaluation de la longueur de la chaîne, mais est une coloration négatif bas-débit et mal quantitative.
Nous rapportons un dosage de polype moyen débit, peu coûteux et rapide qui permet la quantification rapide de polype niveaux chez diverses espèces bactériennes. Cette méthode commence par la lyse des cellules bactériennes à 95 ° C en 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 pour inactiver des phosphatases cellulaires, suivies d’une extraction de colonne silice membrane optimisée pour le traitement rapide des échantillons multiples. L’extrait contenant du polype qui en résulte est ensuite digéré avec un grand excès de ScPPX, éliminant le besoin de traitement DNase et RNase. Nous incluons un protocole pour simple purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX. Enfin, phosphate libre dérivé de polype est quantifié avec un dosage colorimétrique simple, sensible, à base d’acide ascorbique24 et normalisée à total des protéines cellulaires. Cette méthode simplifie la mesure de polype dans des cellules bactériennes, et nous montrer son utilisation avec des espèces représentatives des bactéries à gram négatif, bactéries gram-positives et mycobactéries.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pScPPX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112877</td>
			<td>available to academic and other non-profit institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-2</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250500</td>
			<td>for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6070106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI88700</td>
			<td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 120 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-120</td>
			<td>other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap chelating HP column</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17040901</td>
			<td>any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC415611000</td>
			<td>for charging HiTrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 &#181;m pore size cellulose acetate syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-302-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667B</td>
			<td>other dialysis membranes with MWCO &#60; 30,000 Da should also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>for adjusting the pH of Tris-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS medium mixture</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic potassium phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0886-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M113-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine isothiocyanate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP221-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (protease-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear flat bottom 96-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td>any clear 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td>
			<td>Tecan, Inc.</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica membrane spin columns</td>
			<td>Epoch Life Science</td>
			<td>1910-050/250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9580154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antimony potassium tartrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1088922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 N sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1376630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC401471000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying for inorganic polyphosphate in bacteria

Polyphosphate inorganique (polype) est un polymère biologique dans les cellules de tous les domaines de la vie et est exigé pour la virulence et la réponse au stress chez les nombreuses bactéries. Il existe une variété de méthodes de quantification polype en biomatériaux, dont beaucoup sont fastidieuses ou insensible, limitant leur utilité. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la quantification des polypes chez les bactéries, en utilisant une extraction de colonne silice membrane optimisée pour un traitement rapide de plusieurs échantillons, digestion du polype avec le polype spécifiques exopolyphosphatase ScPPX et la détection de la phosphate de libre qui en résulte avec un dosage colorimétrique sensible-à base d’acide ascorbique. Cette procédure est simple, peu coûteux et permet la quantification fiable polype dans diverses espèces de bactéries. Nous présentons la quantification de polype représentatifs de la bactérie à gram négatif (Escherichia coli), la bactérie Gram-positive lactiques (Lactobacillus reuteri) et les espèces de mycobactéries (Mycobacterium smegmatis). Nous incluons également un protocole simple pour la purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX, qui n’est pas actuellement disponible dans le commerce.

Les étapes clés du protocole sont schématisés sous une forme simplifiée de la Figure 1.
Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-négatives, sauvage, e. coli MG165539 a été passé à la phase logarithmique en milieu riche LB à 37 ° C sous agitation (200 tr/min), puis rincé et incubées pendant 2 h supplémentaires dans morphol...

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Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Nous décrivons une méthode simple pour la quantification rapide de polyphosphate inorganique dans diverses bactéries, y compris les espèces Gram négatifs, bactéries gram-positives et mycobactériennes.

