Name: assaying for inorganic polyphosphate in bacteria
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00
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このプロジェクトは、バーミンガム講座スタートアップ資金および NIH グラント R35GM124590 (MJG) に NIH グラント R01AI121364 (FW) にアラバマ大学によって支えられました。

1. 浄化酵母 Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>エレクトロポレーション32または33化学変換によって大腸菌蛋白質過剰発現株プラスミド pScPPX26 BL21(DE3)31を変換します。</li>
	<li>BL21(DE3) pScPPX2 を含む単一コロニーを 2 L ないフラスコ 100 μ g mL-1アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) の 1 L を接種して 600 で吸光度...

ここで説明されているプロトコルは、簡素化、24 サンプル処理に約 1.5 時間を取っての典型的なセットを持つ多様な細菌のポリープ レベルの定量化を加速します。これはサンプルの迅速なスクリーニングと変異ライブラリ解析が可能、簡単に時間をかけてポリープの蓄積を測定の実験。プロトコルが 3 つ門の代表者で効果的に動作することを実現した: フィルミクテス門、プロテオ バクテリ?...

無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性4,5,6,7,8 ,9,10,11。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。
現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用するいくつかの方法があります。これらのメソッドは通常 2 つの明瞭なステップを含む: それらの抽出物でポリープを抽出し、ポリープを定量化を提示します。Bru と同僚で12フェノールを使用する RNA と DNA 抽出ポリープ酵母酵母として開発した現在の金本位法、クロロホルム、エタノールの沈殿物、治療が続く出芽酵母ポリープ分解酵素 exopolyphosphatase (ScPPX)13を使用して定量化は、フリーのりん酸塩を生成するために結果として得られる精製ポリープの消化およびリボヌクレアーゼ (RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase)、マラカイト グリーンを用いた比色定量法。この手順は、非常に数量が、労働集約的な単一の実験で処理することができ、細菌性のサンプルのために最適化されていませんするサンプルの数を制限することです。他の人はさまざまな細胞や組織をシリカビーズ ("glassmilk") またはシリカ膜列6,14,15,16,17を使用してからポリープを抽出を報告しています。 18。これは主に合成と一般的に考えられている細菌をそれほど考慮これらのメソッドは効率的に短鎖ポリープ (未満 60 リン酸単位)12,14,15, を抽出できません。長鎖ポリープ3。強い酸19,20を使用してポリープ抽出のより古い方法はもはや広く利用されてポリープは酸性条件12の下で安定しているので。
また、さまざまな定量化ポリープの報告方法があります。最も一般的なの間では 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 蛍光色素の詳細は通常、DNA を染色に使用です。DAPI ポリープ錯体 DAPI DNA 複合体21,22より異なる蛍光励起と放射マキシマが RNA、ヌクレオチド、イノシトールなど他の細胞部品からかなりの干渉があります。リン酸塩12,15,16,23, 特異性とこのメソッドを使用してポリープ測定の感受性を減らします。ポリープとアデノシン二リン酸 (ADP) をアデノシン三リン酸 (ATP) を精製した大腸菌を使用してに変換する代わりに、ポリープのキナーゼ (PPK) およびルシフェラーゼ14,17 を用いて定量化結果 ATP ,18。これはポリープの非常に少量の検出が可能、2 つの酵素反応ステップ ルシフェリンと非常に純粋な ADP は、高価な試薬であるが必要です。ScPPX フリーのりん酸塩6,12,13,24、簡単な方法、しかし ScPPX を使用して検出することができますに特にダイジェスト ポリープは DNA および RNA の12によって阻害されます。ポリープを含む必要と DNase、RNase 処理を抽出します。PPK も ScPPX も市販と PPK の浄化は比較的複雑な25,26。
DAPI 染色27,28,29,30、チェーン長さの評価を許可して、メソッドは負で、セル lysates または抽出物でポリープのポリアクリルアミドゲルで視覚化できるも低スループットと低い定量。
我々 は今多様な細菌種のレベル ポリープの急速な定量化を可能にする安価な高速、中速のポリープ アッセイを報告します。このメソッドは、複数のサンプルの迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出に続いて携帯電話のホスファターゼを不活化する 95 ° c 4 M グアニジン イソチオ シアン酸 (GITC)14で細菌細胞の分離によって開始します。得られたポリープを含む抽出液は、DNase、RNase の治療の必要性を排除する ScPPX の大過剰と消化されます。ScPPX の mg 量の簡単なニッケル親和性の浄化のためのプロトコルが含まれます。最後に、ポリープ由来フリーのりん酸塩は、単純な敏感なアスコルビン酸ベースの比色定量法24の定量化し、総細胞蛋白質に正規化します。このメソッドは、細菌細胞、ポリープの測定を合理化し、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌の代表種でその使用を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pScPPX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112877</td>
			<td>available to academic and other non-profit institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-2</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250500</td>
			<td>for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6070106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI88700</td>
			<td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 120 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-120</td>
			<td>other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap chelating HP column</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17040901</td>
			<td>any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC415611000</td>
			<td>for charging HiTrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 &#181;m pore size cellulose acetate syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-302-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667B</td>
			<td>other dialysis membranes with MWCO &#60; 30,000 Da should also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>for adjusting the pH of Tris-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS medium mixture</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic potassium phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0886-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M113-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine isothiocyanate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP221-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (protease-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear flat bottom 96-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td>any clear 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td>
			<td>Tecan, Inc.</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica membrane spin columns</td>
			<td>Epoch Life Science</td>
			<td>1910-050/250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9580154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antimony potassium tartrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1088922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 N sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1376630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC401471000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying for inorganic polyphosphate in bacteria

