Name: assaying for inorganic polyphosphate in bacteria
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00
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इस परियोजना के बर्मिंघम विभाग के माइक्रोबायोलॉजी स्टार्टअप फंड और NIH ग्रांट R35GM124590 (MJG को), और NIH अनुदान R01AI121364 (परिवार कल्याण के लिए) में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. शुद्ध खमीर Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>electroporation३२ या रासायनिक परिवर्तन३३द्वारा प्लाज्मिड pScPPX26 के साथ ई. कोलाई प्रोटीन व्यक्त तनाव BL21 (DE3)31 रूपांतरण ।</li>
	<li>lysogeny शोरबा के 1 एल Inoculate (पौंड) ?...

प्रोटोकॉल यहां वर्णित सरल और विभिंन बैक्टीरिया में जंतु स्तर के ठहराव में बढ़ौतरी, 24 नमूनों की एक विशिष्ट सेट के बारे में १.५ के बारे में लेने के लिए पूरी तरह से प्रक्रिया एच । यह नमूनों की तेजी से स्क्री?...

अकार्बनिक polyphosphate (जंतु)1,2,3जीवन के सभी डोमेन में पाया जाता है कि phosphoanhydride-लिंक्ड फॉस्फेट इकाइयों की एक रैखिक जैव बहुलक है । विविध जीवाणुओं में, जंतु तनाव प्रतिक्रिया, गतिशीलता, फिल्म गठन, सेल चक्र नियंत्रण, एंटीबायोटिक प्रतिरोध, और डाह4,5,6,7,8 के लिए आवश्यक है ,9,10,11. जीवाणुओं में जंतु चयापचय का अध्ययन इसलिए बैक्टीरिया की क्षमता में बुनियादी अंतर्दृष्टि उपज की क्षमता के लिए रोग का कारण है और विविध वातावरण में पनपे । कई मामलों में, तथापि, बैक्टीरियल कोशिकाओं में जंतु को बढ़ाता है के लिए उपलब्ध तरीकों इन अध्ययनों में एक सीमित कारक हैं ।
वहां कई वर्तमान में जैविक सामग्री में जंतु के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । इन पद्धतियों आम तौर पर दो अलग कदम शामिल: जंतु निकालने और उन निष्कर्षों में जंतु मौजूद बढ़ाता है । वर्तमान सोने के मानक विधि, द्वारा खमीर Saccharomyces cerevisiae के लिए विकसित बरू और सहयोगियों12, अर्क जंतु डीएनए और आरएनए के साथ साथ phenol और क्लोरोफॉर्म का उपयोग, इथेनॉल वर्षण के बाद, उपचार के साथ deoxyribonuclease (DNase) और ribonuclease (RNase), और एस cerevisiae जंतु अपमानजनक एंजाइम exopolyphosphatase (ScPPX)13 उपज के लिए नि: शुल्क फॉस्फेट, जो फिर एक का उपयोग कर quantified है के साथ परिणामी शुद्ध जंतु के पाचन मैलाकाइट ग्रीन आधारित वर्णमिति परख । इस प्रक्रिया को अत्यधिक मात्रात्मक लेकिन श्रम गहन है, नमूनों की संख्या है कि एक ही प्रयोग में संसाधित किया जा सकता है सीमित है, और जीवाणु नमूनों के लिए अनुकूलित नहीं है । दूसरों कोशिकाओं और सिलिका मोतियों का उपयोग ऊतकों की एक किस्म से निकालने जंतु की सूचना दी है ("glassmilk") या सिलिका झिल्ली कॉलम6,14,15,16,17, 18. इन तरीकों कुशलतापूर्वक लघु श्रृंखला जंतु (कम से ६० फॉस्फेट इकाइयों)12,14,15, हालांकि इस बैक्टीरिया है, जो आम तौर पर मुख्य रूप से संश्लेषित करने के लिए सोचा है के लिए कम चिंता का विषय है निकालने नहीं है लंबी श्रृंखला के जंतु3. जंतु निष्कर्षण मजबूत एसिड19,20 का उपयोग कर के पुराने तरीकों अब व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, के बाद से जंतु अंलीय12शर्तों के तहत अस्थिर है ।
वहां भी जंतु को बढ़ाता है के लिए रिपोर्ट तरीकों की एक किस्म है । सबसे आम में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), एक फ्लोरोसेंट डाई अधिक आम तौर पर डीएनए दाग के लिए इस्तेमाल किया है । DAPI-जंतु परिसरों में DAPI-डीएनए कॉम्प्लेक्स की तुलना में विभिन्न प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है21,22, लेकिन आरएनए, न्यूक्लियोटाइड, और inositol सहित अन्य सेलुलर घटकों से काफी हस्तक्षेप है 12,15,16,23फॉस्फेट, विशिष्टता और इस पद्धति का उपयोग कर बनाया जंतु माप की संवेदनशीलता को कम करने. वैकल्पिक रूप से, जंतु और adenosine diphosphate (ADP) adenosine ट्राइफॉस्फेट में परिवर्तित किया जा सकता है (एटीपी) का उपयोग कर शुद्ध ई कोलाई जंतु कळेनासे (PPK) और जिसके परिणामस्वरूप एटीपी quantified का उपयोग कर luciferase14,17 ,18. यह जंतु की बहुत छोटी मात्रा का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन दो एंजाइमी प्रतिक्रिया कदम की आवश्यकता है और दोनों luciferin और बहुत शुद्ध ADP, जो महंगे रिएजेंट हैं । ScPPX विशेष रूप से मुक्त फॉस्फेट6,12,13,24में जंतु पचा, जो सरल तरीकों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, लेकिन ScPPX डीएनए और आरएनए12से हिचकती है, necessitating DNase और जंतु-युक्त अर्क के RNase उपचार. न तो PPK और न ही ScPPX व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और PPK शुद्धि अपेक्षाकृत25,26जटिल है ।