Dosage de Polyphosphate inorganique chez les bactéries

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

Le polyphosphate inorganique est un élément clé de la réponse au stress bactérien. Mais les méthodes plus anciennes pour extraire et mesurer le polyP chez les bactéries sont complexes et à forte intensité de main-d’œuvre. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification rapide, sensible et peu coûteuse des niveaux de polyP chez une variété d’espèces bactériennes différentes.La procédure sera démontrée par Arya Pokhrel, une étudiante de premier cycle de mon laboratoire. Pour commencer, cultiver des bactéries lactobacillus reuteri dans le milieu d’induction enzymatique malique sans cystine à 37 degrés Celsius pendant la nuit sans trembler. Centrifugeuse d’un millilitre de cette culture nocturne dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour récolter suffisamment de cellules pour produire un total de 50 à 100 microgrammes de protéines cellulaires.Retirez complètement le supernatant de la pastille cellulaire, puis ajoutez 250 microlitres gitc lysis tampon et résuspendez par vortex. Incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour lyse les cellules. Conserver le lysate à 80 degrés Celsius.Tout d’abord, préparez des normes BSA contenant zéro, 1, 2 et 4 milligrammes par millilitre de BSA dans le tampon de lyse GITC. Aliquot cinq microlitres de lysates cellulaires décongelés et bien mélangés et cinq microlitres des normes BSA pour séparer les puits dans une plaque de puits claire de 96. Ajouter 195 microlitres de réaccent de Bradford à chaque puits et mesurer l’absorption à 595 nanomètres dans un lecteur de plaques.Calculez la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe standard BSA telle qu’elle est décrite dans le manuscrit. Pour déterminer la quantité totale de protéines dans chaque échantillon, multipliez la valeur résultante par 05. Pour commencer l’extraction du polyphosphate, ajouter 250 microlitres de 95 % d’éthanol à chaque échantillon lysé gitc, et vortex à mélanger.Pipette ce mélange à une colonne de spin de la membrane de silice placée dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 16,100 g pendant 30 secondes. Jetez le débit et ajoutez 750 microlitres du mélange tris-hydrochlorure, chlorure de sodium, EDTA et éthanol.Centrifugeuse à 16,100 gs pendant 30 secondes. Jeter le flux à travers et centrifuger la colonne de spin à 16, 100 gs pendant deux minutes. Placez la colonne dans un tube de microfuge propre de 1,5 millilitre.Ajouter 150 microlitres de 50 millimilliards de pH huit trichlorure, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Elute polyP en centrifugant à 8000 g pendant deux minutes. Commencez par préparer des normes contenant zéro, cinq, 50 ou 200 micromolaires de phosphate de potassium dans 50 millimolar pH huit trichlorure.Aliquot 100 microlitres de chaque norme de phosphate et 100 microlitres d’échantillons de polyP extraits dans des puits séparés d’une plaque de puits claire de 96 puits. Préparer un mélange principal contenant, par échantillon, 30 microlitres de tampon de réaction ScPPX 5X, 19 microlitres d’eau et un microlitre de ScPPX purifié. Ajouter 50 microlitres du mélange principal à chaque puits de la plaque de puits 96.Et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Le jour de la détection, préparez un nouveau stock de travail de solution de détection en mélangeant à 9,12 millilitres de base de solution de détection avec 88 millilitres d’un acide ascorbique molaire, et laissez-le venir à la température ambiante avant utilisation. Ajouter 50 microlitres de solution de détection à chaque échantillon et aux normes de la plaque de puits 96.Pour permettre le développement des couleurs, incuber la plaque à température ambiante pendant environ deux minutes. Utilisez un lecteur de plaques pour mesurer l’absorption à 882 nanomètres et calculer la concentration de phosphate de chaque échantillon par rapport à la courbe standard de phosphate de potassium. Convertissez ensuite les concentrations de phosphate en nanomoles de phosphate dérivé du polyP dans chaque lysate cellulaire et normalisez la teneur en polyP cellulaire en protéine cellulaire totale, comme décrit dans le manuscrit.E.coli de type sauvage, une bactérie gramnégative, cultivée en LB, n’a produit aucun polyP. Mais lorsqu’il est cultivé en MOPS, produit environ 192 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales. Un mutant ppk delta e.coli, qui manque de kinase polyP, n’a produit aucun polyP dans l’un ou l’autre médium.Un mutant delta ppx, qui manque d’exopolyphosphatase, a produit à peu près la même quantité de polyP que le type sauvage. Et le mutant delta phoB, défectueux dans le transport du phosphate, a produit beaucoup moins de polyP que le type sauvage. L.reuteri de type sauvage, une bactérie gram-positive cultivée du jour au lendemain dans le milieu meic accumulé environ 51 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales.Un mutant null L.reuteri ppk1 dépourvu de kinase polyP contenait moins de la moitié de cette quantité. Cette présence de polyP dans le mutant nul ppk1 est probablement due à L.reuteri contenant une deuxième kinase polyP. Mycobacterium smegmatis souche SMR cinq, cultivé dans hartmans-de Bont moyen en l’absence d’éthanol accumulé environ 141 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales.Alors que le traitement à l’éthanol a entraîné une triple augmentation. Après cette procédure, l’électrophoresis de gel d’acrylamide peut être exécuté pour évaluer des différences dans la longueur de chaîne de polyP. Tout en essayant cette procédure, éviter les erreurs courantes.N’oubliez pas d’éviter d’avoir des bulles dans les puits de plaques de microtiter, et veillez à transférer vos échantillons dans le tube approprié lors du passage de la colonne au tube de microfuge. N’oubliez pas que travailler avec gitc et acides forts peut être dangereux, et l’équipement de protection approprié doit toujours être porté tout en exécutant cette procédure.

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