無機ポリリン酸 (ポリープ) は、生活のすべてのドメインからの細胞は、生体高分子を病原性および多くの細菌のストレス反応に必要です。さまざまな労働集約的なまたは小文字を区別しない、その有用性を制限することは、多くの生体物質の定量化のポリープの方法があります。我々 提示ここで細菌、ポリープの定量化のための合理化された方法複数サンプルがあり、ポリープ固有 exopolyphosphatase ScPPX とポリープの消化および検出の迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出を使用して、敏感なアスコルビン酸ベースの比色試金とフリーのりん酸塩を生じる。このプロシージャは簡単、安価で、し多様な菌種で、信頼性の高いポリープ定量化。グラム陰性細菌 (大腸菌)、乳酸グラム陽性細菌 (乳酸菌ロイテリ) 抗酸菌種 (アラビノースイソメラーゼ) から代表的なポリープ定量化を提案します。私たちもこれは現在市販されていない ScPPX、mg 量のニッケル親和性の浄化のための単純なプロトコルを含まれます。

プロトコルの主な手順は、図 1の単純な形で立てます。
グラム陰性菌、野生型大腸菌にこのプロトコルの使用を示すため MG165539だった LB (200 rpm) の揺れで 37 ° C で豊富な培地の中間ログ段階に成長して、洗浄し、でさらに 2 時間インキュベートmorpholinopropanesulfonate バッファー ...

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Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

多様な細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌種を含むポリリン酸の迅速定量のための簡単な方法について述べる。