सेल lysates या अर्क में जंतु भी DAPI नकारात्मकदाग27,28,29,30, एक विधि है कि श्रृंखला की लंबाई के आकलन की अनुमति करता है द्वारा polyacrylamide जैल पर visualized किया जा सकता है, लेकिन है कम प्रवाह और खराब मात्रात्मक ।
अब हम एक तेजी से, सस्ती, मध्यम प्रवाह जंतु परख कि विविध जीवाणु प्रजातियों में जंतु स्तर के तेजी से ठहराव की अनुमति देता है की रिपोर्ट । इस विधि से शुरू होता है lysing बैक्टीरियल सेल ९५ ° c में 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 सेलुलर phosphatases को निष्क्रिय करने के लिए, एक सिलिका झिल्ली स्तंभ निष्कर्षण द्वारा कई नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित. परिणामस्वरूप जंतु युक्त निकालने तो ScPPX के एक बड़े अतिरिक्त के साथ पच जाता है, DNase और RNase उपचार की जरूरत को नष्ट करने. हम ScPPX की मिलीग्राम की मात्रा का सीधा निकल अपनत्व शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल हैं । अंत में, जंतु व्युत्पंन मुक्त फॉस्फेट एक सरल, संवेदनशील, ascorbic एसिड आधारित वर्णमिति परख24 और कुल सेलुलर प्रोटीन को सामान्यीकृत के साथ quantified है । यह विधि बैक्टीरियल कोशिकाओं में जंतु के माप को सुव्यवस्थित करती है, और हम ग्राम-नकारात्मक जीवाणुओं, चने-पॉजिटिव बैक्टीरिया, और आइसोलेटों की प्रतिनिधि प्रजातियों के साथ इसके प्रयोग का प्रदर्शन करते हैं.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pScPPX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112877</td>
			<td>available to academic and other non-profit institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-2</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250500</td>
			<td>for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6070106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI88700</td>
			<td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 120 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-120</td>
			<td>other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap chelating HP column</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17040901</td>
			<td>any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC415611000</td>
			<td>for charging HiTrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 &#181;m pore size cellulose acetate syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-302-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667B</td>
			<td>other dialysis membranes with MWCO &#60; 30,000 Da should also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>for adjusting the pH of Tris-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS medium mixture</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic potassium phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0886-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M113-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine isothiocyanate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP221-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (protease-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear flat bottom 96-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td>any clear 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td>
			<td>Tecan, Inc.</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica membrane spin columns</td>
			<td>Epoch Life Science</td>
			<td>1910-050/250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9580154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antimony potassium tartrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1088922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 N sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1376630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC401471000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying for inorganic polyphosphate in bacteria

