Name: assaying for inorganic polyphosphate in bacteria
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00
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Este projecto foi apoiado por Universidade de Alabama em Birmingham, departamento de microbiologia inicialização fundos e NIH grant R35GM124590 (MJG) e NIH grant R01AI121364 (FW).

1. purificação do fermento Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Transforme a tensão de superexpressão de proteínas Escherichia coli BL21(DE3)31 com plasmídeo pScPPX26 por eletroporação32 ou transformação química33.</li>
	<li>Inocular 1 L de caldo lisogenia (LB) contendo 100 µ g ampicilina de-1 de mL em um frasco de 2 L unbaffled com uma única colônia de BL21(DE3) contendo pScPPX2 e incubar dur...

O protocolo descrito aqui simplifica e acelera a quantificação dos níveis de pólipo em diversas bactérias, com um conjunto típico de 24 amostras tomar cerca de 1,5 h para processar totalmente. Isto permite a rápida seleção de amostras e análise de bibliotecas mutantes e simplifica experimentos cinéticos medindo o acúmulo de pólipo ao longo do tempo. Demonstrámos que o protocolo funciona de forma eficaz aos representantes de três filos diferentes: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, que são famoso...

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um biopolímero linear de unidades phosphoanhydride-lig fosfato que é encontrado em todos os domínios da vida1,2,3. Em diversas bactérias, pólipo é essencial para a resposta ao estresse, motilidade, formação de biofilmes, controlo do ciclo celular, resistência aos antibióticos e virulência4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudos de metabolismo de pólipo em bactérias, portanto, têm o potencial de produzir insights fundamentais sobre a capacidade das bactérias que causam a doença e prosperam em ambientes diversos. Em muitos casos, no entanto, os métodos disponíveis para quantificação de pólipo em células bacterianas são um fator limitante nestes estudos.
Existem vários métodos atualmente usados para medir os níveis de pólipo em materiais biológicos. Esses métodos normalmente envolvem duas etapas distintas: extração de pólipo e quantificar o pólipo presentes nesses extratos. O método padrão ouro atual, desenvolvido para a levedura Saccharomyces cerevisiae por Bru e colegas12, extractos de pólipo juntamente com DNA e RNA usando fenol e clorofórmio, seguido de precipitação do álcool etílico, tratamento com desoxirribonuclease (DNase) e ribonuclease (RNase) e a digestão do pólipo purificada resultante com S. cerevisiae pólipo-degradante enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 ao rendimento livre de fosfato, que é em seguida quantificado usando um ensaio colorimétrico baseado em verde malaquita. Este procedimento é altamente quantitativo mas trabalhoso, limitando o número de amostras que podem ser processados em uma única experiência e não é otimizado para amostras bacterianas. Outros relataram extraindo pólipo de uma variedade de células e tecidos usando esferas de sílica ("glassmilk") ou sílica membrana colunas6,14,15,16,17, 18. Esses métodos não eficientemente extrair cadeia curta pólipo (menos de 60 unidades de fosfato)12,14,15, embora isso seja menos preocupante para as bactérias, que são pensados geralmente para sintetizar principalmente Pólipo de cadeia longa3. Antigos métodos de extração de pólipo usando ácidos fortes19,20 são não mais amplamente utilizados, desde que o pólipo é instável sob condições ácidas12.
Há também uma variedade de métodos relatados para quantificação de pólipo. Entre as mais comuns é ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), um corante fluorescente mais normalmente usado para manchar o DNA. Complexos de DAPI-pólipo tem maxima de excitação e emissão de fluorescência diferentes de DAPI-DNA complexos21,22, mas há considerável interferência de outros componentes celulares, incluindo o RNA, nucleotídeos e inositol fosfatos de12,15,16,23, reduzindo a especificidade e a sensibilidade das medições de pólipo feito usando este método. Alternativamente, o pólipo e difosfato de adenosina (ADP) podem ser convertidas em adenosina trifosfato (ATP) usando purificada Escherichia coli quinase pólipo (PPK) e o ATP resultante quantificados usando luciferase14,17 ,18. Isto permite a detecção de pequenas quantidades de pólipo, mas requer duas etapas de reação enzimática e luciferina e ADP muito puro, que são reagentes caros. ScPPX especificamente digere pólipo em fosfato livre6,12,13,,24, que pode ser detectada usando métodos mais simples, mas ScPPX é inibido por DNA e RNA12, tratamento de DNase e RNase necessária de pólipo contendo extratos. PPK nem ScPPX estão disponíveis comercialmente, e purificação de PPK é relativamente complexo25,26.
Pólipo no lisados celulares ou extratos também pode ser visualizado em gel de poliacrilamida por DAPI negativo coloração27,28,29,30, um método que permite a avaliação do comprimento da corrente, mas é baixo rendimento e mal quantitativa.
Agora, nós relatamos um ensaio rápido, barato e de rendimento médio pólipo que permite rápida quantificação de pólipo níveis em diversas espécies bacterianas. Este método começa por lise de células bacterianas a 95 ° C, em 4 M guanidina isotiocianato (GITC)14 para inactivar fosfatases celulares, seguidos de uma extração de coluna de membrana de sílica otimizada para processamento rápido de amostras múltiplas. O extrato contendo pólipo resultante é então digerido com um grande excesso de ScPPX, eliminando a necessidade de tratamento de DNase e RNase. Nós incluímos um protocolo para a purificação de afinidade de níquel simples de quantidades de mg de ScPPX. Finalmente, fosfato livre derivado de pólipo é quantificado com um ensaio colorimétrico simples, sensível, à base de ácido ascórbico24 e normalizado a proteína celular total. Este método simplifica a medição de pólipo em células bacterianas, e vamos mostrar seu uso com espécies representativas de bactérias Gram-negativas, bactérias gram-positivas e micobactérias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pScPPX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112877</td>
			<td>available to academic and other non-profit institutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-2</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP176025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>H-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250500</td>
			<td>for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6070106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI88700</td>
			<td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 120 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-120</td>
			<td>other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap chelating HP column</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17040901</td>
			<td>any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC415611000</td>
			<td>for charging HiTrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 &#181;m pore size cellulose acetate syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-302-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667B</td>
			<td>other dialysis membranes with MWCO &#60; 30,000 Da should also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>for adjusting the pH of Tris-buffered solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS medium mixture</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td>E. coli growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic potassium phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0886-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M113-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine isothiocyanate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP221-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (protease-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear flat bottom 96-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td>any clear 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan M1000 Infinite plate reader</td>
			<td>Tecan, Inc.</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica membrane spin columns</td>
			<td>Epoch Life Science</td>
			<td>1910-050/250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9580154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antimony potassium tartrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1088922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 N sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1376630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC401471000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying for inorganic polyphosphate in bacteria