無機ポリリン酸の細菌のための試金

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

無機ポリリン酸は、細菌ストレス応答の重要な要素です。しかし、細菌中のpolyPを抽出して測定するための古い方法は複雑で労働集約的です。この技術の主な利点は、さまざまな細菌種におけるポリPレベルの迅速、敏感、および安価な定量化を可能にすることです。この手順は、私の研究室の学部生であるアーヤ・ポクラルによって実証されます。まず、一晩で37°Cでシスチンを含まないリンゴ酸菌の尿酸菌を成長させます。遠心この一晩培養物の1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで、合計50〜100マイクログラムの細胞タンパク質を得るのに十分な細胞を収穫する。細胞ペレットから上澄み液を完全に取り出し、250マイクロリットルのGITCライシスバッファーを加え、ボルテックスで再中断します。細胞をライスするために摂氏95度で10分間インキュベートします。ライセートを摂氏80度で保存します。まず、GITCのリシスバッファーに1ミリリットル当たり0、1、2、4ミリグラムを含むBSA規格を調製します。アリコート5マイクロリットルの解凍、よく混合された細胞ライセート、および5マイクロリットルのBSA標準は、明確な96ウェルプレートでウェルを分離する。ブラッドフォード試薬195マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートリーダーで595ナノメートルで吸光度を測定します。原稿に概説されているBSA標準曲線と比較して、各ウェルのタンパク質量を計算します。各サンプルのタンパク質の総量を求めるには、結果の値に05を掛けます。ポリリン酸抽出を開始するには、各GITC lysedサンプルに95%エタノールの250マイクロリットルを加え、渦を混ぜ合わせます。この混合物を1.5ミリリットルの遠心管に入れたシリカ膜スピンカラムにピペットする。遠心分離機は16、100gで30秒間。流れを捨て、トリス塩酸塩、塩化ナトリウム、EDTA、およびエタノール混合物の750マイクロリットルを加えます。16で遠心分離機、30秒間100 gs。流れを捨て、スピンカラムを16、100 gsで2分間遠心分離します。カラムを清潔な1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに入れる。50ミリモルpH 8トリス塩酸塩の150マイクロリットルを追加し、5分間室温でインキュベートします。8,000gで2分間遠心分離してポリPを溶出する。50ミリモルpH 8トリス塩酸塩で0、5、50、または200マイクロモルリン酸カリウムを含む標準を準備することによって開始します。アリコート 100 マイクロリットルの各リン酸塩標準と 100 マイクロリットルの抽出された polyP サンプルを、クリアな 96 ウェル プレートの別々のウェルにします。サンプルごとに、30マイクロリットルの5X ScPPX反応バッファー、19マイクロリットルの水、および精製されたScPPXの1マイクロリットルを含むマスターミックスを準備します。そして、摂氏37度で15分間インキュベートします。検出日に、検出溶液ベース9.12ミリリットルで1モルアスコルビン酸88ミリリットルを混合して検出液の新しい作業ストックを調製し、使用前に室温に来るようにします。96ウェルプレートの各サンプルと標準に50マイクロリットルの検出溶液を追加します。色の発生を可能にするために、室温でプレートを約2分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して882ナノメートルで吸光度を測定し、リン酸カリウム標準曲線と比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。次に、リン酸濃度を各細胞のリセート中のポリP由来リン酸のナノモルに変換し、原稿に記載されているように細胞内のポリP含有量を全細胞タンパク質に正常化する。野生型大腸菌は、グラム陰性細菌であり、LBで増殖し、ポリPを産生しなかった。しかし、MOPSで増殖すると、総タンパク質の1ミリグラムあたり約192ナノモルポリPを産生した。ポリPキナーゼを欠く大腸菌デルタppk変異体は、いずれの媒体でもポリPを産生しなかった。エキソポリホスファターゼを欠くデルタppx変異体は、野生型とほぼ同じ量のpolyPを産生した。そして、リン酸輸送に欠陥があるデルタ・フォB突然変異体は、野生型よりも有意に少ないポリPを産生した。野生型L.reuteriは、MEIC培地で一晩成長したグラム陽性細菌で、総タンパク質の1ミリグラムあたり約51ナノモルポリPを蓄積した。PolyPキナーゼを欠いたL.reuteri ppk1ヌル突然変異体は、この量の半分以下を含んでいた。ppk1ヌル変異体におけるこのポリPの存在は、おそらく第2のポリPキナーゼを含むL.reuteriによるものである。マイコバクテリウムスメグマティス株SMR5は、エタノールの不在時にハートマンス・ド・ボン培地で増殖し、全タンパク質の1ミリグラム当たり約141ナノモルポリPを蓄積した。エタノール処理の結果、3倍の増加が生じる。この手順に従って、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、polyP鎖長の差を評価することができる。この手順を試みる際には、よくある間違いを避けてください。マイクロタイタープレートウェルに泡を入れないようにし、カラムからマイクロフュージチューブに切り替えるときにサンプルを適切なチューブに移すので注意してください。GITCや強酸での作業は危険であり、この手順を実行している間は常に適切な保護具を着用する必要があることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

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腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス<em&gt; S.ネズミチフス菌</em&gt;バクテリア

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

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蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

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生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

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MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

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ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法<em&gt;インビトロ</em好気的に成長する細菌の&gt;感受性試験

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

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細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

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