अकार्बनिक polyphosphate (जंतु) एक जैविक बहुलक जीवन के सभी डोमेन से कोशिकाओं में पाया जाता है, और कई बैक्टीरिया में डाह और तनाव प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है । जैविक सामग्री में जंतु को बढ़ाता है, जिनमें से कई या तो श्रम-गहन या असंवेदनशील हैं, उनकी उपयोगिता सीमित करने के लिए तरीकों की एक किस्म है । हम यहां बैक्टीरिया में जंतु ठहराव के लिए एक सुव्यवस्थित विधि, कई नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित एक सिलिका झिल्ली स्तंभ निष्कर्षण का उपयोग कर, जंतु के पाचन के साथ जंतु विशिष्ट exopolyphosphatase ScPPX, और का पता लगाने के लिए प्रस्तुत एक संवेदनशील ascorbic एसिड आधारित वर्णमिति परख के साथ मुक्त फॉस्फेट परिणामस्वरूप । यह प्रक्रिया सीधी, सस्ती है, और विविध जीवाणु प्रजातियों में विश्वसनीय जंतु ठहराव की अनुमति देता है । हम ग्राम-नकारात्मक जीवाणु (ई कोलाई), ग्राम पॉजिटिव लैक्टिक एसिड जीवाणु (लैक्टोबैसिलसreuteri), और माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियों (माइकोबैक्टीरियम smegmatis) से प्रतिनिधि जंतु ठहराव वर्तमान । हम भी ScPPX, जो वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है की मिलीग्राम की मात्रा के निकल अपनत्व शुद्धिकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल शामिल हैं ।

प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में चित्र 1में सरलीकृत रूप में diagrammed हैं ।
के लिए ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं के साथ इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, ?...

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Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

हम विविध जीवाणुओं में अकार्बनिक polyphosphate के तीव्र ठहराव के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें ग्राम-ऋणात्मक, चना-धनात्मक, और माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियाँ शामिल हैं.