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um polímero biológico encontrado nas células de todos os domínios da vida e é necessário para a virulência e resposta ao estresse em muitas bactérias. Há uma variedade de métodos para quantificação de pólipo em materiais biológicos, muitos dos quais são trabalhosos ou insensível, limitando sua utilidade. Apresentamos aqui um método simplificado para quantificação de pólipo em bactérias, usando uma extração de coluna de membrana de silicone otimizada para processamento rápido de várias amostras, digestão do pólipo com o pólipo específicas exopolyphosphatase ScPPX e a detecção do fosfato livre resultante com um ensaio colorimétrico sensível à base de ácido ascórbico. Este procedimento é simples, barato e permite a quantificação confiável pólipo em diversas espécies bacterianas. Apresentamos a quantificação de pólipo representativa de bactéria Gram-negativa (Escherichia coli), bactéria Gram-positivas de ácido lático (Lactobacillus reuteri) e as espécies de micobactérias (Mycobacterium smegmatis). Nós também incluímos um protocolo simples para a purificação de afinidade niquelar de quantidades de mg de ScPPX, que não está atualmente disponível comercialmente.

As principais etapas do protocolo são feito de forma simplificada na Figura 1o diagrama elabore.
Para demonstrar o uso do presente protocolo com bactérias Gram-negativas, selvagem-tipo e. coli MG165539 foi crescido a fase log de mid LB médio rico a 37 ° C, com agitação (200 rpm), em seguida lavadas e incubadas durante um adicional 2 h em morpholinopropanesulfon...

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Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Nós descrevemos um método simples para a rápida quantificação dos polifosfatos inorgânicos em diversas bactérias, incluindo espécies de micobactérias, Gram-positivas e Gram-negativas.

Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

O polifosfato inorgânico é um elemento-chave na resposta ao estresse bacteriano. Mas os métodos mais antigos para extrair e medir o pólipo em bactérias são complexos e intensivos em mão-de-obra. A principal vantagem desta técnica é que ela permite quantificação rápida, sensível e barata dos níveis de pólipo em uma variedade de diferentes espécies bacterianas.O procedimento será demonstrado por Arya Pokhrel, uma estudante de graduação do meu laboratório. Para começar, cresça bactérias lactobacillus reuteri em meio de indução de enzimas malic sem cistina a 37 graus celsius durante a noite sem tremer. Centrifugar um mililitro desta cultura durante a noite em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para colher células suficientes para produzir um total de 50 a 100 microgramas de proteína celular.Remova o supernascer da pelota celular completamente e adicione 250 microliters gitc lysis buffer e resuspend por vórtice. Incubar a 95 graus celsius por 10 minutos para lise as células. Armazene o lysate a 80 graus celsius.Primeiro, prepare os padrões BSA contendo zero, 1, 2 e 4 miligramas por mililitro de BSA no buffer de lise GITC. Aliquot cinco microliters de lisatos de células bem mistas e cinco microliters de padrões BSA para separar poços em uma placa clara de 96 poços. Adicione 195 microliters de reagente bradford a cada poço e meça absorvância em 595 nanômetros em um leitor de placas.Calcule a quantidade de proteína em cada poço em comparação com a curva padrão BSA, conforme descrito no manuscrito. Para determinar a quantidade total de proteína em cada amostra, multiplique o valor resultante por 05. Para iniciar a extração de polifosfato, adicione 250 microlitadores de 95% de etanol a cada amostra de linfose e vórtice de GITC para misturar.Pipeta esta mistura a uma coluna de rotação de membrana de sílica colocada em um tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 16, 100 g por 30 segundos. Descarte o fluxo através e adicione 750 microlitradores do tris-cloridrato, cloreto de sódio, EDTA e mistura de etanol.Centrífuga a 16, 100 gs por 30 segundos. Descarte o fluxo através e centrifugar a coluna de giro a 16, 100 gs por dois minutos. Coloque a coluna em um tubo de microfuça de 1,5 mililitro limpo.Adicione 150 microlitres de 50 mililitros pH oito tris-cloridrato, e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Elute polyP por centrifugação a 8.000 g por dois minutos. Comece por preparar padrões contendo zero, cinco, 50 ou 200 fosfato de potássio micromolar em 50 mililitros pH oito tris-cloridrato.Alíquota de 100 microlitadores de cada padrão fosfato e 100 microliters de amostras de pólipo extraídas em poços separados de uma placa clara de 96 poços. Prepare uma mistura mestre contendo, por amostra, 30 microliters de 5X ScPPX tampão de reação, 19 microliters de água e um microliter de ScPPX purificado. Adicione 50 microliters da mistura mestre a cada poço da placa de 96 poços.E incubar por 15 minutos a 37 graus celsius. No dia da detecção, prepare um novo estoque de solução de detecção misturando-se a 9,12 mililitros de base de solução de detecção com 88 mililitros de um ácido ascórbico molar, e permita que ele chegue à temperatura ambiente antes do uso. Adicione 50 microliters de solução de detecção a cada amostra e padrões na placa de 96 poços.Para permitir o desenvolvimento de cores, incubar a placa em temperatura ambiente por aproximadamente dois minutos. Use um leitor de placas para medir a absorvância em 882 nanômetros e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão fosfato de potássio. Em seguida, converta as concentrações de fosfato em nanomoles de fosfato derivado de pólipo em cada célula lysate e normalize o teor de pólipo celular em proteína celular total, como descrito no manuscrito.E.coli, uma bactéria gram-negativa, cultivada em LB não produziu pólipo. Mas quando cultivado em MOPS, produziu cerca de 192 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total. Um mutante E.coli delta ppk, que não tem quinase polip, não produziu pólipo em nenhum dos meios.Um mutante delta ppx, que não tem exopolyfosphatase, produziu aproximadamente a mesma quantidade de pólipo que o tipo selvagem. E o mutante delta phoB, que é defeituoso no transporte de fosfato, produziu significativamente menos pólipo do que o tipo selvagem. L.reuteri tipo selvagem, uma bactéria gram-positiva cultivada durante a noite no meio MEIC acumulou cerca de 51 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total.Um mutante nulo L.reuteri ppk1 sem quinase polip continha menos da metade dessa quantidade. Esta presença de pólipo no mutante nulo ppk1 é provavelmente devido a L.reuteri contendo uma segunda quinase polip. Mycobacterium smegmatis strain SMR five, cultivado em Hartmans-de Bont médio na ausência de etanol acumulado cerca de 141 nanomoles pólipos por miligrama de proteína total.Enquanto o tratamento do etanol resultou em um aumento triplo. Após este procedimento, a eletroforese de gel de acrilamida pode ser realizada para avaliar diferenças no comprimento da cadeia de pólipo. Ao tentar este procedimento, evite erros comuns.Lembre-se de evitar obter bolhas em poços de placas de microtáticos, e tenha cuidado para transferir suas amostras para o tubo apropriado ao mudar da coluna para o tubo de microfuge. Não se esqueça que trabalhar com GITC e ácidos fortes pode ser perigoso, e equipamentos de proteção adequados devem ser sempre usados durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Imunologia e Infecção

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

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The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

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