बैक्टीरिया में अकार्बनिक Polyphosphate के लिए परख

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

बैक्टीरिया तनाव प्रतिक्रिया में अकार्बनिक पॉलीफॉस्फेट एक प्रमुख तत्व है। लेकिन बैक्टीरिया में पॉलीपी निकालने और मापने के लिए पुराने तरीके जटिल और श्रम-प्रधान हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह विभिन्न जीवाणु प्रजातियों की एक किस्म में पॉलीपी स्तर के तेज, संवेदनशील और सस्ती मात्राकरण की अनुमति देता है।इस प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला के स्नातक छात्र आर्य पोखरेल द्वारा किया जाएगा । शुरू करने के लिए, बिना किसी झटकों के रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सिस्टिन के बिना मैलिक एंजाइम प्रेरण माध्यम में लैक्टोबेसिलस रियूटेरी बैक्टीरिया उगाएं। एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में इस रातोंरात संस्कृति के एक मिलीलीटर पर्याप्त कोशिकाओं को फसल के लिए सेलुलर प्रोटीन के ५० से १०० माइक्रोग्राम की कुल उपज के लिए ।सेल पैलेट से सुपरनेट को पूरी तरह से निकाल दें और फिर 250 माइक्रोलीटर जीआईटीसी लाइसिस बफर और वर्सलपेंड को भंवर से जोड़ें। कोशिकाओं को लबालब करने के लिए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 80 डिग्री सेल्सियस पर lysate स्टोर करें।सबसे पहले जीआइसी लाइसिस बफर में बीएसए के शून्य, 1, 2 और 4 मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर वाले बीएसए मानक तैयार करें। अलीकोट गल के पांच माइक्रोलीटर, अच्छी तरह से मिश्रित सेल lysates और बीएसए मानकों के पांच माइक्रोलीटर एक स्पष्ट ९६ अच्छी तरह से थाली में कुओं को अलग करने के लिए । ब्रैडफोर्ड रिएजेंट के 195 माइक्रोलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें और एक प्लेट रीडर में 595 नैनोमीटर पर अवशोषित उपाय।पांडुलिपि में उल्लिखित बीएसए मानक वक्र की तुलना में प्रत्येक कुएं में प्रोटीन की मात्रा की गणना करें। प्रत्येक नमूने में प्रोटीन की कुल मात्रा निर्धारित करने के लिए, 05 से जिसके परिणामस्वरूप मूल्य गुणा। पॉलीफॉस्फेट निष्कर्षण शुरू करने के लिए, प्रत्येक जीआईडीसी lysed नमूने में 95% इथेनॉल के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए भंवर।इस मिश्रण को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में रखे सिलिका झिल्ली स्पिन कॉलम में पिपेट करें। 30 सेकंड के लिए 16, 100 ग्राम पर सेंट्रलाइज। प्रवाह को त्यागें और ट्राइस-हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम क्लोराइड, ईडीटीए और इथेनॉल मिश्रण के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें।16 पर सेंट्रलाइज, 30 सेकंड के लिए १०० जीएस । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और दो मिनट के लिए 16, 100 जीएस पर स्पिन कॉलम को अपकेंद्रित्र करें। कॉलम को साफ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रखें।50 मिलीमोलर पीएच आठ ट्राइस-हाइड्रोक्लोराइड के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। दो मिनट के लिए 8, 000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा एल्यूट पॉलीप। 50 मिलीमोलर पीएच आठ ट्राइस-हाइड्रोक्लोराइड में शून्य, पांच, 50, या 200 माइक्रोमोलर पोटेशियम फॉस्फेट वाले मानकों को तैयार करके शुरू करें।अलीकोट प्रत्येक फॉस्फेट मानक के 100 माइक्रोलीटर और निकाले गए पॉलीपी नमूनों के 100 माइक्रोलीटर एक स्पष्ट 96 अच्छी प्लेट के अलग कुओं में। एक मास्टर मिक्स तैयार करें, जिसमें प्रति सैंपल, 5X ScPPX रिएक्शन बफर के 30 माइक्रोलीटर, 19 माइक्रोलीटर पानी और शुद्ध ScPPX का एक माइक्रोलीटर शामिल करें। 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिक्स के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । पता लगाने के दिन, एक मोलर एस्कॉर्बिक एसिड के 88 मिलीलीटर के साथ डिटेक्शन सॉल्यूशन बेस के 9.12 मिलीलीटर पर मिलाकर डिटेक्शन सॉल्यूशन का एक नया काम स्टॉक तैयार करें, और इसे उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर आने की अनुमति दें। 96 अच्छी प्लेट में प्रत्येक नमूने और मानकों के लिए पता लगाने के समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।रंग विकास की अनुमति देने के लिए, लगभग दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट। 882 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें और पोटेशियम फॉस्फेट मानक वक्र की तुलना में प्रत्येक नमूने के फॉस्फेट एकाग्रता की गणना करें। फिर फॉस्फेट सांद्रता को प्रत्येक कोशिका में व्युत्पन्न फॉस्फेट के नैनोमोल्स में परिवर्तित करें और पांडुलिपि में वर्णित सेलुलर पॉलीपी सामग्री को कुल सेलुलर प्रोटीन में सामान्य करें।जंगली प्रकार ई. कोलाई, एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु, पौंड में उगाया कोई पॉलीप का उत्पादन किया । लेकिन जब MOPS में उगाया जाता है, तो कुल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम लगभग 192 नैनोमोल्स पॉलीपी का उत्पादन किया। एक ई. कोलाई डेल्टा पीपीके उत्परिवर्ती, जिसमें पॉलीपी किनेज़ का अभाव है, ने या तो माध्यम में कोई पॉलीपी का उत्पादन नहीं किया।एक डेल्टा पीपीएक्स उत्परिवर्ती, जिसमें एक्सोपोलिनोफोफैस्टेस का अभाव है, ने लगभग समान मात्रा में पॉलीपी का उत्पादन किया है। और डेल्टा फोब उत्परिवर्ती, जो फॉस्फेट परिवहन में दोषपूर्ण है, ने जंगली प्रकार की तुलना में काफी कम पॉलीप का उत्पादन किया। वाइल्ड-टाइप एल. रियूटेरी, एमईआईसी माध्यम में रातोंरात उगाए जाने वाले ग्राम-सकारात्मक जीवाणु कुल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम लगभग 51 नैनोमोल्स पॉलीपी जमा होते हैं।एक L.reuteri ppk1 नल उत्परिवर्ती की कमी पॉलीपी kinase आधे से भी कम इस राशि निहित । ppk1 अशक्त उत्परिवर्ती में पॉलीपी की यह उपस्थिति शायद एल.रियूटेरी के कारण है जिसमें दूसरी पॉलीपी किनेज़ होती है। माइकोबैक्टीरियम स्मेग्मेटिस तनाव एसएमआर पांच, हार्टमैंस-डी बोंट माध्यम में इथेनॉल के अभाव में कुल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम प्रति 141 नैनोमोल्स पॉलीपी जमा हो गया।जबकि इथेनॉल उपचार के परिणामस्वरूप तीन गुना वृद्धि हुई। इस प्रक्रिया के बाद, पॉलीपी चेन लंबाई में अंतर का आकलन करने के लिए एक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, आम गलतियों से बचें।माइक्रोटिटर प्लेट कुओं में बुलबुले प्राप्त करने से बचने के लिए याद रखें, और कॉलम से माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्विच करते समय अपने नमूनों को उचित ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए सावधान रहें। यह न भूलें कि जीईटीसी और मजबूत एसिड के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को करते समय उचित सुरक्षा उपकरण हमेशा पहने जाने चाहिए।

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